張順榮 莫娟梅 甘芷川 李瓊謙 李嬋娟 鄭 盼 梁 瀟 唐偉智 唐 璜 蘇 運 文海迪 黃振飛

(1 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，南寧，530201；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧，530200)

雖然近年來肺癌的診斷水平及治療效果取得長足進展，但總體5年生存率仍僅有15%左右[1]。近些年來，肺癌一直是世界范圍發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康和生命[2]。隨著免疫治療在腫瘤領(lǐng)域接連取得重大突破，從免疫角度探索新的肺癌治療模式越來越受到重視。作為腫瘤免疫細胞浸潤微環(huán)境中優(yōu)勢群體，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated Macrophages，TAMs)通常表現(xiàn)出免疫抑制的M2表型，已經(jīng)證實其能促進腫瘤生長、血管生成、進展、轉(zhuǎn)移和免疫抑制[3-4]。越來越多科研工作者開始重視制定策略來改變TAMs以阻止肺癌的進展，如促進從M2復(fù)極化到M1亞型，或防止基質(zhì)環(huán)境中TAMs的M2極化，這為腫瘤免疫治療提供了一個新靶點。

中醫(yī)藥在我國肺癌治療中扮演著重要角色，現(xiàn)代研究表明中藥單體或復(fù)方均在一定程度上調(diào)節(jié)肺癌免疫微環(huán)境[5-7]。腫瘤的發(fā)生、進展、治療及預(yù)后的全程中通常伴隨著正虛表現(xiàn)，故“扶正”為主的治則治法應(yīng)貫穿肺癌診治的全過程[8]。從免疫微環(huán)境角度觀察“扶正法”治療腫瘤的病機具有重要的臨床意義。

壯醫(yī)藥歸屬中醫(yī)藥范疇，在肺癌防治中扮演重要角色。目前，關(guān)于壯藥復(fù)方作用TAMs發(fā)揮抗腫瘤的研究尚少。我們前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)壯藥扶正方能夠提高肺癌患者生命質(zhì)量、增強患者免疫力、延長生存期[9]。為進一步探討壯藥扶正方治療肺癌的可能機制，本研究采用上清共培養(yǎng)模型模擬腫瘤微環(huán)境，觀察壯藥扶正方含藥血清對共培養(yǎng)體系A(chǔ)549細胞生物學(xué)行為的影響，探討其抗腫瘤的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物(生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002)，于SPF級動物房進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度20～24 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)飼料和水喂養(yǎng)。本實驗過程符合中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定，且通過廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院動物倫理委員會審查(倫理審批號：【2021】-041)。人急性白血病單核細胞株THP-1和人肺癌細胞株A549均購自深圳銳奧博生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 五指毛桃飲片、黃花倒水蓮飲片、黃芩飲片均購自廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院民族藥房，且經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院教研室鑒定為地道藥材，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并由廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院民族藥制劑室制成濃縮浸膏，1 g浸膏相當(dāng)于生藥量6 g，灌裝滅菌，置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑：RT-PCR試劑盒(康為世紀(jì)，貨號：CW2677)；白細胞介素-10[愛必信(上海)生物有限公司，貨號：abs551807]；白細胞介素-12[愛必信(上海)生物有限公司，貨號：abs510012]、MTT試劑盒(Sigma公司，美國，貨號：M2128)；Trans-well共培養(yǎng)小室(Corning公司，美國，貨號：3422)。主要儀器：CIM-plate16細胞遷移檢測板[艾森生物(杭州)有限公司，型號：05665817001]；多功能酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國，型號：SynergyHTX)；臺式冷凍離心機(SIGMA公司，德國，型號：TGL-16gR)；熒光PCR儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，美國，型號：CFX96 Touch]；實時細胞分析儀(ACEA Biosciences公司，美國，型號：RTCA DP)。

1.1.4 含藥血清制備 依據(jù)隨機數(shù)字表將SD大鼠分成4組，分別為生理鹽水對照組、壯藥扶正方高劑量組4.474 g、壯藥扶正方中劑量組2.237 g、壯藥扶正方低劑量組1.119 g，每組10只。壯藥扶正方組灌胃2 mL/次，2次/d(9am，4pm)，連續(xù)7 d?？瞻讓φ战M灌服等量生理鹽水。末次給藥后1 h行腹主動脈采血，同組大鼠的血液混勻后合裝，56 ℃水浴30 min后取出，放入4 ℃冰箱過夜，凝固后經(jīng)離心(重力加速度17 000×g)，15 min后收集上清，0.22 μm濾膜過濾除菌，標(biāo)記，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測含藥血清對TAMs細胞增殖的影響 參考文獻[10-11]建立TAMs體外模型，取對數(shù)生長期細胞(活力>95%)以1×106細胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)置6孔，同時設(shè)3個復(fù)孔，每孔200 μL，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)細胞24 h處于G0期。然后用各組含藥血清培養(yǎng)細胞24 h、48 h、72 h后更換培養(yǎng)液，按MTT試劑盒操作完成實驗，采用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度(A)值。根據(jù)公式計算每組平均抑制率(IR)，并繪制細胞抑制率曲線IR=1-A藥物組均值/A對照組均值×100%。

1.2.2 實時定量PCR檢測含藥血清干預(yù)TAMs后白細胞介素-10、白細胞介素-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及CD206基因表達 采用Trizol法分別提取各組含藥血清干預(yù)后的細胞各個時段總RNA，測定其濃度及純度，再將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在qPCR儀上進行白細胞介素-10、白細胞介素-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶及CD206基因檢測，所需引物序列見表1。

表1 熒光定量qPCR引物序列

1.2.3 ELISA檢測細胞因子表達 按照ELISA試劑盒說明書操作檢測細胞因子白細胞介素-10、白細胞介素-12含量，采用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞因子的質(zhì)量濃度。

1.2.4 MTT法檢測上清共培養(yǎng)體系中A549細胞增殖水平 將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的肺癌A549細胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整濃度為1×106細胞/L接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h貼壁。更換培養(yǎng)液，分為5組：空白對照組(A549)、共培養(yǎng)組(A549+TAMs)、壯藥扶正方低、中、高劑量組(A549+TAMs+壯藥扶正方含藥血清低、中、高)。處理24、48、72 h后每孔加入MTT工作液20 μL，置于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)孵育4 h，離心(重力加速度17 000×g)吸去上清液，每孔加入150 μLDMSO，搖床低速振蕩10 min。采用多功能酶標(biāo)儀測各孔的吸光度(OD)值，并計算抑制率。

1.2.5 實時細胞分析技術(shù)(RTCA)檢測含藥血清對上清共培養(yǎng)體系中A549細胞遷移的影響 參照文獻[12]，在CIM-Plate 16孔板的下板中加入含血清培養(yǎng)基165 μL，同時快速組裝上板并于上板內(nèi)加入無血清培養(yǎng)基30 μL，并將其放入培養(yǎng)箱平衡30 min測基線。胰酶消化肺癌A549細胞，調(diào)整濃度為1×106細胞/L，每孔加入100 μL，6 h貼壁后吸去同量上層培養(yǎng)液，空白對照組加入無血清培養(yǎng)基，共培養(yǎng)組加入TAMs上清，壯藥扶正方各劑量組加入不同壯藥扶正方藥物濃度處理TAMs上清各100 μL。每組設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，RTCA-DP儀器實時監(jiān)測72 h。

1.2.6 Transwell實驗檢測上清共培養(yǎng)體系中A549細胞侵襲能力 將基質(zhì)膠(Matrigel)在4 ℃提前1 d融化，室溫過夜液化稀釋為工作液，加入Transwell小室底部膜上室，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min膠化Matrigel；空白對照組、共培養(yǎng)組、壯藥扶正方低、中、高劑量組按照每孔5×103個的密度接種于上層腔室，在下層培養(yǎng)基中加入空白血清1640培養(yǎng)基。置于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，取出小室，用PBS洗滌1次，70%冰乙醇溶液固定1 h，棄70%乙醇溶液，每孔加入0.1%結(jié)晶紫溶液1 mL，染色30 min后用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)洗3次，晾干。用棉簽小心擦去小室內(nèi)沒有遷移的細胞，在倒置顯微鏡下拍照、計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 壯藥扶正方含藥血清對TAMs細胞增殖活力的影響 與空白對照組比較，壯藥扶正方含藥血清低、中、高劑量組在分別刺激TAMs細胞24 h、48 h、72 h后的OD值均降低，并與刺激時長負相關(guān)(P<0.05，P<0.01)。抑制率(IR)依次升高并與刺激時長正相關(guān)。見表2、圖1。

表2 壯藥扶正方含藥血清對TAMs增殖的影響

圖1 不同劑量壯藥扶正方含藥血清對TAMs增殖的影響

2.2 壯藥扶正方含藥血清干預(yù)TAMs后能夠調(diào)節(jié)其表型改變 與空白對照組比較，壯藥含藥血清處理各劑量組均能下調(diào)M2型標(biāo)志物CD206、白細胞介素-10的mRNA相對表達量(P<0.05，P<0.01)，上調(diào)M1型標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細胞介素-12的mRNA相對表達量(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性；同時各表型基因表達水平具有一定時間依賴性，在48 h時明顯變化。見表3、圖2。結(jié)果表明不同劑量的壯藥扶正方含藥血清能明顯上調(diào)細胞因子白細胞介素-12的表達(P<0.01)，同時下調(diào)白細胞介素-10的表達(P<0.01)。見圖3。

表3 不同劑量的壯藥扶正方含藥血清對TAMs指標(biāo)的影響

圖2 不同用藥時間對TAMs中CD206、白細胞介素-10、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細胞介素-12基因表達的影響

圖3 各組細胞因子白細胞介素-10、白細胞介素-12的表達量比較

2.3 壯藥扶正方含藥血清對上清共培養(yǎng)體系中A549細胞增殖的影響 經(jīng)低、中、高劑量組壯藥扶正方含藥血清處理的TAMs，取不同上清作用A549細胞24 h、48 h、72 h，觀察其增殖情況。與空白對照組比較，共培養(yǎng)組肺癌A549細胞增殖水平增加(P<0.01)；與共培養(yǎng)組比較，含藥血清各劑量組肺癌A549細胞的增殖水平下降(P<0.05)，呈劑量依賴性。見圖4。

圖4 不同劑量的壯藥扶正方含藥血清對上清共培養(yǎng)體系A(chǔ)549細胞增殖的影響

2.4 壯藥扶正方含藥血清對上清共培養(yǎng)體系中A549細胞遷移能力影響 與空白對照組比較，共培養(yǎng)組A549細胞遷移能力明顯增強(P<0.01)；與共培養(yǎng)組比較，壯藥扶正方含藥血清各劑量組A549細胞遷移能力明顯降低，與48 h后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且呈量效關(guān)系(P<0.05)。見圖5。

圖5 壯藥扶正方含藥血清對共培養(yǎng)體系中A549細胞遷移的時效關(guān)系

2.5 壯藥扶正方含藥血清對上清共培養(yǎng)體系中A549細胞侵襲的影響 根據(jù)Transwell實驗可看出，空白對照組穿過小室細胞數(shù)為(286±18)個，共培養(yǎng)組穿過小室細胞數(shù)為(553±24)個，經(jīng)由不同濃度壯藥扶正方含藥血清共培養(yǎng)的TAMs處理后的A549細胞穿過小室的細胞數(shù)為分別為(509±20)個、(318±38)個、(204±24)個。與空白對照組比較，共培養(yǎng)組細胞明顯增多；與共培養(yǎng)組比較，藥物組細胞明顯減少(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見圖6。說明壯藥扶正方含藥血清能夠通過調(diào)節(jié)TAMs表型來抑制A549細胞侵襲。

圖6 壯藥扶正方含藥血清對共培養(yǎng)體系中A549細胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

3 討論

《外證醫(yī)案》云：“正氣虛則成巖?！薄夺t(yī)宗必讀》說：“積之成也，正氣不足而后邪氣踞之。”《靈樞·刺節(jié)真邪》說腫瘤為“虛邪之入于身也深，寒與熱相搏,久留而內(nèi)著”。以上論述均說明“正虛”是引起肺癌發(fā)生的內(nèi)在因素。有研究通過統(tǒng)計學(xué)方法分析肺癌常用中藥頻率，結(jié)果顯示如黃芪、人參等補益藥為治療肺癌的首要核心藥物，說明“扶正”為治法應(yīng)貫穿肺癌治療全程[13]。研究表明，中醫(yī)藥的扶正作用在調(diào)控肺癌免疫微環(huán)境方面發(fā)揮重要作用[14-16]。因此應(yīng)從抗癌中藥(含民族藥)中尋找具有調(diào)控TAMs潛力單體或復(fù)方，為肺癌綜合治療提供新的治療策略。

現(xiàn)代研究表明五指毛桃、黃花倒水蓮、黃芩能夠調(diào)節(jié)腫瘤患者免疫功能，具有一定抗腫瘤作用[17-20]。作為壯藥扶正類藥物，五指毛桃、黃花倒水蓮、黃芩的藥效很多，其化學(xué)成分的研究已經(jīng)比較詳細，但是對其藥理作用的研究雖有涉及，卻欠完備，如對其扶正功效在巨噬細胞介導(dǎo)的腫瘤免疫微環(huán)境研究甚少。本文通過構(gòu)建共培養(yǎng)模型，模擬腫瘤免疫微環(huán)境，進一步研究壯藥扶正方抗腫瘤的作用機制。

本實驗結(jié)果顯示，不同濃度的壯藥扶正方含藥血清可以上調(diào)體外誘導(dǎo)的TAMs中M1型標(biāo)志物，如白細胞介素-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，同時下調(diào)M2型標(biāo)志物，如白細胞介素-10、CD206。在上清共培養(yǎng)系中，共培養(yǎng)組A549細胞明顯增殖，遷移、侵襲作用增強；而經(jīng)藥物處理過的TAMs上清能夠抑制A549細胞增殖，遷移侵襲作用也受抑制。本研究提示，壯藥扶正方可能是通過調(diào)節(jié)TAMs表型影響A549細胞的生物學(xué)行為。但復(fù)方成分復(fù)雜，通過對免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤機制的成分尚不明確，有待進一步研究證實。