王鑄輝，陽曉燕，張行飛，陽國平，黃潔，鄒嬋（.湖南省藥品審評與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，長沙 4003；.中南大學湘雅三醫(yī)院臨床試驗研究中心，長沙 4003）

利伐沙班直接通過抑制凝血因子Ⅹa可中斷凝血瀑布的內(nèi)源性和外源性途徑，抑制凝血酶的產(chǎn)生和血栓形成。目前，利伐沙班是血栓栓塞性疾病推薦的一線用藥[1-5]。與華法林需頻繁監(jiān)測患者國際標準化比值（INR）相比，利伐沙班的治療依從性更好。利伐沙班于2008年在加拿大和歐盟獲得上市批準，2009年在澳大利亞及中國獲批，2011年在美國獲批。本研究旨在評價南京恒生制藥有限公司生產(chǎn)的利伐沙班片與參比制劑在中國健康受試者的生物等效性及安全性，為國內(nèi)利伐沙班仿制藥上市審批提供依據(jù)。

1 材料

利伐沙班片受試制劑（T，規(guī)格：20 mg/片，批號：191201，含量：101.2%，南京恒生制藥有限公司）；利伐沙班片參比制劑（R，商品名：拜瑞妥，規(guī)格：20 mg/片，批號：BJ45597，含量：101.1%，Bayer AG）；利伐沙班（對照品，純度：99.7%，批號：ITM10082849，上海陶素生化科技有限公司）；Rivaroxaban-d4（內(nèi)標，純度：98%，批號：9-JHY-173-5，Toronto Research Chemicals）；甲醇、乙腈、甲酸（Merck 公司）；二甲亞砜（DMSO，國藥集團）；水為超純水。HPLC30-AD超快速液相系統(tǒng)（日本Shimadzu）；AB Sciex API 5500質(zhì)譜儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

入選標準：年齡18～60周歲，男女均可；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）19.0～26.0 kg·m－2，男性受試者體質(zhì)量≥ 50.0 kg，女性受試者體質(zhì)量≥45.0 kg。試驗前簽署知情同意書，并對試驗內(nèi)容、過程及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)有充分了解；志愿者能夠和研究者進行良好的溝通，并且理解和遵守本項研究的各項要求。

排除標準：患有需排除的疾病，包括但不限于心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)（包括個人或家族史遺傳性免疫缺陷）、精神病、代謝異常、惡性腫瘤、淋巴組織增生性疾病等病史且研究者認為目前仍有臨床意義者；有食物、藥物過敏史，尤其對利伐沙班片及輔料中任何成分過敏者；有罕見的遺傳性半乳糖不耐受、Lapp乳糖酶缺乏癥或葡萄糖-半乳糖吸收不良（如喝牛奶腹瀉）者；既往患有任何增加出血性風險或凝血功能障礙疾病者；在服用研究藥物前3 d進食可能影響藥物體內(nèi)代謝的食物者（包括葡萄柚或葡萄柚產(chǎn)品、火龍果、芒果、柚子、橘子等）；試驗前1個月內(nèi)使用過任何抑制或誘導肝臟藥物代謝的藥物者；生命體征異常者（收縮壓＜90 mmHg或＞140 mmHg，舒張壓＜50 mmHg或＞90 mmHg；心率＜50 次·min－1或＞100 次·min－1）或體格檢查、心電圖、實驗室檢查異常有臨床意義者（以臨床醫(yī)師判斷為準）；研究者認為依從性差或者存在不適合參加試驗因素的受試者。

本試驗經(jīng)中南大學湘雅三醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：第20025號），所有受試者均簽署知情同意書。空腹組篩選118例，共有27例健康受試者完成試驗，包括2例女性和25例男性，平均年齡為（25.8±5.21）歲，平均體質(zhì)量為（63.31±7.13）kg，平均BMI為（22.17±1.93）kg·m－2；餐后試驗篩選99例，共有28例健康受試者完成試驗，包括5例女性和23例男性，平均年齡為（24.4±5.37）歲，平均體質(zhì)量為（62.29±7.30）kg，平均BMI為（22.61±2.17）kg·m－2。

2.2 試驗設(shè)計

按照FDA的利伐沙班片生物等效性指南，本試驗在健康成年志愿者中進行單中心、單劑量、隨機、開放、兩制劑、四周期全重復交叉的生物等效性試驗。其中空腹、餐后受試者均為 28 例，受試者按篩選號順序隨機分為兩個給藥序列組（T-R-T-R 組 /R-T-R-T 組），在四周期分別口服20 mg受試制劑T與參比制劑R，清洗期為7 d。給藥方法：空腹或者高脂餐后30 min，240 mL溫水送服。服藥前1 h及服藥后1 h內(nèi)禁止飲水，服藥前禁食至少10 h，服藥后4 h內(nèi)禁食，服藥后4、10 h統(tǒng)一進食標準午餐和晚餐。分別在給藥0時（于給藥前60 min內(nèi)）和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、12、24、36、48 h采血，每次采集約4 mL。血樣采集至EDTA-K2抗凝劑中，混勻后即刻置于冰浴中暫存，1 h內(nèi)將血樣在約4℃低溫條件下離心（1700 g）約10 min，取分離后的血漿至檢測管中和備份管中，離心后的血漿樣品在采血后2 h內(nèi)置于－20℃低溫冰箱，并于每周期采血結(jié)束后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱保存，直至樣品轉(zhuǎn)運。

2.3 血漿樣本處理與測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACE 3 C18-AR（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相 A：0.4%甲酸水溶液（pH 3.2），流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0.00～1.20 min，35%B；1.20～1.30 min，35%～100%B；1.30～1.80 min，100%B；1.80～1.90 min，100%～35%B；1.90～3.00 min，35%B）；流 速：0.6 mL·min－1；柱 溫：40℃；自動進樣器溫度：4℃；進樣量：5.00 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 正離子電噴霧離子化（ESI）；電離模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）掃描模式；離子源噴霧電壓為 5.0 kV，離子源溫度為500℃，入口電壓10 V，碰撞氣9 unit，出口電壓13 V，離子源GS1為50 psi，離子源GS2為55 psi。用于定量分析的離子反應(yīng)為利伐沙班m/z436.2 →145.0，內(nèi)標Rivaroxaban-d4m/z440.3→145.0。

2.3.3 血漿樣品處理 精密移取樣本100 μL（空白樣品和內(nèi)標空白樣品取100 μL空白人血漿）至96 孔板中；加入20 μL內(nèi)標工作液，混勻；加入600 μL乙腈，加蓋96孔板蓋渦旋3 min混勻，3200 g、4℃離心5 min；取400 μL上清液至另一96孔板中，40℃氮氣流吹干；加入200 μL復溶液[0.4%甲酸水溶液（pH3.2）∶0.1%甲酸乙腈（65∶35）]，加蓋96孔板蓋渦旋3 min，即得。

2.4 方法學考察與評價

2.4.1 特異性 取6例受試者的空白血漿，按照“2.3.3”項下方法處理后進樣，血漿內(nèi)源性物質(zhì)的峰面積均小于利伐沙班最低定量下限（LLOQ）（1 ng·mL－1）峰面積的20%，小于內(nèi)標峰面積的5%。結(jié)果表明，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物和內(nèi)標的測定，該方法的特異性良好（見圖1）。

圖1 血漿中分析物和內(nèi)標的典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of analyte and internal standard in plasma

2.4.2 標準曲線與LLOQ 配制標準曲線血漿樣品（1、2、10、50、100、250、400、500 ng·mL－1），按“2.3.3”項下方法操作后進樣分析，建立利伐沙班的標準曲線。以質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度為橫坐標（X，ng·mL－1），利伐沙班與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標（Y），采用加權(quán)回歸法進行回歸，權(quán)重因子為 1/χ2。結(jié)果表明利伐沙班在1～500 ng·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y＝0.402X＋0.0021（R2＝0.9986），LLOQ為1 ng·mL－1。

2.4.3 精密度與回收率 配制利伐沙班LLOQ質(zhì)量濃度（1 ng·mL－1）、低質(zhì)量濃度（LQC，3 ng·mL－1）、中質(zhì)量濃度1（MQC1，20 ng·mL－1）、中質(zhì)量濃度2（MQC2，200 ng·mL－1）、高質(zhì)量濃度（HQC，375 ng·mL－1）的質(zhì)控樣品，每個濃度6份，重復3次，按“2.3.3”項下方法處理后進樣分析，結(jié)果批內(nèi)和批間精密度（RSD）均＜5%，準確度在99.4%～101.8%。用LQC、MQC2、HQC 3個質(zhì)量濃度樣品，比較經(jīng)提取與未經(jīng)提取利伐沙班和內(nèi)標的各自峰面積比值，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的平均提取回收率分別為96.34%、93.45%、92.01%，RSD分別為1.8%、0.30%、0.56%。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 取6例受試者的空白血漿，分別考察LQC、MQC2、HQC 3個質(zhì)量濃度的利伐沙班在基質(zhì)離子存在時色譜峰響應(yīng)和在基質(zhì)離子不存在時色譜峰響應(yīng)的比值。內(nèi)標歸一化基質(zhì)因子為待測物的基質(zhì)效應(yīng)除以內(nèi)標的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果3個質(zhì)量濃度的利伐沙班內(nèi)標歸一化基質(zhì)因子均值分別為100%、100%和101%。

2.4.5 穩(wěn)定性 利伐沙班全血樣品在冰浴條件下放置1 h后離心，穩(wěn)定性良好；利伐沙班血漿樣品在室溫和冷藏下放置24 h、在－30～－10℃至室溫以及－90～－60℃至室溫3次凍融循環(huán)、在－30～－10℃以及－90～－60℃條件下長期冰凍40 d穩(wěn)定性良好；利伐沙班血漿樣品處理過程中在1～9℃條件下放置 24 h穩(wěn)定性良好、處理后樣品1～9℃條件下放置123 h穩(wěn)定性良好。

2.5 藥動學參數(shù)計算及生物等效性判定

藥動學參數(shù)采用非房室模型，使用Phoenix WinNonlin8.0（美國Pharsight公司）軟件和SAS 9.4進行統(tǒng)計分析。主要藥動學參數(shù)AUC0～t、AUC0～∞、Cmax經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行多因素方差分析（ANOVA）、雙單側(cè)t檢驗和90%CI分析。當受試制劑T和參比制劑R藥動學參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后幾何均值比的90%CI均落在80.00%～125.00%，且受試制劑T和參比制劑R個體內(nèi)標準差比值的90%CI上限≤2.5時[6]，則認為兩制劑具有生物等效性。

2.6 血藥濃度-時間曲線

空腹組完成隨機化28例，1例受試者于第一周期給藥前退出，共有27例受試者完成試驗。餐后組完成隨機化28例，1例受試者于第四周期給藥前退出（已完成3周期給藥盒采血），共有27例受試者全部按計劃完成試驗。對完成血樣采集的樣本進行血藥濃度檢測，空腹組和餐后組平均血藥濃度-時間曲線見圖2和圖3。

圖2 空腹服用受試制劑和參比制劑的平均藥時曲線圖Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of 27 subjects after an oral dose of rivaroxaban tablets under fasting condition

圖3 餐后服用受試制劑和參比制劑的平均藥時曲線圖Fig 3 Mean plasma concentration-time curve of 28 subjects after an oral dose of rivaroxaban tablets under fed condition

2.7 藥動學參數(shù)

空腹組27例受試者和餐后組28例受試者均納入藥動學參數(shù)集（PKPS）分析，結(jié)果見表1。

表1 空腹組和餐后組受試者單次口服利伐沙班片受試制劑和參比制劑的藥動學參數(shù)(±s)Tab 1 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in both fasting and fed conditions (±s)

表1 空腹組和餐后組受試者單次口服利伐沙班片受試制劑和參比制劑的藥動學參數(shù)(±s)Tab 1 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in both fasting and fed conditions (±s)

注：*表示tmax采用中位數(shù)（最小值，最大值）的形式描述。Note：*means tmax is described in terms of median（minimum，maximum）.

組別 制劑 tmax/h* Cmax/（ng·mL－1） AUC0～t /（h·ng·mL－1）AUC0～∞/（h·ng·mL－1） t1/2/h空腹組（n＝27） 受試制劑T 1.50（0.50，4.00） 195.28±46.01 1490.58±356.92 1609.00±394.74 10.12±5.88參比制劑R 2.00（0.50，4.00） 197.48±52.63 1439.72±372.20 1538.39±386.49 10.37±6.82餐后組（n＝28） 受試制劑T 2.50（1.00，4.50） 402.05±85.67 2776.66±756.91 2801.41±755.55 4.52±0.95參比制劑R 2.50（0.50，4.50） 394.42±65.29 2728.24±801.16 2760.30±805.05 4.86±1.36

2.8 生物等效性評價

受試制劑T和參比制劑R的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞對數(shù)轉(zhuǎn)換后的幾何均數(shù)比值GMR的90%CI均落在 80.00%～125.00%，雙單側(cè)t檢驗結(jié)果與置信區(qū)間法結(jié)果一致，受試制劑T和參比制劑R個體內(nèi)標準差比值的90%CI上限≤2.5，說明兩制劑在本實驗空腹和餐后給藥條件下具有生物等效性[6]，詳見表 2、3。

表2 空腹口服受試制劑與參比制劑的主要PK參數(shù)生物等效性評價結(jié)果Tab 2 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in fasting condition

表3 餐后口服受試制劑與參比制劑的主要PK參數(shù)生物等效性評價結(jié)果Tab 3 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in fed condition

2.9 安全性評價

空腹組27例受試者全部按計劃完成給藥、采血和安全性評價，并進入安全性分析集。共有12例受試者發(fā)生17例次不良事件。服用受試制劑T期間有5例（18.5%）受試者發(fā)生了7例次不良事件，服用參比制劑R 期間有8例（29.6%）受試者共發(fā)生了10例次不良事件。不良事件為上呼吸道感染、尿白細胞酯酶陽性、潛血陽性、血三酰甘油升高、血尿酸升高，均為輕度不良事件，未進行任何治療，均恢復正常。

餐后試驗 27 例受試者全部按計劃完成給藥和采血，1例受試者完成了3個周期給藥和采血，共有28例受試者進入安全分析集。結(jié)果15例受試者發(fā)生22例次不良事件，其中服用受試制劑T期間有8例（28.6%）受試者發(fā)生了11例次不良事件；服用參比制劑R期間有10例（35.7%）受試者發(fā)生了11例次不良事件。不良事件為上呼吸道感染、咽炎、尿白細胞陽性、尿蛋白檢出、心率升高、血三酰甘油升高、腹瀉。有1例受試者發(fā)生中度不良事件“上呼吸道感染”，采取治療措施后恢復正常。其余均為輕度不良事件，未進行任何治療，均恢復正常。

本試驗研究期間兩藥安全性相近，未發(fā)生嚴重不良事件，故受試者在空腹及餐后給藥條件下口服受試制劑T和參比制劑R 20 mg后臨床安全性良好。

3 討論

利伐沙班能選擇性地阻斷Ⅹa因子的活性位點起到抗凝作用，其血藥濃度的微小變化可能導致血栓或出血，進而危及生命，為窄治療指數(shù)藥物[1-5]。與一般化學藥物相比，窄治療指數(shù)藥物進行生物等效性評價時，應(yīng)采用更嚴格的等效性判定標準，以保證有效性和安全性。FDA在利伐沙班片生物等效性指南中建議，利伐沙班片的生物等效性統(tǒng)計分析應(yīng)采用平均生物等效性ABE法（80%～125%），并比較受試者服用受試制劑T和參比制劑R的個體內(nèi)變異，且兩藥個體內(nèi)變異標準差比值的90%CI上限應(yīng)≤2.5[6-10]。

因此，本次研究采用四周期全重復交叉的設(shè)計，以獲得兩藥的個體內(nèi)變異。個體內(nèi)變異系數(shù)取24%，預計受試制劑與參比制劑藥代參數(shù)均值差異為10%，α＝0.05，β＝0.2（把握度1－β＝80%），利用軟件PASS 11.0進行樣本量計算，計算結(jié)果表明納入不少于26例能夠可靠的進行等效性判斷，考慮脫落，將樣本量定為28例。結(jié)果顯示，本次研究利伐沙班個體內(nèi)變異在14.11%～20.02%，Cmax、AUC0～t和AUC0～∞個體內(nèi)變異標準差比值的90%CI。

本次研究中，與其他文獻中利伐沙班等效性研究結(jié)果相似，利伐沙班在空腹組和餐后組中的部分藥動學參數(shù)（tmax、Cmax、AUC、t1/2）差異較大。餐后組中的tmax、Cmax、AUC較大，可能原因是高脂餐后給藥，會延長藥物的釋放，增大藥物在體內(nèi)的吸收，從而增大藥物在體內(nèi)的暴露。在臨床治療上，該藥動學性質(zhì)可以為劑量調(diào)整提供依據(jù)，t1/2差異較大，可能原因是餐后組PK曲線消除相采樣點數(shù)量較少，藥時曲線不平滑，導致計算出來的t1/2與空腹組相比差異較大，是本次研究的不足之處。如果在餐后組增加18 h和30 h采樣點，就能得到更平滑的消除相曲線。