農桿菌轉化法中的“Ti質粒轉化載體系統(tǒng)”的簡介
——一道江蘇高考題的奧秘解讀和拓展

黃建華

（南通大學附屬中學 江蘇南通 226019）

1 試題深藏奧秘

2009年江蘇高考卷的34題以農桿菌轉化法培育轉毒素蛋白基因的植物為背景，考查基因工程的相關知識，其基本過程如圖1所示。

圖1 農桿菌轉化法培育轉Bt毒素蛋白基因的植物

圖1過程采用轉移法，將重組質粒轉入農桿菌，再與Ti質粒重組為共整合載體，然后轉化植物細胞。共整合載體是農桿菌轉化法中Ti質粒轉化載體系統(tǒng)中的一種。這與高中教材介紹的農桿菌轉化法不一樣，人教版高中教材介紹的農桿菌轉化法是將目的基因插入到農桿菌Ti質粒的T－DNA中構成重組質粒，再將重組質粒導入農桿菌，通過農桿菌的轉化作用，將目的基因插入到植物細胞染色體DNA中，其過程如圖2所示。

圖2 人教版教材中所示的農桿菌轉化法

高中教材介紹的僅是農桿菌轉化法的思路，并不是具體操作步驟，而試題將教材中的轉化思路具體為轉化步驟，揭秘了質粒載體系統(tǒng)的構建、結合轉移法轉移質粒等，以期讓教師和學生通曉真實的操作過程，拓寬認知的視野。

2 構建Ti質粒轉化載體系統(tǒng)的原由

2.1 農桿菌Ti質粒的結構特點決定不能用單一載體運載目的基因轉化植物細胞

農桿菌Ti質粒中有T-DNA（包含生長素基因、細胞分裂素基因、冠癭堿合成基因）、冠癭堿代謝基因、復制起始位點、基因，其結構如圖3所示。

圖3 農桿菌Ti質粒結構示意圖

T-DNA的轉移功能與其兩端25 bp的末端重復順序有關，特別是右邊界序列。農桿菌把T-DNA整合到植物細胞核DNA上后，生長素基因和細胞分裂素基因的表達使植物細胞過度分裂、生長轉化為腫瘤；冠癭堿合成基因的表達使瘤細胞合成大量冠癭堿，供農桿菌代謝利用，加速農桿菌的繁殖，這是農桿菌為自己巧妙設計的內共生體系。但在培育轉基因植物時，導入外源生長素基因、細胞分裂素基因會打破內源激素的平衡，阻礙受體植物細胞的脫分化和再分化；導入冠癭堿合成基因、冠癭堿代謝基因會消耗植物細胞的谷氨酸和精氨酸，影響植物細胞的生長。所以設計農桿菌Ti質粒運載目的基因時，應將這些基因去除。農桿菌Ti質粒上沒有大腸桿菌的復制起點和選擇標記基因，目的基因不能在大腸桿菌中保存和復制。并且，農桿菌Ti質粒上一種限制性內切酶的酶切位點有多個，很難找到單一的酶切位點用于插入目的基因。這些因素都決定了Ti質粒不能直接作為運載目的基因的載體，必須要對Ti質粒進行改造，添加大腸桿菌的復制起點、選擇標記基因、多克隆位點后才能作為轉基因植物的載體。T-DNA的轉移需要基因表達產生的12種蛋白激活、協(xié)助，如構建單一載體運載目的基因轉化植物細胞。而基因高達40 kb，會增加載體的體積，降低導入農桿菌成功率。所以，農桿菌轉化法中不采用單一載體運載目的基因轉化植物細胞。

2.2 農桿菌轉化植物細胞的機制為構建Ti質粒轉化載體系統(tǒng)提供了理論基礎

農桿菌轉化植物細胞的機制是：植物細胞分泌乙酰丁香酮（或羥基乙酰丁香酮）誘導Ti質粒上的基因以及農桿菌染色體上的基因等10個基因的表達。這些基因的表達產物共同作用將T-DNA整合到植物細胞染色體DNA中。從農桿菌轉化植物細胞的機制分析，基因的表達產物是成功轉化的必備條件，基因是否與T-DNA在同一質粒上不是必備條件。所以，可在體外構建攜帶目的基因、不攜帶基因的中間載體，農桿菌細胞內的質粒保留基因、去除非必須基因，然后將中間載體轉入農桿菌實現(xiàn)轉化。這為構建質粒轉化載體系統(tǒng)提供了理論基礎。

2.3 大腸桿菌與農桿菌接合高效轉移質粒的特征為中間載體導入農桿菌供了方便

有的大腸桿菌細胞中含有轉移協(xié)助質粒，含有轉移協(xié)助質粒的大腸桿菌與農桿菌接合，能將質粒高效的轉移入到農桿菌中。若大腸桿菌中同時含有中間載體和轉移協(xié)助質粒則采用接合轉移法轉移中間載體，即把大腸桿菌和農桿菌一起培養(yǎng)，大腸桿菌通過與農桿菌的直接接合將中間載體轉入農桿菌中（轉移協(xié)助質粒也一起轉入農桿菌中）。若大腸桿菌中有中間載體、沒有轉移協(xié)助質粒，則采用三親雜交轉移法，即把含有中間載體的大腸桿菌、含有轉移協(xié)助質粒的大腸桿菌、農桿菌混合培養(yǎng)，通過雜交使轉移協(xié)助質粒先轉移到含有中間載體的大腸桿菌中，然后通過與農桿菌結合將中間載體轉入到農桿菌中。這樣就簡化從大腸桿菌中提取質粒導入農桿菌的步驟了，現(xiàn)常用的方法是三親雜交轉移法。

3 Ti質粒轉化載體系統(tǒng)的類型

由兩種或兩種以上的質粒構成的復合型載體稱為載體系統(tǒng)，農桿菌轉化法主要有兩種載體系統(tǒng)：一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。

3.1 一元載體系統(tǒng)

這類載體是中間載體與農桿菌內改造的Ti質粒通過同源重組形成一種復合型載體。農桿菌內改造后的Ti質粒也稱為受體Ti質粒。根據(jù)同源重組序列的不同可分為共整合載體和拼接末端載體（也稱TDNA邊界拼接載體）。

3.1.1 共整合載體

共整合載體系統(tǒng)中的中間載體由E.Coli質粒改造而來，其中含有大腸桿菌的復制原點、細菌的選擇基因、植物選擇標記基因、目的基因、pBR322序列；受體Ti質粒含有農桿菌的復制原點、基因、T-DNA的左右邊界、pBR322序列（位于T-DNA的左右邊界之間）。當中間質粒導入含受體Ti質粒的農桿菌后，中間質粒和受體Ti質粒通過pBR322序列進行同源重組，中間載體整合到受體Ti質粒的T-DNA中形成共整合質粒（圖4）。中間載體不能在農桿菌中復制，不能穩(wěn)定遺傳而消失。共整合質粒既能在農桿菌中復制，又帶有細菌選擇基因，所以含有共整合質粒的農桿菌能在選擇培養(yǎng)基中生長，可以被篩選出來。含共整合質粒的農桿菌細胞中含有T-DNA（目的基因）、基因和基因，所以這樣的農桿菌可用于植物的轉化。

圖4 形成共整合質粒的過程示意圖

3.1.2 拼接末端載體（T-DNA邊界拼接載體）

拼接末端載體的中間載體含有大腸桿菌的復制原點、細菌和選擇基因、T-DNA的右邊界、植物選擇標記基因、目的基因、T-DNA的左邊界內部序列；受體Ti質粒含有農桿菌的復制原點、基因、T-DNA的左邊界內部序列、T-DNA的左邊界。當中間質粒導入含受體Ti質粒的農桿菌后，中間質粒和受體Ti質粒通過T-DNA的左邊界內部序列同源重組，形成拼接末端載體（圖5）。含拼接末端載體的農桿菌含有選擇基因、T-DNA（目的基因）、基因和基因，能在選擇培養(yǎng)基中生長，可用于植物的轉化。

圖5 拼接末端載體的形成示意圖

共整合載體和拼接末端載體系統(tǒng)的中間載體、受體Ti質粒、同源序列不同。共整合載體轉化的植物中帶有重復的pBR322序列，這可能會影響轉化植物中目的基因的穩(wěn)定性，而拼接末端載體不存在這種可能性，所以拼接末端載體的轉化更有效。

3.2 雙元載體系統(tǒng)

雙元載體系統(tǒng)由兩個分別含T-DNA和基因的Ti質粒構成，含T-DNA的Ti質粒稱為微型Ti質粒。微型Ti質粒含大腸桿菌的復制原點、農桿菌的復制原點，細菌選擇基因、完整的T-DNA（帶有目的基因和植物選擇標記基因），含基因的Ti質粒為協(xié)助Ti質粒，如圖6所示。

圖6 雙元載體系統(tǒng)示意圖

最常用的含協(xié)助Ti質粒的農桿菌是農桿菌LBA4404，導入微型Ti質粒的農桿菌LBA4404就具有了轉化植物的能力。雙元載體系統(tǒng)中的2個質粒不含同源序列，分子量較小，體外易操作，不需要進行同源重組，T-DNA較小，轉化效率較高，但雙元載體構建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較差，容易丟失。