賈建平，李金鴻，于敬文，余曦玥，彭德良，李惠霞，黃文坤

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

大豆是世界范圍內(nèi)種植最多的豆科作物，是優(yōu)質(zhì)植物油料來源和食用、飼用蛋白質(zhì)主要來源[1]。在2020—2021年，我國進(jìn)口大豆數(shù)量占世界大豆總進(jìn)口數(shù)量的60%，食用大豆約7 440萬t[2]。鑒于大豆嚴(yán)重依賴進(jìn)口，加強(qiáng)我國大豆主要病害防治，提高單產(chǎn)水平，對于振興我國大豆產(chǎn)業(yè)具有十分重要的意義。大豆孢囊線蟲(Soybean cyst nematode，SCN，HeteroderaglycinesIchinohe)是危害大豆主要病原之一[3-4]，最早于1899年由雅切夫斯基等在我國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)并報道，隨后在亞洲(朝鮮、印度尼西亞、韓國)、非洲(埃及)、歐洲(俄羅斯)和美洲(哥倫比亞、加拿大、巴西、阿根廷、美國)等地區(qū)報道[5-7]。大豆孢囊線蟲繁衍周期短，繁殖能力強(qiáng)，1 a可繁殖3代；當(dāng)環(huán)境條件不適宜生長時，土壤中的孢囊可保持10 a的生活力，因此，防治較為困難[8]。1996—2016年，美國僅由該線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失累計超過320億美元，平均每年超過15億美元[9]。在我國，大豆孢囊線蟲病發(fā)生面積常年在1.33×106hm2，東北和黃淮海地區(qū)發(fā)生最普遍[10]，東北地區(qū)大豆孢囊線蟲平均發(fā)病率高達(dá)80%，平均病情指數(shù)在50左右[11]，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)30%～50%，甚至絕收[12-13]。目前，我國黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇、湖北、浙江、上海、新疆、陜西、寧夏和甘肅等18個省、市和自治區(qū)已證實有大豆孢囊線蟲分布[14-16]。近年來在山西地區(qū)首次報道了該線蟲侵染綠豆致病并形成孢囊[17]。目前，除了采用抗病品種之外，植物線蟲病的防治仍以化學(xué)防治為主，但環(huán)境污染、抗藥性問題仍不容忽視，許多高毒高殘留的化學(xué)殺線蟲劑如溴甲烷、呋喃丹等已被禁用，因此，尋求低毒、低殘留、對環(huán)境友好的殺蟲防治方法成為人們關(guān)注的熱點。

研究表明，施用氮肥可使大豆產(chǎn)量平均增加11%[18]。作物產(chǎn)量并不隨施氮量的增加而持續(xù)增加，過量施氮反而會引起氮肥利用率和增產(chǎn)效應(yīng)降低、氮素?fù)p失量增加、土壤酸化加劇等問題[19]。施氮量與產(chǎn)量構(gòu)成之間呈顯著的二次回歸關(guān)系，各產(chǎn)量構(gòu)成變化隨施氮量的增加出現(xiàn)了“低—高—低”的變化趨勢，說明氮肥對產(chǎn)量構(gòu)成的貢獻(xiàn)存在臨界值，這個臨界值由植物的生理特性決定[20]。氮肥施用量與水稻產(chǎn)量呈開口向下的拋物線關(guān)系[21]，朱桂玉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，氮、磷、鉀肥施用量均為中等水平時，水稻產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益最佳。胥雅馨等[23]研究發(fā)現(xiàn)，隨著施氮量的增加，根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、干物質(zhì)積累量及產(chǎn)量均表現(xiàn)為先增加后下降趨勢。劉志強(qiáng)等[24]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白質(zhì)含量隨著氮用量的增加呈先升高再下降的變化趨勢。大豆孢囊線蟲病屬于土傳病害，其發(fā)生與土壤環(huán)境作用密切相關(guān)，施肥會引起土壤pH值的改變，大豆根在低pH值條件下可形成較厚的木栓層，具有防止線蟲感染的作用[25]。植物生長過程中從根部不同部位分泌到土壤中各種物質(zhì)，張福鎖等[26]認(rèn)為，根系分泌物主要包含糖、氨基酸、有機(jī)酸、維生素、核苷酸、真菌刺激劑或引誘劑、線蟲孵化劑、線蟲引誘劑和其他混合物等。閻飛等[27]研究表明，大豆的根系分泌物主要為類黃酮、異黃酮和酚類，可誘導(dǎo)根瘤菌在根部定植[28-31]。Tefft等[32]研究認(rèn)為，大豆根系分泌物可能導(dǎo)致更多的SCN卵孵化。Sikora等[33]研究發(fā)現(xiàn)，不同大豆品種的淋溶液對大豆孢囊線蟲卵孵化刺激程度存在著差異。Schmitt等[34]研究認(rèn)為，大豆根系分泌物比裸露土壤更能刺激大豆孢囊線蟲卵的孵化。施用氮肥，對大豆和孢囊線蟲均會產(chǎn)生影響，因此，有必要研究不同氮肥水平對大豆生長及孢囊線蟲的影響，以便為氮肥在大豆生產(chǎn)和孢囊線蟲病防治中的合理利用提供依據(jù)。

本試驗擬設(shè)置不同的氮肥水平，分析其土壤淋溶液和根系浸出液對孢囊線蟲的直接影響，并通過室內(nèi)試驗和田間試驗，探究施氮水平對孢囊線蟲危害和對大豆生長的影響，以期為通過農(nóng)業(yè)措施防治大豆孢囊線蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為中黃30號(市售感病品種)。

供試大豆孢囊線蟲采集自甘肅省平?jīng)鍪写蠖固铩?/p>

供試氮肥為尿素(46%CH4N20)(陜西渭河重化工有限責(zé)任公司)。

盆栽試驗土壤理化性質(zhì)：將土和細(xì)沙按2∶1的比例混合后滅菌，其堿解氮、有效磷和速效鉀的含量分別為57.5，19.0 ，117 mg/kg。

1.2 土壤淋溶液和根系浸出液的制備

試驗用塑料盆為8 cm×8 cm，內(nèi)盛150 g土，每盆種植1株大豆。大豆長出2片子葉時施肥(施肥量見表1)，對照組不施肥，15 d后收集土壤淋溶液[30]。收集淋溶液時，提前24 h停止?jié)菜?，每盆?0 mL蒸餾水浸潤土壤，1 h后再澆灌150 mL蒸餾水，收集50 mL盆底部滲出的溶液，用濾紙過濾備用[35]，重復(fù)3次。

表1 盆栽試驗中的氮肥施用水平Tab.1 Nitrogen fertilization level in pot experiment

為了收集根系浸出液，將上述施肥處理15 d后的植株拔出并保留完整的大豆根部，用清水沖洗干凈。將根剪碎后浸入50 mL蒸餾水中，在常溫下浸泡24 h，得到不同濃度氮肥處理后的根系浸出液[36]。

1.3 大豆孢囊線蟲卵懸浮液的制備

大豆收獲后，參考李惠霞等[37]的調(diào)查方法，選擇孢囊線蟲基數(shù)較高的大豆田塊收集病土，采用漂浮法分離收集孢囊。將挑取的孢囊置于75，30 μm套篩上，用橡膠塞充分研磨破碎，然后用蒸餾水將30 μm篩上的卵沖洗至燒杯中，制成200粒/mL的卵懸浮液備用[36]。

1.4 土壤淋溶液和根系浸出液對卵孵化的影響

將自制的小篩網(wǎng)置于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入1 mL卵懸浮液，按1.2中方法制備3 mL不同濃度的土壤淋溶液和根系浸出液，對照組則加入等量蒸餾水，放入25 ℃培養(yǎng)箱中孵化。每處理重復(fù)3次，每隔3 d統(tǒng)計二齡幼蟲孵化情況，共記錄12 d，計算卵孵化抑制率。

卵孵化抑制率=(對照組卵孵化率-處理組卵孵化率)/對照組卵孵化率×100%

①

1.5 盆栽試驗中施用氮肥對線蟲繁殖的影響

大豆孢囊線蟲繁殖試驗所用塑料盆為10 cm×15 cm，內(nèi)盛250 g土，每盆播種1粒大豆，種植前各處理施用0.016～0.064 g/kg土的氮肥(表1)，對照組不施肥。大豆2葉期，用5 mL槍頭在大豆根周圍對稱打孔，深度約為3 cm，每株大豆接2 000粒卵，每個處理重復(fù)3次。將大豆植株置于22～28 ℃且光照條件良好的環(huán)境中培育，定期澆水。接種70 d后，收集土樣，采用漂浮法分離收集孢囊，在解剖鏡下計數(shù)[37]，計算孢囊相對減退率。

孢囊相對減退率=(對照組孢囊數(shù)-處理組孢囊數(shù))/對照組孢囊數(shù)×100%

②

1.6 田間試驗中不同濃度氮肥對線蟲繁殖和大豆生長的影響

試驗地為甘肅省慶陽市寧縣良平鎮(zhèn)豐樂村多茬種植大豆的田塊，且大豆孢囊線蟲基數(shù)較高。大豆于2020年5月3日種植，9月25日收獲。大豆生長期進(jìn)行除草和噴施農(nóng)藥，自然雨水灌溉。

設(shè)置22.50～78.75 kg/hm24個氮肥濃度梯度，空白對照未施肥(表2)。每個小區(qū)面積為6 m2，重復(fù)3次，各處理隨機(jī)排列。大豆播種前，調(diào)查各處理孢囊基數(shù)；大豆開花期，挖取20株大豆的全部根系，計算發(fā)病株率。大豆收獲時，挖取20株大豆，用清水沖洗后，統(tǒng)計株高、根長、莢數(shù)、莢粒數(shù)和千粒質(zhì)量等，比較氮肥對植株生長的影響。參照李惠霞等[37]的調(diào)查方法，采集小區(qū)內(nèi)0～20 cm的土壤，采用漂浮法分離收集孢囊，在解剖鏡下計數(shù)，統(tǒng)計各小區(qū)的孢囊減退率。

孢囊減退率=(施藥前小區(qū)孢囊數(shù)-施藥后小區(qū)孢囊數(shù))/施藥前小區(qū)孢囊數(shù)×100%

③

表2 田間試驗氮肥水平Tab.2 Nitrogen fertilization level in field experiment

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析，差異顯著性采用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤淋溶液和根系浸出液對大豆孢囊線蟲卵孵化的影響

在處理12 d內(nèi)，施氮的土壤淋溶液處理均能顯著抑制大豆孢囊線蟲的卵孵化，但不同濃度氮肥土壤淋溶液處理SCN卵孵化抑制率無顯著差異。處理6 d，1.0(0.032 g/kg)，1.5(0.048 g/kg)，2.0倍(0.06 4g/kg)N肥處理土壤淋溶液處理的卵孵化抑制率無顯著差異；處理12 d，1.0(0.032 g/kg)，2.0倍(0.064 g/kg)N肥處理的卵孵化抑制率分別為34.21%，29.31%，且有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。

根系浸出液中對卵孵化抑制率影響的調(diào)查結(jié)果表明，整個時間段各處理濃度根系浸出液均對大豆孢囊線蟲卵孵化具有一定的抑制作用。在孵化至第12天，各處理孵化抑制率分別為50.47%，49.53%，29.91%，55.09%(圖2)。2倍氮肥處理(0.064 g/kg)的根系浸出液中SCN卵孵化抑制率在各個觀察時間均高于其他處理，說明2倍氮肥處理的根系浸出液對線蟲卵孵化有顯著的抑制作用。

圖1 施氮肥后的土壤淋溶液對SCN卵孵化的影響Fig.1 The effect of soil leaching solution on the hatching of SCN eggs

圖2 施氮肥大豆根系浸出液對SCN卵孵化的影響Fig.2 Effect of soybean root extraction with nitrogen fertilizer on the hatching of SCN eggs

2.2 盆栽試驗中氮肥處理對大豆孢囊線蟲繁殖的影響

盆栽試驗中，接種孢囊線蟲90 d后，不同的氮肥處理均可有效地減少孢囊的數(shù)量，其孢囊相對減退率分別為10.00%，4.24%，28. 78%，16.81%，且差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)，其中1.5倍(0.048 g/kg)氮肥處理的孢囊相對減退率最高，達(dá)28.78%(圖3)。表明氮肥處理對大豆孢囊線蟲的繁殖具有一定的抑制作用。

圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4同。 Different letters indicate significant difference (P<0.05).The same as Fig.4.

2.3 田間試驗氮肥處理對大豆孢囊線蟲繁殖和大豆生長的影響

大豆開花期調(diào)查，與對照相比，1.25，1.50倍氮肥處理，可以顯著減少大豆的病株率(P<0.05)，但0.50，1.75倍氮肥處理與對照相比病株率沒有顯著差異(表3)。與對照相比，1.25，1.50，1.75倍氮肥處理的千粒質(zhì)量均顯著提高，其中施用1.25倍 (56.25 kg/hm2) 氮肥小區(qū)增產(chǎn)率最高，達(dá)14.75%；氮肥處理的莢粒數(shù)與對照沒有顯著差異，但株高顯著高于未施肥的對照。因此，適當(dāng)增施氮肥，不僅可以減少大豆孢囊的危害，而且可以增加大豆的產(chǎn)量。

表3 田間施氮肥對大豆生長和產(chǎn)量的影響Tab.3 Effect of nitrogen fertilizer application on soybean growth and yield in the field experiment

大豆收獲時，采集根圍的土壤分離大豆孢囊線蟲的孢囊，分析氮肥處理對大豆孢囊線蟲繁殖的影響。結(jié)果表明，氮肥各處理的孢囊數(shù)量均顯著下降，孢囊減退率為13.62%～25.29%，其中1.25倍(56.25 kg/hm2)N肥處理的孢囊減退率最高，而對照小區(qū)土壤中的孢囊數(shù)較大豆播種前增加了30.77百分點(圖4)。說明適當(dāng)增施氮肥能夠有效減少大豆孢囊線蟲的繁殖。

圖4 田間施氮肥對土壤中大豆孢囊線蟲的影響Fig.4 Effect of nitrogen fertilizer application on soybean cyst nematode in field experiment

3 結(jié)論與討論

本研究通過室內(nèi)接種試驗和田間試驗，發(fā)現(xiàn)氮肥土壤淋溶液及大豆根系浸出液可不同程度地抑制大豆孢囊線蟲卵的孵化，田間適量增施氮肥可以減輕大豆孢囊線蟲病的危害，增加大豆產(chǎn)量。因此，適量增施氮肥對于提高大豆的抗病性、減少大豆孢囊線蟲病的危害具有重要意義。適量增施氮肥，不僅可以通過減少根系分泌物來降低對線蟲的誘集作用，而且可以促進(jìn)植株中抗病性相關(guān)物質(zhì)的增加，從而增強(qiáng)植株對線蟲的抗性、降低線蟲的侵染和危害。前人研究表明，易感作物根系分泌物如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸等都對線蟲具有誘集作用，促進(jìn)卵的孵化[38]。在本試驗中，氮的添加降低了根系的生物量分配比，導(dǎo)致根系分泌物減少，從而抑制了卵的孵化。其次，氮肥中的尿素在土壤脲酶作用下可水解產(chǎn)生不利于線蟲存活的氨[39]，增加總酚、類黃酮和可溶性糖等與植物抗病性相關(guān)物質(zhì)的分泌，有助于植物抗病[40-42]。

然而，氮肥的施用量必須保持在合理水平，氮肥水平過高或過低均不利于植株的正常生長和抗病性增強(qiáng)。缺氮會明顯降低有效穗數(shù)和株高[43]，但氮水平過高會降低植株的碳氮比，減少植物內(nèi)萜烯和酚類等抗性物質(zhì)的含量，從而降低植株的抗性[44]。在小麥與玉米周年生產(chǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，每季氮肥施用量均為150 kg/hm2時可以獲得最高周年產(chǎn)量，再增加肥料施用量，則產(chǎn)量不會增加[45]。隨著冬小麥控釋尿素施用量增加，氮肥偏生產(chǎn)力呈下降趨勢[46]。楊衛(wèi)星等[47]研究表明，適量施用尿素對禾谷孢囊線蟲(Herteroderaavenae)的發(fā)生具有抑制作用且增產(chǎn)效果顯著。黃菁華[48]發(fā)現(xiàn)，施用有機(jī)肥可以減少水稻潛根線蟲(Hirschmaniellaoryzae)的發(fā)生；常海娜[49]發(fā)現(xiàn)，氮肥減量施用可以減輕連作番茄的根結(jié)線蟲危害。張平珍等[50]研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)銀燕6號籽粒產(chǎn)量隨尿素施用量的增加而提高，超過此范圍反而降低。由此可見，氮肥施用量與作物產(chǎn)量呈拋物線關(guān)系，尋找最適施肥濃度可以降低成本，取得最大收益。

氮肥對作物抗病性因病原類型不同而有一定差異，并且受氣候、土壤和作物品種等因素影響。缺氮會提高番茄對灰霉病的敏感性，但會提高對丁香假單胞菌的抗性[51]。高溫高濕氣候條件下增施氮肥反而會加重油菜菌核病的發(fā)病率[52]。在加拿大的曼尼托巴，線蟲在黏土中隨著氮素的增加而減少，而在沙質(zhì)土壤中線蟲數(shù)量卻隨著氮素的增加而增加[53]。不同肥料的組合也有不同影響，在非洲加納，施用氮肥、磷肥或磷肥、鉀肥的黑豆莢地塊的病害高于未施肥地塊，但施用氮肥、鉀肥地塊的病害感染率低于未施肥地塊[54-55]。前人研究表明，寄主植物根系所分泌的高濃度木犀草素和槲皮素對根結(jié)線蟲具有抗性，分泌的激素玉米素對線蟲幼蟲具有吸引力[56]。將番茄的ERF-E2基因敲除后，根系分泌物對南方根結(jié)線蟲的吸引力顯著增強(qiáng)，證明該基因可能在植物抗線蟲機(jī)制中起重要作用[57]。因此，進(jìn)一步研究植物根系分泌物的成分，有針對性地科學(xué)施用肥料，集成和提升作物高產(chǎn)、高效、優(yōu)質(zhì)和環(huán)保的養(yǎng)分資源管理技術(shù)體系，對于有效控制大豆孢囊線蟲為害、促進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展具有重要意義。