周冰蕊， 魏云亮， 梁 婷， 何 生， 馮志偉， 靳 寧， 劉志貞，趙 虹， 侯淑琳， 于保鋒， 解 軍*

(1)山西醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 出生缺陷與細(xì)胞再生山西省重點實驗室；2)山西醫(yī)科大學(xué) 第一醫(yī)院影像科，太原 030001)

腎是人體重要的器官之一，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)平衡、排出代謝廢物等重要的生理學(xué)功能。有研究發(fā)現(xiàn)，成人的腎一天可以過濾近150 L的液體[1]。世界范圍內(nèi)，慢性腎疾病的患病率為5%～13%[2]。隨著我國人口老齡化，以及肥胖、高血壓、糖尿病等疾病發(fā)病率逐年增加，我國腎疾病的患病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢。慢性腎疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公共健康的問題。腎元(腎單位)作為腎的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，在腎疾病發(fā)病過程中逐漸地且不可逆地減少。腎元由腎小體和腎小管構(gòu)成，腎小體可將流經(jīng)它的血液進(jìn)行過濾，形成原尿，通過由多種管腔組成的腎小管系統(tǒng)進(jìn)行重吸收,而最終形成尿液。由于構(gòu)成腎的細(xì)胞類型的多樣性以及腎結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致在體外建立腎元極具挑戰(zhàn)。因此，通過多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化建立腎元,是一種模擬腎早期發(fā)育，建立腎疾病模型，進(jìn)行藥物篩選的新策略。

多能干細(xì)胞是一類具有無限增殖能力和多種分化潛能的細(xì)胞。1998年獲得的第一株人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)[3]和2006年建立的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)[4]都屬于多能干細(xì)胞的范疇。干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化技術(shù)的興起為多種疾病進(jìn)行細(xì)胞治療提供了極具潛力的細(xì)胞來源。目前，已經(jīng)有多個研究小組報道，將多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成為多種類型的細(xì)胞，例如心肌細(xì)胞[5-7]、胰島β細(xì)胞[8-10]、骨骼肌細(xì)胞[11]、神經(jīng)細(xì)胞[12]、肝細(xì)胞[13, 14]和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等[15, 16]。并且，從ES或者iPSC分化得到的細(xì)胞已被用于多種疾病的臨床研究，例如帕金森疾病[17]、 I型糖尿病[18]等。

追溯腎元的細(xì)胞來源，發(fā)現(xiàn)它是來源于原條后段部分的一群細(xì)胞，這群細(xì)胞之后會發(fā)育成為后端中胚層的一部分，隨著發(fā)育的進(jìn)展，形成后腎間葉組織，產(chǎn)生腎的祖細(xì)胞，最終發(fā)育成腎元的各個組成部分。有一些研究小組已經(jīng)可以將小鼠或者人的多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化到腎細(xì)胞。但是，已經(jīng)發(fā)表的一些將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)至腎細(xì)胞的方法具有局限性，例如分化過程中需要使用一些成分不明確的材料(例如小鼠胚胎的脊髓)[19]；或者分化形成不成熟的腎元萌芽結(jié)構(gòu)[19, 20]。本文通過在體外條件下模擬腎的發(fā)育過程，建立了一種體外誘導(dǎo)分化方法，可將人多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(包括人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)逐步誘導(dǎo)成原條、后端中間中胚層、腎的祖細(xì)胞，最終形成腎元結(jié)構(gòu)。此方法分化效率高、穩(wěn)定性好和可重復(fù)性強，可為后期開展研究腎的早期發(fā)育、腎疾病模型構(gòu)建以及藥物篩選等研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

本研究中使用的人胚胎干細(xì)胞從國家干細(xì)胞資源庫獲得，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞購自北京塞貝生物。本試驗的所有流程已經(jīng)通過山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)倫理委員會許可。

1.2 試劑和儀器

主要試劑及耗材：mTesR培養(yǎng)基(85850，加拿大 STEMCELL Technologies公司)、Accutase分散酶(7920，加拿大 STEMCELL Technologies公司)、DMEM/F12培養(yǎng)基(C11330500BT，美國 Gibco公司)、Advanced RPMI1640培養(yǎng)基(12633-012，美國Gibco公司)、Dispase(04942078001，德國Roche公司)、CHIR99021(SML1046,美國 Sigma公司)、Y-27632(72304，加拿大 STEMCELL Technologies公司)、SB431542(S4317，美國 Sigma公司)、FGF9(100-23-500UG，美國PeproTech公司)、基質(zhì)膠(356237，美國Corning公司)、細(xì)胞培養(yǎng)板(3516，美國Corning公司)、RNA提取試劑Tirzol(15596026，美國Invitrogen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A，日本Takara公司)、熒光定量試劑盒(RR820A,日本Takara公司)。免疫熒光染色所用的抗體：NANOG(4903 S, 美國Cell Signaling Technology公司)、OCT4(75463 S,美國Cell Signaling Technology公司)、T(sc-166962，美國Santa Crue Biotechnology公司)、TBX6(SC-517027，美國Santa Crue Biotechnology公司)、WT1(sc-7385，美國Santa Crue Biotechnology公司)、HOXD11(18734-1-AP，美國Proteintech公司)、SIX2(11562-1-AP，美國Proteintech公司)、CDH1(610181，美國BD Biosciences公司)、PODXL(AF1658，美國R&D Systems公司)、SALL1(PP-K9814-00，日本Perseus Proteomics Inc公司)、LTL(FL-1321，美國vector laboratories公司)、DAPI(ab104139，英國Abcam公司)。試驗所用二抗均購自美國Thermo Fisher公司。

主要儀器包括：CO2培養(yǎng)箱(Eppendorff公司，型號：CellXpert C170)、生物安全柜(海爾，HR1500-IIA2-X)、離心機(Eppendorff公司，型號5702R)、熒光倒置相差顯微鏡(尼康，型號Ti2-U)、PCR儀器(Thermo Fisher，型號QuantStudio3)、激光共聚焦顯微鏡(Olympus，型號FV1000)、流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，型號BD FACSCelesta)。

1.3 干細(xì)胞維持培養(yǎng)

將人胚胎干細(xì)胞或者人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在包被過基質(zhì)膠的細(xì)胞培養(yǎng)板中置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，使用mTesR培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達(dá)到80%時，嚴(yán)格按照說明書使用分散酶(dispase)進(jìn)行消化處理，并按照1∶10進(jìn)行傳代。

1.4 腎的分化

將生長狀態(tài)良好的干細(xì)胞用Accutase分散酶進(jìn)行消化，制備成單細(xì)胞懸液后，加入10 μmol/L Y27632，并按照1.5～2.0×104/cm2細(xì)胞密度接種細(xì)胞。在5% CO2培養(yǎng)箱中以37℃培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。待細(xì)胞長到50%密度時(分化第0 d)，在分化培養(yǎng)液Advanced RPMI中加入WNT信號通路激活劑CHIR-99021(10 μmol/L)和TGF-β信號通路抑制劑SB431542(1 μmol/L)，每天換液。96 h后(分化第4 d)，使用分化培養(yǎng)液Advanced RPMI，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每天換液。分化第7 d，在分化培養(yǎng)液Advanced RPMI中加入50 ng/mL的FGF9，培養(yǎng)48 h，每天換液。分化第9 d在分化培養(yǎng)液Advanced RPMI中加入50 ng/mL的FGF9和3 μmol/L CHIR-99021。分化到第11 d時，將細(xì)胞換至Advanced RPMI中加入50 ng/mL的FGF9繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。

1.5 細(xì)胞免疫熒光檢測

將細(xì)胞用4 %多聚甲醛進(jìn)行固定，10 min后棄掉多聚甲醛溶液，加入封閉液室溫30 min進(jìn)行封閉處理。加入稀釋后的一抗，放置在搖床上4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次，加入稀釋后的二抗置于搖床上，室溫2 h。用PBS清洗3次，滴加DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫避光放置5 min。加入防熒光猝滅封片劑進(jìn)行封片。待片子干燥后，使用熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.6 細(xì)胞生物標(biāo)記物基因表達(dá)檢測

嚴(yán)格參照RNA提取試劑Trizol說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取。使用核酸濃度測定儀器檢測提取的RNA濃度及純度。用Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TaKaRa的熒光定量試劑盒對目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。目的基因引物序列見Table 1。引物委托上海生工股份有限公司合成。

Table 1 Primer list for qPCR

1.7 腎的祖細(xì)胞流式細(xì)胞檢測

將分化至第10 d處于腎的祖細(xì)胞階段的細(xì)胞，用Accutase分散酶于 37 ℃消化處理5 min，以制備成單細(xì)胞懸液。加入4 %多聚甲醛固定后，用PBS清洗1次，離心去上清液后，加入稀釋好的腎的祖細(xì)胞標(biāo)志物SIX2和SALL1室溫孵育30 min。用PBS清洗1次后，離心去上清液，加入稀釋后的二抗室溫孵育30 min。用PBS清洗1次后，離心去上清液，加入適量PBS，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

本試驗全部統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有試驗進(jìn)行3次或3次以上重復(fù)，使用Graphpad統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 干細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定

光鏡下干細(xì)胞集落呈現(xiàn)不規(guī)則圓形，細(xì)胞緊密排布，邊緣折光率較高。細(xì)胞集落表面光滑平整，無褶皺。通過對干細(xì)胞多能性的生物標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，多能性標(biāo)志物NANOG和OCT4有明顯表達(dá)(Fig.1)。該結(jié)果表明，細(xì)胞狀態(tài)良好，可進(jìn)行下一步的腎體外分化研究。

Fig.1 Stem cell colony morphology and pluripotent markers expression The first picture on the left showed pluripotent stem cell colony under bright field. Pluripotent markers (NANOG and OCT4) were tested by immuno-staining. The immuno-staining pictures were captured by laser scanning confocal microscope. The immuno-staining showed high expression of NANOG and OCT4 in pluripotent stem cells used in this study

2.2 干細(xì)胞定向分化至原條

在分化第一步，即干細(xì)胞從多能態(tài)誘導(dǎo)至原條階段。首先使用不同濃度的WNT信號通路激活劑CHIR99021(5 μmol/L，8 μmol/L，10 μmol/L，12 μmol/L)對多能干細(xì)胞進(jìn)行處理。結(jié)果如Fig.2C顯示，干細(xì)胞在只添加WNT信號通路激活劑CHIR99021的條件下，只有極少數(shù)細(xì)胞分化為原條(T陽性，TBX6陽性)。經(jīng)過篩選，在同時添加WNT信號通路激活劑CHIR99021和TGF-β信號通路抑制劑SB431542處理的條件下，可成功將絕大多數(shù)干細(xì)胞從多能態(tài)誘導(dǎo)分化至原條階段(Fig.2 D)。將分化結(jié)果進(jìn)行橫向比較發(fā)現(xiàn)，CHIR99021(10 μmol/L)聯(lián)合SB431542(1 μmol/L)的原條誘導(dǎo)效果優(yōu)于單獨使用CHIR99021對原條的誘導(dǎo)(Fig.2B-D)。熒光定量PCR結(jié)果顯示(Fig.2E)，原條的生物標(biāo)志物T和TBX6在分化至第4 d時，基因表達(dá)量最高。綜上所述，多能干細(xì)胞在CHIR99021和SB431542的作用下，第4 d時，已經(jīng)誘導(dǎo)分化至原條狀態(tài)，且在所有測試條件中誘導(dǎo)效果最佳。

Fig.2 Inducing pluripotent stem cell into primitive streak (A) Schematic of the kidney differentiation in first four days. (B) The gene expression of primitive streak markers under different conditions at day 4 (CHIR99021 of 5 μmol/L, 8 μmol/L, 10 μmol/L, 12 μmol/L, and 10 μmol/L CHIR99021 with 1 μmol/L SB431542). (C) Immunol staining of T and TBX6 under CHIR99021 concentration gradient (5 μmol/L, 8 μmol/L, 10 μmol/L, 12 μmol/L) at day 4. (D) Immunol staining of T and TBX6 under combination condition of CHIR99021(10 μmol/L) and SB431542(1 μmol/L) in hES and hiPSC. (E) Time course analysis of gene expression of primitive steak markers (T and TBX6) from day 0 to day 9. The data were analyzed using GraphPad Prism version 8.0 and one-way ANOVA. *P < 0.05，****P < 0.0001

2.3 原條定向分化至中間中胚層

分化至第7 d，對中間中胚層的細(xì)胞標(biāo)記物HOXD11和WT1進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果如Fig.3B所示，HOXD11和WT1在分化第7 d的細(xì)胞中高表達(dá)。Fig.3為中間中胚層的標(biāo)記物HOXD11，WT1和OSR1的基因表達(dá)水平，在分化至第7 d時顯著增加(P< 0.0001)。表明細(xì)胞分化在第7 d時已經(jīng)處于中間中胚層狀態(tài)。

Fig.3 Deriving intermediate mesoderm from primitive streak (A) Schematic of kidney differentiation between day 4 to day 7. (B) Immunol staining of intermediate mesoderm markers (HOXD11 and WT1) at day 7 in hES and hiPSC. (C) Time course analysis of gene expression of intermediate mesoderm markers (HOXD11, WT1 and OSR1) from day 0 to day 9. The data were analyzed using GraphPad Prism version 8.0 and one-way ANOVA. ***P < 0.001，****P < 0.0001

2.4 腎的祖細(xì)胞的獲得

分化第7 d到分化第9 d(Fig.4A)，在FGF9的作用下細(xì)胞由中間中胚層進(jìn)一步分化至腎的祖細(xì)胞階段。如Fig.4B免疫熒光染色結(jié)果所示，分化至第9 d，腎的祖細(xì)胞標(biāo)記物SIX2和SALL1表達(dá)，第10 d，SIX2和SALL1表達(dá)增多，到第12 d，SIX2和SALL1的表達(dá)明顯減弱，甚至消失。正如Fig.4C熒光定量PCR所示，SIX2、SALL1和OSR1的基因表達(dá)在第9 d時，也顯著增加(P< 0.0001)。表明體外分化至第9 d時，細(xì)胞已經(jīng)處于腎的祖細(xì)胞階段。本文將分化至第10 d的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。如Fig.4 D所示，hES和hiPSC來源的腎祖細(xì)胞SIX2和SALL1雙陽性的細(xì)胞，占比分別為61.9%和51.5%。

Fig.4 Differentiation into kidney progenitor cells (A) Schematic of kidney differentiation between day 7 to day 9. (B) Immunol staining of nephron progenitor markers: SIX2 and SALL1 at day 9, day 10 and day 12. (C) Time course analysis of gene expression of nephron progenitor markers (SIX2, SALL1 and PAX2) from day 0 to day 9. The data were analyzed using GraphPad Prism version 8.0 and one-way ANOVA. *P < 0.05, ****P < 0.0001. (D) FACS analysis of nephron progenitors in hES and hiPSC

2.5 腎單位的結(jié)構(gòu)鑒定

結(jié)果如Fig.5A所示，分化至第21 d光鏡下可觀察到三維的腎單位結(jié)構(gòu)。進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果如Fig.5B所示。本文獲得的結(jié)構(gòu)中包含近端小管(LTL陽性)、遠(yuǎn)端小管(CDH1陽性)以及構(gòu)成的腎小球的足細(xì)胞(PODXL陽性)。

Fig.5 Bright field and structure validation of kidney nephron (A) Bright field picture of nephron structure at day 21. (B) Immunol staining of nephron structure at day 21. CDH1 is the marker of distal tubule. PODXL is the marker of podocyte. LTL is the marker of proximal tubule

3 討論

本文建立了一種將人多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成為腎元結(jié)構(gòu)的方法。分化得到的三維結(jié)構(gòu)中包含腎元的基本結(jié)構(gòu)，例如足細(xì)胞構(gòu)成的腎小球，以及由近端小管和遠(yuǎn)端小管構(gòu)成的腎小管結(jié)構(gòu)。

3.1 從多能干細(xì)胞建立后端原條

Ramzy等[18]和Taguchi等[19]使用WNT信號通路激活劑CHIR99021，從而激活β-聯(lián)蛋白信號通路，將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)至原條階段。然而，經(jīng)過多次試驗，本文用不同濃度的CHIR99021(5 μmol/L，8 μmol/L，10 μmol/L，12 μmol/L)處理，表達(dá)原條生物標(biāo)記T和MixL1的細(xì)胞比例較低，最終導(dǎo)致腎的分化失敗。通過篩選，本文發(fā)現(xiàn)，同時激活WNT信號通路和抑制TGF-β信號通路，能將人多能干細(xì)胞高效地誘導(dǎo)至原條階段。

3.2 從后端原條建立后端中間中胚層

Takasato 等[20]建立的腎分化方法中，需要對原條階段的細(xì)胞添加Activin A來誘導(dǎo)其分化成為中間中胚層。然而，在本文的體系中，多能干細(xì)胞誘導(dǎo)至原條后，在不添加任何誘導(dǎo)因子的情況下，原條可以自發(fā)分化到中間中胚層。表明用本分化方法獲得的T和MixL1雙陽性的原條細(xì)胞，其分化命運已經(jīng)被決定，可以自發(fā)分化成為中間中胚層。

3.3 生成腎的祖細(xì)胞

FGF9被用來誘導(dǎo)中間中胚層的細(xì)胞繼續(xù)向腎的祖細(xì)胞分化。與之前發(fā)表的一些分化方法：例如使用小鼠胚胎脊髓[19]或者200 ng/mL的FGF9[21]相比，本文使用成分明確的較低劑量的FGF9(50 ng/mL)。本文建立的分化方法，適用于胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的腎定向誘導(dǎo)分化。在人胚胎干細(xì)胞中的分化效率可以達(dá)到61.9%，而在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中分化效率達(dá)到51.5%。

3.4 腎元結(jié)構(gòu)

腎是一種復(fù)雜的器官，包含多種細(xì)胞和結(jié)構(gòu)。多樣的細(xì)胞類型是其完成復(fù)雜生理功能的基礎(chǔ)。本文使用人多能干細(xì)胞為初始材料，經(jīng)過定向誘導(dǎo)分化，在光鏡下能明顯可見簇狀的三維立體的腎元結(jié)構(gòu)。免疫熒光標(biāo)記的結(jié)果顯示，這些結(jié)構(gòu)中包含構(gòu)成腎小球的祖細(xì)胞(PODXL陽性)、近端小管(LTL陽性)和遠(yuǎn)端小管(CDH1陽性)等腎的結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，本體外誘導(dǎo)分化方法可以成功將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為腎元。

本研究結(jié)果表明，使用不同的人多能干細(xì)胞并且進(jìn)行多次分化實驗，本方法均能將細(xì)胞從多能態(tài)誘導(dǎo)分化成腎的細(xì)胞類型，并形成腎元結(jié)構(gòu)。且具有較高的分化效率和穩(wěn)定的分化結(jié)果。本分化平臺可以用于后續(xù)研究腎的早期發(fā)育機制和建立腎疾病模型。