玉米對(duì)灰斑病脅迫的生理生化響應(yīng)

趙思琪，曲比伍合，羅 婷，余學(xué)杰，，柯永培，，茍齊賢，石海春，

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司，四川 成都 610213)

玉米(Zeamays)灰斑病于1925年在美國伊利諾伊州亞歷山大縣首次發(fā)現(xiàn)[1]，于1991年在我國丹東首次報(bào)道[2]，至今該病在全國普遍發(fā)生，對(duì)玉米生產(chǎn)造成了很大的威脅[3-5]。應(yīng)用實(shí)踐證明，篩選和培育抗病新品種以及研究它們抗灰斑病的生理生化機(jī)制等，可為品種選擇與區(qū)域布局等提供更多科學(xué)合理的選擇空間，也是解決這一困境的理想途徑[6-8]。目前，針對(duì)玉米灰斑病的研究多集中在對(duì)其病原菌種類的鑒定[9-11]、種質(zhì)抗病性鑒定[12-14]以及抗病基因定位[15-17]等方面，關(guān)于抗灰斑病的生理生化機(jī)制研究相對(duì)較少，且研究材料選擇及相關(guān)研究內(nèi)容比較單一。如呂靜波[18]、劉可杰[19]、馬瑩瑩等[20]以不同抗性的玉米自交系為材料，而郭紅蓮等[21]、王桂清等[22]則以雜交種為材料，其研究內(nèi)容主要集中在灰斑病脅迫下不同防御酶的變化。然而，當(dāng)玉米受到病原菌侵染后，其體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化變化，如發(fā)病植株葉片葉綠素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等[23-24]、防御酶類活性變化[25-26]以及誘發(fā)激素響應(yīng)[27-28]。

本試驗(yàn)系統(tǒng)研究不同抗性玉米自交系及雜交種感染灰斑病后其光合特性、活性氧、防御酶以及激素的動(dòng)態(tài)變化，旨在全面分析不同抗性玉米材料響應(yīng)灰斑病的生理生化差異，明確其抗玉米灰斑病的生理生化機(jī)制，為資源鑒定與利用、品種選育與時(shí)空布局等提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選用四川正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供的玉米自交系K365(抗灰斑病)和K169(高感灰斑病)及雜交種正紅431(高抗灰斑病)和正紅532(高感灰斑病)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2021年春季將試驗(yàn)材料種植在四川正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司四川滎經(jīng)縣試驗(yàn)基地，該試點(diǎn)為玉米灰斑病高發(fā)區(qū)，每個(gè)材料種植12行，每行種14株，小區(qū)面積40 m2，密度42 000株/hm2。從吐絲期開始，選取長勢基本一致的植株單株掛牌，于吐絲后25，30，35，40，45 d采集葉片，用錫鉑紙包住迅速投入液氮中，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃冰箱保存用于相關(guān)生理指標(biāo)測定；于吐絲30 d(病斑出現(xiàn)前)和40 d(病斑出現(xiàn)后)時(shí)，對(duì)玉米穗位葉進(jìn)行光合參數(shù)測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 光合參數(shù)的測定 于09：00—11：00選取3株長勢基本一致的植株，用LI-6800便攜式光合作用測定儀測定其功能葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)等光合指標(biāo)。

1.3.2 活性氧含量和抗氧化酶活性測定 用碘化鉀法[29]測定過氧化氫(H2O2)含量，用愈創(chuàng)木酚顯色法[30]測定過氧化物酶 (POD)活性，用NBT光化還原法[30]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，用紫外分光光度法[30]測定過氧化氫酶 (CAT)活性。

1.3.3 激素含量測定 用磷酸緩沖液提取內(nèi)源激素，用酶聯(lián)免疫吸附法測定內(nèi)源激素水楊酸(SA)和茉莉酸 (JA)含量，試劑盒由重慶博諾恒生物科技有限公司提供。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan's新復(fù)極差法檢驗(yàn)顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰斑病脅迫對(duì)玉米光合特征的影響

將出現(xiàn)灰斑病病斑前和病斑后不同材料的光合特征變化情況列于表1。由表1可知，玉米在出現(xiàn)病斑后比出現(xiàn)病斑前，Pn、Gs、Ci和Tr在不同的玉米材料中均表現(xiàn)為降低趨勢，但感病材料的光合特征指標(biāo)比抗病材料的下降趨勢更加明顯。針對(duì)感病材料，除雜交種正紅532的Ci差異不顯著外，不論是自交系K169還是雜交種正紅532其光合特征指標(biāo)下降程度均達(dá)顯著水平(P<0.05)，自交系K169的Pn、Gs和Tr分別下降59.32%，95.28%，80.18%，雜交種正紅532的Pn、Gs和Tr分別下降85.39%，69.60%，56.77%。針對(duì)抗病材料，自交系K365和雜交種正紅431的Ci均顯著下降外(P<0.05)，其余指標(biāo)下降程度均未達(dá)顯著水平，具體為自交系K365的Pn、Gs和Tr分別下降24.41%，25.00%，4.20%，雜交種正紅431的Pn、Gs和Tr分別下降11.53%，21.43%，0.06%。綜合表明，玉米灰斑病脅迫可嚴(yán)重影響其光合效率，且對(duì)感病材料的影響更大。

表1 灰斑病脅迫對(duì)玉米光合特征的影響Tab.1 Effects of gray spot stress on photosynthetic characteristics of maize

2.2 灰斑病脅迫對(duì)玉米過氧化氫含量的影響

灰斑病脅迫下不同玉米材料的H2O2含量變化見圖1，可見其H2O2含量在不同抗性的玉米材料中變化規(guī)律不完全一致，主要表現(xiàn)為：針對(duì)感病材料，自交系K169的H2O2含量持續(xù)升高，雜交種正紅532的H2O2含量后期高于前期，之后維持在較高水平，即感病材料整體表現(xiàn)為先上升然后穩(wěn)定在一定高水平，具體為自交系K169的H2O2含量在吐絲45 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為83.63%，雜交種正紅532的H2O2含量在吐絲35 d顯著上升(P<0.05)，相較吐絲25 d增幅為65.44%，之后維持在480.60～592.10 μmol/g水平；針對(duì)抗病材料，無論是自交系K365還是雜交種正紅431其H2O2含量均分別在吐絲后35 d達(dá)最高，然后又顯著下降到一定水平(P<0.05)，即抗病材料表現(xiàn)為先顯著上升后又顯著下降趨勢，具體為自交系K365的H2O2含量在吐絲35 d顯著上升，相較吐絲25 d增幅為53.42%，雜交種正紅431的H2O2含量在吐絲35 d顯著上升，相較吐絲25 d增幅為69.12%。綜合表明，灰斑病可以導(dǎo)致玉米葉片的H2O2含量升高，而脅迫后期感病材料的H2O2含量高于抗病材料，表明感病材料受到的氧化損傷程度更嚴(yán)重。

不同小寫字母表示感病材料不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)； 不同大寫字母表示抗病材料不同時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)。圖2—6同。 Different small letters in the figure indicate that the susceptible materials have significant difference at different time(P<0.05)； different capital letters indicate that the resistant materials have significant difference at different time(P<0.05).The same as Fig.2—6.

2.3 灰斑病脅迫對(duì)玉米抗氧化酶活性的影響

2.3.1 灰斑病脅迫對(duì)玉米材料POD活性的影響 灰斑病脅迫下不同玉米材料的POD活性變化見圖2，可見，除K365的POD活性呈先上升后下降變化趨勢，其余3個(gè)材料POD活性均表現(xiàn)為先上升后維持穩(wěn)定，但無論自交系還是雜交種，抗病材料POD活性達(dá)到峰值上升的幅度大于感病材料，具體表現(xiàn)為：自交系K365和K169的POD活性均在吐絲30 d達(dá)到最大值，但K365增幅為70.94%，而K169為49.74%；雜交種正紅431和正紅532的POD活性最大值分別在吐絲后40，35 d，其增幅分別為59.52%，54.63%，其POD活性較吐絲25 d均達(dá)顯著水平。綜合表明，灰斑病脅迫下，其POD活性均表現(xiàn)為顯著上升趨勢，且其抗病材料的POD活性增幅更高。

2.3.2 灰斑病脅迫對(duì)玉米SOD活性的影響 灰斑病脅迫下不同玉米材料的SOD活性變化見圖3，可見，其SOD活性在不同抗性的玉米材料中變化規(guī)律不完全一致，針對(duì)感病材料，其表現(xiàn)為先顯著上升再顯著下降然后再上升趨勢，具體表現(xiàn)為：自交系K169的SOD活性在吐絲35 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為14.50%，在吐絲40 d又顯著下降至137.15 U/g(P<0.05)，雜交種正紅532的SOD活性在吐絲35 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為24.18%，在吐絲40 d顯著下降至148.77 U/g(P<0.05)；針對(duì)抗病材料則表現(xiàn)為顯著上升到一定水平后不再顯著變化，具體為自交系K365的SOD活性在吐絲45 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為21.12%，在吐絲35～45 d期間SOD活性維持在162.43～174.55 U/g，雜交種正紅431的SOD活性在吐絲45 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為27.29%，在吐絲35～45 d SOD活性維持在164.25～174.53 U/g。綜合表明，抗病材料比感病材料的SOD活性上升幅度更高，維持時(shí)間更久。

圖2 灰斑病脅迫對(duì)不同抗性玉米材料POD活性的影響Fig.2 Effects of gray spot stress on POD activity of maize materials with different resistance

圖3 灰斑病脅迫對(duì)不同抗性玉米材料SOD活性的影響Fig.3 Effects of gray spot stress on SOD activity of maize materials with different resistance

2.3.3 灰斑病脅迫對(duì)玉米CAT活性的影響 灰斑病脅迫下不同玉米材料的CAT活性變化見圖4，可見，其CAT活性在不同的玉米材料中均大致表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，但無論自交系還是雜交種，抗病材料CAT活性達(dá)到峰值上升的幅度要大于感病材料，具體表現(xiàn)為：自交系K365和K169的CAT活性均在吐絲35 d達(dá)到最大值，但相較吐絲25 d，K365增幅為25.33%，而K169為23.73%；雜交種正紅431和正紅532的CAT活性均在30 d達(dá)到最大值，但正紅431增幅為107.64%，而正紅532增幅為84.43%。綜合表明，灰斑病脅迫下，其CAT活性均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，且其抗病材料的CAT活性上升幅度更高。

圖4 灰斑病脅迫對(duì)不同抗性玉米材料CAT活性的影響Fig.4 Effects of gray spot stress on CAT activity of maize materials with different resistance

2.4 灰斑病脅迫對(duì)玉米內(nèi)源激素含量的影響

2.4.1 灰斑病脅迫對(duì)玉米SA含量的影響 灰斑病脅迫下不同玉米材料的SA含量變化見圖5，可見，其SA含量在不同抗性的玉米材料中變化趨勢不盡相同，針對(duì)感病材料，自交系K169的SA含量只在吐絲45 d顯著上升，雜交種正紅532則表現(xiàn)為雙峰趨勢，具體為自交系K169在吐絲45 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為80.30%，雜交種正紅532在吐絲30，40 d達(dá)到峰值，相較吐絲25 d增幅分別為77.99%，86.89%；針對(duì)抗病材料，其整體表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，具體為自交系K365在吐絲30 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為59.47%，雜交種正紅431在吐絲35 d達(dá)到最大值，相較吐絲25 d增幅為85.34%。綜合表明，不同玉米材料受到灰斑病侵染后體內(nèi)SA含量呈不同程度的調(diào)節(jié)。

圖5 灰斑病脅迫對(duì)不同抗性玉米材料SA含量的影響Fig.5 Effects of gray spot stress on SA content in maize with different resistance

2.4.2 灰斑病脅迫對(duì)玉米JA含量的影響 灰斑病脅迫下不同玉米材料的JA含量變化見圖6，可見，其JA含量在不同抗性的玉米材料中變化規(guī)律不完全一致，針對(duì)感病材料，其整體表現(xiàn)為先上升后下降趨勢，具體為自交系K169在吐絲35 d達(dá)到最大值，比吐絲25 d上升68.80%，雜交種正紅532在吐絲40 d達(dá)到最大值，比吐絲25 d上升88.27%；針對(duì)抗病材料則表現(xiàn)為雙峰趨勢即先上升后下降再上升再下降，具體為自交系K365分別在吐絲30，40 d達(dá)到峰值，比吐絲25 d分別上升了79.10%，107.75%，雜交種正紅431也分別在吐絲30，40 d達(dá)到峰值，比吐絲25 d分別上升了92.83%，89.11%。綜合表明，抗病材料的JA含量比感病材料上升幅度大且時(shí)間早。

圖6 灰斑病脅迫對(duì)不同抗性玉米材料JA含量的影響Fig.6 Effects of gray spot stress on JA content in maize with different resistance

3 結(jié)論與討論

3.1 玉米抗灰斑病的光合特性基礎(chǔ)

光合作用是植物生長的生理基礎(chǔ)，有研究表明，植物的光合能力受到諸多因素的影響，病菌侵染會(huì)導(dǎo)致葉片的光合性能受損，Pn、Gs和Tr下降[31-33]。而對(duì)玉米感染病害后光合特性的研究大多集中在對(duì)雜交種的探究上[34-35]。本研究同時(shí)以不同抗性的玉米自交系和雜交種為研究材料，結(jié)果表明，在灰斑病脅迫下，它們的Pn、Gs、Tr和Ci均呈現(xiàn)不同程度的下降，但無論自交系還是雜交種，抗病材料在灰斑病脅迫下光合特性下降不顯著，而感病材料的光合特性顯著下降，推測其原因可能是因?yàn)楦胁〔牧嫌捎诓【秩緦?dǎo)致氣孔關(guān)閉，進(jìn)入氣孔CO2量減少，最終導(dǎo)致凈光合速率降低。

另外，當(dāng)葉片Gs、Tr和Ci同時(shí)下降時(shí)，凈光合速率下降的因素為氣孔限制；反之如果葉片凈光合速率的降低伴隨著胞間CO2濃度的升高，則光合作用的限制因素是非氣孔限制[36]，本研究中，灰斑病脅迫下葉片Ci下降，說明K365、K169、正紅431和正紅532的光合受到抑制是由氣孔因素引起的。

3.2 玉米抗灰斑病的抗氧化系統(tǒng)基礎(chǔ)

植物在正常生長狀態(tài)下，體內(nèi)活性氧(ROS)含量達(dá)動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)植物受到病原菌侵染后，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破[37]，其中H2O2是ROS的一種，非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)H2O2的積累，其含量可間接反映植物耐受程度[38]。抗病材料可以及時(shí)控制體內(nèi)的H2O2平衡，感病材料則會(huì)發(fā)生紊亂[39]。本研究中，抗病材料能將H2O2維持在穩(wěn)定水平，與前人結(jié)果相符，而感病材料則表現(xiàn)出不一致的變化規(guī)律，其中自交系K169的H2O2持續(xù)升高，雜交種正紅532的H2O2在吐絲40 d有顯著下降的趨勢，分析其原因可能是由于雜交種因存在雜種優(yōu)勢而抵抗灰斑病的能力要強(qiáng)于自交系。

當(dāng)ROS含量升高到一定程度時(shí)會(huì)對(duì)植物造成傷害，為了減輕ROS的傷害植物會(huì)啟動(dòng)抗氧化系統(tǒng)來抵御氧化損傷，主要包括SOD、POD和CAT等抗氧化酶類和ASA、GSH等非酶類抗氧化劑[40-42]，其中酶類的抗氧化劑被認(rèn)為是清除ROS最直接、最有效的途徑[43]。本研究結(jié)果表明，抗病材料的POD、SOD和CAT活性上升的幅度及上升持續(xù)時(shí)間要高于感病材料，與前人研究[18-19，21]基本一致。

但值得注意的是本研究發(fā)現(xiàn)，無論自交系還是雜交種，抗感材料的抗氧化酶活性差異表現(xiàn)均出現(xiàn)在病斑之后，如K365葉片的SOD活性在出現(xiàn)病斑后仍維持較高水平，而K169葉片的SOD活性顯著下降；正紅431葉片的CAT活性在出現(xiàn)病斑后維持在初始水平，而正紅532葉片的CAT活性下降到初始水平的0.64倍。這可能與抗病材料抑制病斑擴(kuò)展有關(guān)，感病材料由于防御酶活性較低，可能無法及時(shí)清除H2O2，導(dǎo)致體內(nèi)H2O2積累，進(jìn)一步對(duì)植物形成氧化脅迫，最終導(dǎo)致病斑擴(kuò)散，因此“病斑出現(xiàn)”可能是抗感材料抗氧化系統(tǒng)差異的關(guān)鍵時(shí)期。

3.3 玉米抗灰斑病的內(nèi)源激素基礎(chǔ)

SA和JA是重要的信號(hào)分子，在植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)過程中充當(dāng)重要的角色[44-45]。當(dāng)受到病菌侵染會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)SA和JA發(fā)生明顯變化[46]，且不同抗性植株會(huì)對(duì)病害脅迫做出不同程度的響應(yīng)[47-48]。潘鳳英[49]研究表明，2個(gè)不同抗性水稻幼苗感染南方水稻黑條矮縮病后SA迅速積累，并在癥狀出現(xiàn)后達(dá)到最大值，高抗材料的SA含量高于高感材料。魯秀梅等[50]研究表明，不同抗性甜瓜接種病菌后體內(nèi)JA含量有顯著變化，高濃度的JA可提高對(duì)蔓枯病的抗病能力。本研究表明，抗病材料在剛出現(xiàn)病斑時(shí)SA含量為較高水平，JA含量為較低水平；而感病材料在剛出現(xiàn)病斑時(shí)SA含量為較低水平，JA含量為較高水平，可綜合推測出，在剛出現(xiàn)病斑時(shí)SA和JA存在拮抗作用，且也進(jìn)一步證實(shí)了“病斑出現(xiàn)”可能是抗感材料抗氧化系統(tǒng)差異的關(guān)鍵時(shí)期。

綜上所述，玉米灰斑病脅迫下，其感病材料光合速率顯著下降，以及活性氧增加導(dǎo)致葉片氧化水平失衡，抗病材料可能通過合理積累SA、JA等信號(hào)分子來調(diào)控抗氧化系統(tǒng)，使其在感病后期體內(nèi)仍維持較高水平的防御酶活性來更有效清除多余的H2O2，同時(shí)調(diào)節(jié)葉片的內(nèi)源激素平衡使其適應(yīng)灰斑病帶來的影響，從而增強(qiáng)玉米的抗病性。