1-脫氧野尻霉素對高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的血糖和內質網應激通路的影響

周碧蘭，彭電，曾慧，李海剛（.長沙衛(wèi)生職業(yè)學院藥學院，長沙 40600；.長沙醫(yī)學院新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點實驗室，長沙 409）

糖尿病是一種由胰島素分泌或作用缺陷所引起的以高血糖為重要特征的慢性疾病，主要分為1型和2型[1]。近年來，糖尿病患病率逐年增加，并呈現(xiàn)年輕化的趨勢，國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計的數據顯示2017年全球大約有4.15億糖尿病患者，2045年將超過6.29億[2-4]。糖尿病患者由于糖代謝紊亂易導致糖尿病腎病、視網膜病變、糖尿病足等一系列并發(fā)癥的發(fā)生，嚴重影響患者生存率[5-7]。

研究證實，糖尿病患者體內的胰島β細胞數量的減少是導致其胰島功能受損的重要原因，其與β細胞內發(fā)生的內質網應激反應密切相關[8]。內質網是蛋白質合成和加工的重要細胞器，當合成新蛋白質的需求與內質網促進蛋白質成熟和轉運的能力失去平衡之后，易導致內質網應激的發(fā)生，而在胰島β細胞中，存在著高度發(fā)達的內質網系統(tǒng)[9]，尤其是在2型糖尿病患者體內的胰島β細胞中，由于發(fā)生胰島素抵抗，機體內代償性胰島素分泌增多，增加了內質網的負擔，并且存在高游離脂肪酸和高糖的刺激，從而誘導了β細胞發(fā)生內質網應激反應甚至凋亡[10]，因此，嚴重的內質網應激是加劇糖尿病胰島損傷的一個重要機制，積極研發(fā)具有減輕胰島β細胞內質網應激進而減輕胰島損傷作用的新型控糖藥物，對于改善糖尿病患者的生活質量具有十分重要的意義，也能為糖尿病患者提供更多的用藥選擇。

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種多羥基生物堿成分，存在于桑葉、鴨跖草、風信子和沙參屬等植物中，也可從微生物鏈霉菌和芽孢桿菌中分離得到[11-12]。近年來，多項研究結果表明DNJ具有抑制糖代謝紊亂的作用[13-15]，但DNJ在糖尿病模型鼠中是否能降低血糖水平、減輕胰島組織損傷并改善胰島素抵抗值得我們探究，由于內質網應激可誘導胰島細胞損傷后進一步引起糖尿病惡化，本研究將進一步探討DNJ對糖尿病的作用是否與調控內質網應激反應及其下游通路蛋白水平有關。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物C57BL/6小鼠，雄性，鼠齡5～6周，40只，體質量（18±4）g [南京大學模式動物研究所]。小鼠購入后在動物房適應性喂養(yǎng)1周，嚴格遵守動物管理條例，按照標準條件飼養(yǎng)[動物房溫度（25±3）℃；相對濕度50%～65%]。晝夜節(jié)律照明，并給予小鼠自由飲水和適量的飼料。

1.2 試藥與儀器

DNJ、鏈脲佐菌素（STZ）、4%多聚甲醛固定液和胰島素ELISA檢測試劑盒（美國Sigma公司）；鹽酸二甲雙胍片（浙江亞太藥業(yè)股份有限公司）；血糖儀和血糖試紙（美國強生公司）；β-actin、p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、p-JNK等抗體和HRP標記的二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；葡萄糖（阿拉丁試劑有限公司）；水合氯醛（上海尚寶生物科技有限公司）；HE（蘇木精-伊紅）染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，主要成分為面粉、麩皮、玉米、豆粕、玉米、食鹽、氨基酸、豬油、蔗糖、膽固醇、各種維生素及微量元素等）；彼愛姆BM-38XD倒置熒光顯微鏡（南京東邁科技儀器有限公司）；酶標儀（Thermo Scientific公司）；臺式高速制冷離心機（上海圣科儀器設備有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠分組給藥及血糖、體質量測定

選取30只正常的雄性C57BL/6小鼠建立糖尿病模型，在高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周后，小鼠空腹過夜，每日腹腔注射誘導劑STZ（35 mg·kg－1），連續(xù)1周。另選10只正常組小鼠普通飼料喂養(yǎng)4周后每日腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.4），連續(xù)1周。各組小鼠連續(xù)注射一周后尾靜脈采血法檢測小鼠血糖濃度，若連續(xù)3 d隨機檢測到的小鼠血糖水平值均大于16.7 mmol·L－1，則認為糖尿病造模成功。將造模成功的小鼠隨機分成糖尿病組（DM組，生理鹽水）、二甲雙胍組（MFM組，300 mg·kg－1）、1-脫氧野尻霉素組（DNJ組，60 mg·kg－1），并另設正常對照組（NC組，生理鹽水），四組小鼠每日灌胃給藥一次，在給藥的第0、7、14、21和28日分別用血糖儀和試紙測定各組小鼠血糖水平，并稱量各組小鼠體質量。

2.2 口服葡萄糖耐量實驗和腹腔注射胰島素耐受實驗

在藥物干預的第28日進行口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）：將各組小鼠禁食不禁水處理過夜，次日10點灌胃給予質量濃度為0.2 g·mL－1的葡萄糖溶液（2 g·kg－1，t＝0 h）。在藥物干預的第29日進行腹腔注射胰島素耐受實驗（IPITT）：將各組小鼠禁食不禁水處理4 h，腹腔注射0.05 U·mL－1的胰島素溶液（0.5 U·kg－1，t＝0 h）。以上兩項操作完成后分別在t＝0 h和給予葡萄糖或者胰島素后0.25、0.5、1、1.5、2 h時尾靜脈取血檢測各個時間點的血糖值，并計算曲線下面積（AUC）。

2.3 胰島素水平測定

腹腔注射10%的水合氯醛（300 mg·kg－1）對各組小鼠進行麻醉，待小鼠失去知覺和行動能力后再用手術剪剪開小鼠胸腔，采用5 mL注射器進行心臟取血，并將全血標本轉移至含有EDTA的抗凝管中，再在冷凍離心機中以3000 r·min－1離心5 min，吸取上清得到待測的血漿樣品。隨后按照胰島素ELISA檢測試劑盒中的步驟進行操作，用酶標儀檢測各組小鼠血漿樣品在450 nm波長處的吸光度值，并依據胰島素標準曲線計算各組小鼠血漿中胰島素的水平。

2.4 胰腺組織的蘇木精-伊紅染色

將各組實驗小鼠解剖后，取小鼠胰腺的部分胰尾組織，用4%的多聚甲醛溶液進行固定后用石蠟包埋切片，再用蘇木精和伊紅染料進行染色，然后用顯微鏡觀察胰腺組織的形態(tài)，胰島的橫斷面面積用Image Plus 6.0軟件分析。

2.5 Western blot法檢測IRE1α和PERK通路中相關蛋白的表達水平

將各組小鼠的胰腺組織用RIPA裂解后再超聲破碎，4℃5000 r·min－1離心10 min，吸取上清溶液用BCA法測定蛋白質含量后，配制適宜濃度的SDS-PAGE膠進行Western blot實驗，分別檢測IRE1α和PERK通路中相關蛋白表達水平的變化。

2.6 統(tǒng)計學檢驗

實驗數據用平均值±標準差（±s）表示。數據采用SPSS軟件進行分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，若P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 DNJ對糖尿病小鼠體質量的影響

造模前，各組小鼠體質量無差異，而造模成功后，隨著周齡的增加，正常對照組小鼠體質量逐漸增加，而糖尿病組小鼠體質量增長緩慢，與正常對照組小鼠相比較有減輕的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與糖尿病組小鼠比較，灌胃給予二甲雙胍的第14、21和28日，可產生延緩糖尿病小鼠體質量增長的作用（P＜0.05），但灌胃給予DNJ的小鼠體質量變化不明顯（P＞0.05），見表1。

表1 不同組小鼠體質量變化情況(±s)Tab 1 Changes in body mass of mice in different groups (±s)

表1 不同組小鼠體質量變化情況(±s)Tab 1 Changes in body mass of mice in different groups (±s)

注：與DM組比較，＊P＜0.05。Note：Compared with the DM group，＊P＜0.05.

組別 例數 造模前體質量/g 造模后體質量/g 0日 7日 14日 21日 28日NC組 10 13.2±0.1 25.9±0.3 26.3±0.2 26.9±0.6 27.3±0.8 27.8±0.4 DM組 8 12.9±0.3 23.1±0.4 24.6±0.1 25.4±0.3 25.6±0.5 26.4±0.3 MFM組 10 13.1±0.2 22.9±0.3 22.6±0.4 22.5±0.2＊ 22.3±0.4＊ 22.2±0.1＊DNJ組 9 13.0±0.3 22.8±0.2 23.1±0.5 22.9±0.1 23.4±0.2 23.8±0.6

3.2 DNJ對糖尿病小鼠血糖和胰島素水平的影響

正常對照組小鼠的血糖隨鼠齡增加而穩(wěn)定，始終低于11.1 mmol·L－1，而糖尿病組小鼠的血糖水平明顯高于正常對照組小鼠（P＜0.05）。與糖尿病組小鼠相比，在灌胃給予陽性藥物二甲雙胍第7、14、21、28日后，小鼠血糖水平明顯下降，血糖下降幅度隨著給藥時間的增加而有所增大（P＜0.05）。DNJ組小鼠的血糖在第0、7和14日時與糖尿病組相比差異無統(tǒng)計學意義，而在第21日和28日時血糖水平明顯低于糖尿病組小鼠（P＜0.05，見圖1A）。

在高脂飲食聯(lián)合STZ誘導的2型糖尿病鼠內，由于存在胰島素抵抗導致其促葡萄糖分解代謝的作用減弱，促使胰島素代償性分泌增多以維持血糖濃度相對穩(wěn)定。由圖1可知，糖尿病組小鼠的胰島素水平也明顯高于正常組小鼠，給予二甲雙胍或DNJ后都能降低糖尿病小鼠的胰島素水平，在一定程度上改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗（P＜0.05，見圖1B）。

圖1 DNJ對糖尿病小鼠血糖和胰島素水平的影響Fig 1 Effect of DNJ on blood glucose and insulin levels in diabetic mice

3.3 DNJ對糖尿病小鼠OGTT和IPITT的影響

在OGTT實驗中，分別灌胃2 g·kg－1葡萄糖后，各組小鼠在0.25 h時的血糖水平較0 h時顯著升高（P＜0.05，見圖2A）。正常對照組小鼠的血糖水平在餐后1 h時明顯恢復，并在2 h時接近正常水平，但糖尿病組小鼠的血糖在餐后2 h仍維持在較高的水平，糖耐量水平異常。二甲雙胍組小鼠在口服葡萄糖后的血糖水平較模型組小鼠顯著降低（P＜0.05），而DNJ組小鼠在餐后0.25 h和0.5 h的血糖水平與糖尿病組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義，但從餐后1 h開始的血糖值明顯低于糖尿病組小鼠，并在餐后2 h時接近于餐前水平（P＜0.05）。從各組小鼠血糖隨時間變化曲線的面積值情況來看，糖尿病組小鼠的AUC較正常對照組小鼠明顯增大，而二甲雙胍組小鼠的AUC面積較糖尿病組小鼠顯著下降，DNJ也能在一定程度上恢復糖尿病小鼠的糖耐量水平（P＜0.05，見圖2B）。

在IPITT實驗中，各組小鼠在注射胰島素后的0.25 h達到血糖最低值，在0.5 h有小幅度回升，在1～2 h這段時間內基本恢復到原有水平。糖尿病組小鼠在注射胰島素后的血糖水平明顯高于正常對照組小鼠，給予二甲雙胍或DNJ后，小鼠血糖水平較糖尿病小鼠有所降低（P＜0.05，見圖2C）。從IPITT的AUC圖中可知，糖尿病組小鼠的AUC明顯大于正常對照組，出現(xiàn)了胰島素不耐受的表現(xiàn)，而二甲雙胍和DNJ均能降低糖尿病小鼠的AUC（P＜0.05，見圖2B），這說明二甲雙胍和DNJ能增加糖尿病小鼠對胰島素的敏感性。

圖2 DNJ對糖尿病小鼠OGTT和IPITT的影響Fig 2 Effect of DNJ on OGTT and IPITT in diabetic mice

3.4 DNJ改善糖尿病小鼠胰島損傷

HE染色觀察各組小鼠胰腺組織中胰島部分的形態(tài)病理學改變，與正常對照組小鼠相比，糖尿病組小鼠的胰島分布稀疏，胰島數量和面積明顯減少。由圖3可知，二甲雙胍組小鼠的胰島形態(tài)和分布比糖尿病小鼠的更加規(guī)則，胰島面積有所增加。DNJ也能增加糖尿病小鼠的胰島面積，改善糖尿病小鼠的胰島損傷。

圖3 不同組小鼠胰腺組織HE染色圖Fig 3 HE staining of pancreatic tissue of mice in different groups

3.5 DNJ調控糖尿病小鼠IRE1α和PERK通路中相關蛋白表達水平

由圖4可知，糖尿病小鼠胰腺組織中的IRE1α蛋白水平明顯上調，給予藥物二甲雙胍或DNJ后都能明顯下調IRE1α蛋白的表達。與正常對照組小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺組織中的IRE1α蛋白通路中的下游蛋白JNK的磷酸化水平顯著升高。與糖尿病組小鼠相比，二甲雙胍組和DNJ組小鼠胰腺組織中的p-JNK蛋白水平均明顯降低（P＜0.05，見圖4A和4B）。

與正常對照組小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺組織中的p-PERK和p-eIF2α蛋白表達水平顯著性升高。給予二甲雙胍后，p-PERK和p-eIF2α的蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與糖尿病組小鼠相比，DNJ也能抑制小鼠胰腺組織中p-PERK和p-eIF2α的高表達（P＜0.05，見圖4C和4D）。

圖4 DNJ對糖尿病小鼠IRE1α和PERK通路蛋白表達的影響Fig 4 Effect of DNJ on the expression of the IRE1α and PERK pathways in diabetic mice

4 討論

糖尿病是一種以多飲、多食、多尿和體質量減輕等癥狀表現(xiàn)為主的代謝性疾病，患者體內持續(xù)的高血糖易損傷其心血管和神經系統(tǒng)，導致心腦血管疾病、腎病、視網膜病等并發(fā)癥的發(fā)生[16]。目前我國已成為糖尿病大國，且2型糖尿病占糖尿病總體人群的90%以上[4]，研發(fā)新型控糖藥物對于改善糖尿病患者的生活質量具有十分重要的意義。本研究采用化學誘導劑STZ聯(lián)合高脂食物喂養(yǎng)誘導小鼠發(fā)生2型糖尿病，探討DNJ對糖尿病的影響及可能的作用機制。本課題組的研究與以往關于DNJ的降糖作用研究所用動物模型有一定區(qū)別，研究結果也有所不同，以往關于DNJ的研究主要集中在其對STZ誘導的1型糖尿病模型鼠、基因突變型糖尿病鼠、糖尿病腎病大鼠的作用。如Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)從桑葉中提取分離的DNJ能改善STZ誘導的1型糖尿病模型鼠的葡萄糖代謝和腸道微生物群水平。另一項研究則表明桑葉中DNJ能有效抑制分解糖類酶的活性，阻止葡萄糖的吸收[13]。姚佳等[18]研究發(fā)現(xiàn)DNJ還具有降低糖尿病腎病大鼠的血糖和減輕腎損傷的作用。本課題組的研究結果表明DNJ在給藥的第7日和14日對小鼠血糖無影響，但在第21日和28日時能顯著下調糖尿病小鼠的血糖水平，DNJ對糖尿病小鼠的體質量無明顯作用，造成這一情況的原因可能是DNJ是一種生物堿成分，起效較緩慢。在給藥結束后，我們對小鼠血液中的胰島素水平進行測定，研究結果表明糖尿病小鼠體內由于存在胰島素抵抗導致胰島素代償性的分泌增加[14，16]，二甲雙胍和DNJ都能降低糖尿病小鼠的胰島素抵抗，這說明了胰島素作為機體內唯一的降血糖激素，在維持糖尿病小鼠血糖穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要作用。糖尿病患者存在糖代謝紊亂和胰島素不耐受的情況，課題組通過OGTT實驗和IPITT實驗發(fā)現(xiàn)DNJ能改善糖尿病小鼠的糖耐量，增加小鼠對胰島素的敏感性，在延緩糖尿病進程方面具有重要意義。

近年來有研究結果表明DNJ可通過不同機制改善血糖水平或胰島素抵抗。如Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)DNJ通過調控IR-GlUT4和 ADIPO-GLUT4通路維持3T3-L1脂肪細胞內的葡萄糖穩(wěn)態(tài)水平。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)DNJ通過激活PI3K/AKT通路減輕db/db 型糖尿病小鼠的胰島素抵抗。在2型糖尿病患者的胰島β細胞內由于發(fā)生胰島素抵抗，機體內代償性胰島素分泌增多，增加了內質網的負擔，此時內質網中的分子伴侶蛋白結合這些代償性產生或錯誤折疊的蛋白質如胰島素，使IRE1α、PERK等蛋白被釋放并磷酸化而激活，進而使得它們的下游信號通路蛋白如JNK、eIF2α等被激活，從而誘發(fā)胰島β細胞發(fā)生凋亡[21-22]。IRE1α-JNK通路的下調有助于內質網的穩(wěn)態(tài)，減輕內質網應激反應[23]，此外，PERK-eIF2α信號通路的調控可選擇性地減少蛋白質的翻譯，進而阻止新合成的蛋白質進入內質網從而減輕內質網的壓力[24]，因此本課題組檢測了DNJ對IRE1α、p-JNK、p-PERK蛋白和下游效應器p-eIF2α蛋白表達的影響，結果表明糖尿病小鼠胰腺組織中內質網應激反應相關蛋白IRE1α、p-JNK、PERK和eIF2α的表達水平明顯升高，給予藥物DNJ可下調這些蛋白的表達，說明內質網應激可導致胰島損傷，與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關，而DNJ可減輕內質網應激反應，改善2型糖尿病小鼠的胰島損傷。

5 結論

本研究表明DNJ可通過下調糖尿病小鼠胰腺組織中IRE1α、p-JNK、PERK和eIF2α蛋白的表達，進而減輕內質網應激反應，發(fā)揮降低2型糖尿病小鼠血糖、改善胰島素抵抗和減輕小鼠胰島損傷的作用（見圖5）。

圖5 DNJ對糖尿病小鼠的作用和作用機制Fig 5 Effect and mechanism of DNJ on diabetic mice