歐陽樂飛，王林華，鄧高威，張慶起，高煥,2,4，閻斌倫,2,4

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005；3.連云港贛榆佳信水產(chǎn)開發(fā)有限公司，江蘇 連云港 222100；4.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇 南京 210014）

冷溫性、雌雄同株的條斑紫菜Pyropia yezoensis味道鮮美，營養(yǎng)成分豐富，對人體具有很高的食用和藥用價值[1]，是我國長江以北沿海地區(qū)重要的海藻栽培種之一[2]。近年來，全球紫菜種質(zhì)日趨枯竭以及國內(nèi)紫菜消費快速增長，推動了我國紫菜養(yǎng)殖方式的多樣化，促進(jìn)了紫菜養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

藻際微生物種類多且功能復(fù)雜，其中益生菌分泌維生素、生長素等可促進(jìn)藻體生長[3,4]，但是，在無機鹽缺乏時，藻際微生物與藻類共同競爭營養(yǎng)物質(zhì)，抑制藻體生長[5]。近兩年紫菜養(yǎng)殖范圍不合理擴大、工業(yè)發(fā)展、氣候環(huán)境變化，海區(qū)環(huán)境逐漸惡化，每年都有不同程度的爛菜發(fā)生。引起紫菜病害發(fā)生的原因主要有兩方面，一是病原菌侵染等生物因素，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、?？曝愄鼐–obetia marina）引起紫菜葉狀體細(xì)菌性紅爛病，綠斑病等[6,7]；另一方面，高溫、低鹽等物理環(huán)境因子的變化導(dǎo)致紫菜生理代謝紊亂，也可造成爛菜現(xiàn)象。陳玉婷[8]研究表明，高溫等理化脅迫會破壞紫菜內(nèi)膜系統(tǒng)，改變膜透性，加劇藻體活性氧上升，損傷各類機體。而藻體會上調(diào)氧化酶活性和丙二醛（MDA）及游離脯氨酸（Pro）等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來修復(fù)機體[9,10]，但是脅迫程度過高、時間較長，超過了藻類的自我修復(fù)能力則會迅速腐爛。

芽孢桿菌（Bacillus sp.）能夠產(chǎn)生抵抗特殊不利條件的芽孢，也是公認(rèn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌[11]。方文雅等[12]在溫州紫菜養(yǎng)殖區(qū)分離的芽孢桿菌，抑菌活性較強，可能在藻際微環(huán)境中具有調(diào)節(jié)作用。前期研究表明，藻際細(xì)菌Bacillus sp.LPyS1 在15℃可促進(jìn)條斑紫菜生長，提高總蛋白含量，對條斑紫菜抗氧化酶（超氧化物岐化酶SOD 和過氧化物酶POD）活性和脯氨酸Pro 的含量影響極小，是一株益生菌（另文發(fā)表）。本文通過研究22℃高溫脅迫下芽孢桿菌Bacillus sp.LPyS1 對條斑紫菜生長及生理的影響，以闡明Bacillus sp.LPyS1 為代表的藻際微生物在高溫下的功能變化及其生理作用，并為減少紫菜病害發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 條斑紫菜葉狀體

實驗用條斑紫菜葉狀體在2019 年12 月10 日采于連云港市贛榆區(qū)海頭鎮(zhèn)條斑紫菜養(yǎng)殖海區(qū)，洗凈晾干后，-20℃密封保存。實驗前取出樣品，于滅菌海水中復(fù)蘇24 h，挑選外觀特征上一致的紅褐色葉片，剪成1 cm2的小塊狀，依次用滅菌海水清洗3次、0.7%KI 溶液中浸泡10 min、再用滅菌海水清洗3 次。條斑紫菜復(fù)蘇培養(yǎng)后，對紫菜葉狀體進(jìn)行無菌處理，處理方法參考[13]，之后放入0.1%（W/V）的氨芐青霉素溶液中浸泡10 min，之后在組合抗生素（300 μg/mL 氨芐青霉素、100 μg/mL 卡那霉素、100 μg/mL 慶大霉素）中浸泡10 h 以上。用滅菌海水清洗3 次以上，將條斑紫菜葉片置于新鮮紫菜培養(yǎng)基（營養(yǎng)母液：100 g/L KNO3、10 g/L KH2PO4、2.5 g/L Fe-SO4、0.25 g/L MnSO4和20 g/L EDTA-Na2，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，使用時與滅菌海水以1∶1 000配制成營養(yǎng)海水）培養(yǎng)2 d 備用。培養(yǎng)條件：溫度15℃，鹽度30，光強3 500 lx，光周期12L∶12D，每24 h 更換1 次紫菜培養(yǎng)基，充氣。

1.1.2 芽孢桿菌

Bacillus sp.LPyS1 由本實驗室分離自條斑紫菜葉狀體表面，甘油管-80℃凍存。2019 年12 月10日從連云港海頭鎮(zhèn)紫菜養(yǎng)殖區(qū)采集海水與條斑紫菜，經(jīng)梯度稀釋后將紫菜振蕩液涂布于Zobell 2216E 海水培養(yǎng)基（酵母粉1 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鐵0.1 g，海水定容至1 000 mL，pH 7.6～8.0）中，37℃倒置培養(yǎng)24 h，按細(xì)菌菌落形態(tài)特征挑取不同單菌落，分區(qū)劃線3 次，顯微鏡下鏡檢后接種于甘油管-80℃保種。分離細(xì)菌統(tǒng)一編號（L 表示江蘇連云港，Py 表示條斑紫菜，S 表示振蕩法，相同處理方式獲得的不同菌株用數(shù)字1、2、3 表示，以此類推。如LPyS1 表示連云港條斑紫菜振蕩處理獲得的1 號細(xì)菌。37℃140 r/min 過夜活化培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)與活化培養(yǎng)條件一致，24 h 后離心去除培養(yǎng)液。沉淀清洗離心后，用條斑紫菜培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度約1×106cells/mL 備用。

1.2 方法

300 mL 紫菜培養(yǎng)基中接種0.2 g 無菌處理過的條斑紫菜葉狀體與約3×106cells/mL Bacillus sp.LPyS1，在溫度22℃、鹽度30、光強3 500 lx、光周期12L∶12D 和充氣條件下培養(yǎng)。在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 取樣，測定其相對生長率（RGR）、可溶性蛋白（soluble protein）、藻膽蛋白（phycobiliprotein）、Pro 和丙二醛（MDA）的含量，以及超氧化物岐化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性。以僅接種條斑紫菜葉狀體培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)條件與共培養(yǎng)組相同。

相對生長率（RGR）按照公式[14]：RGR（%/d）=（lnMt-lnM0）/t×100 計算；式中，M0為藻體的初始質(zhì)量（g），Mt為培養(yǎng)至第t 天時藻體的鮮重，稱量前用吸水紙將藻體表面培養(yǎng)液完全吸干；采用南京建成生物科技公司T-SOD 試劑盒（A001-1，羥胺法）和POD 測定試劑盒（A084-3，比色法）測定酶活；采用南京建成生物科技公司試劑盒（A003-3-1，微板法）測定MDA 含量；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[15]測定；采用南京建成生物科技公司試劑盒（A107-1-1，酸性茚三酮法）測定Pro 含量；參考高洪峰[16]的方法測定藻膽蛋白含量。各實驗設(shè)置3 個平行4 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 2018 和SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，以P<0.05 表示顯著性差異，P<0.01 表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫下芽孢桿菌對條斑紫菜生長的影響

22℃高溫脅迫下芽孢桿菌對條斑紫菜生長的影響見圖1。實驗期間，對照組條斑紫菜的RGR 呈上升趨勢，生物量持續(xù)增加；藻菌共培養(yǎng)組RGR 先上升后下降，在24～48 h 顯著高于對照組（P<0.05），72 h 低于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。培養(yǎng)4 d后，藻菌共培養(yǎng)組與對照組紫菜葉狀體顏色均變淡，開始出現(xiàn)爛菜現(xiàn)象，兩組培養(yǎng)體系逐漸變渾濁，其中共培養(yǎng)組腐爛程度高于對照組。

2.2 高溫下芽孢桿菌對條斑紫菜蛋白合成的影響

兩組條斑紫菜的RPE（A1）、RPC（A2）和APC（A3）3 種色素蛋白含量的整體變化相似，共培養(yǎng)組的3 種藻膽蛋白含量在6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h時均顯著高于對照組（P<0.05），12 h 達(dá)最大值。共培養(yǎng)組的藻膽蛋白含量RPE 為6.7 mg/g，RPC 為5.7 mg/g，APC 為4.1 mg/g；對照組藻膽蛋白含量中RPE為5.1 mg/g，RPC 為4.8 mg/g，APC 為2.9 mg/g（圖2）。但是，在24 h 時共培養(yǎng)組藻膽蛋白含量均顯著低于對照組（P<0.05），表明芽孢桿菌一定程度上促進(jìn)了條斑紫菜的藻膽蛋白合成與積累。

2.3 高溫下芽孢桿菌對條斑紫菜抗氧化性的影響

22℃高溫脅迫下芽孢桿菌對條斑紫菜抗氧化指標(biāo)的影響主要體現(xiàn)在SOD、POD 酶活性及MDA含量的變化。圖3-B1所示，藻菌共培養(yǎng)組和對照組SOD 酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在24 h 時達(dá)最高，分別為631.36 U/g 組織濕重和573.71 U/g組織濕重，且差異顯著（P<0.05），在0 h 與72 h 差異不顯著（P＞0.05）。

圖3-B2表明，共培養(yǎng)組和對照組POD 酶活性也呈先上升后下降再上升的趨勢，24 h 時POD 酶活性顯著上升（P<0.05）至最高，分別為31.19 U/mg 和11.33 U/mg，72 h 時二者又顯著上升（P<0.05），但共培養(yǎng)組酶活性仍高于對照組。

如圖3-B3表明，藻菌共培養(yǎng)組和對照組的MDA 含量均呈先上升后下降再上升的趨勢，在6 h達(dá)最高值，分別為141.97 nmol/g 和118.47 nmol/g，共培養(yǎng)組在6 h、12 h 和72 h 顯著高于對照組（P<0.05）。以上結(jié)果表明，高溫脅迫下兩組紫菜均受到了不同程度的氧化脅迫，且藻菌共培養(yǎng)組受到了較大的活性氧脅迫。

2.4 高溫下芽孢桿菌對條斑紫菜滲透性的影響

22℃高溫脅迫下，芽孢桿菌對條斑紫菜滲透指標(biāo)的影響主要體現(xiàn)在可溶性蛋白、Pro 以及藻膽蛋白含量的變化上。由圖4-C1可知，藻菌共培養(yǎng)組和對照組可溶性蛋白含量均呈先上升后下降再上升的趨勢，共培養(yǎng)組在12 h 達(dá)到最高，為19.68 mg/g，顯著高于對照組（P<0.05）；在24 h 與48 h 顯著低于對照組（P<0.05），24 h 達(dá)到最低，為8.22 mg/g；在0 h、6 h 與72 h 兩組無顯著性差異（P<0.05）。

從圖4-C2可見，對照組Pro 呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，12 h 達(dá)到最大，為51.87 μg/g；藻菌共培養(yǎng)組Pro 含量在0～6 h 快速上升，隨后下降，到24 h 達(dá)到最低，為15.39 μg/g，顯著低于對照組（P<0.05），從24 h 至72 h 持續(xù)上升，72 h 達(dá)到實驗期內(nèi)最高，為58.78 μg/g，顯著高于對照組（P<0.05）。共培養(yǎng)組與對照組Pro 含量在24 h 達(dá)到極大差值，為26.77 μg/g。Pro 與可溶性蛋白都是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，表明共培養(yǎng)組在24 h 后分泌了更多的可溶物質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓以適應(yīng)高溫脅迫環(huán)境[17]

3 討論

微生物與溫度是影響紫菜生長狀況的重要因素[18]。選育生長快、耐高溫的優(yōu)良品系有利于解決目前紫菜種質(zhì)資源退化問題，而通過益生菌增強紫菜抗逆性、促進(jìn)紫菜生長，有利于減少紫菜病害頻發(fā)等問題。楊華田等[19]研究發(fā)現(xiàn)：芽孢桿菌對壇紫菜RGR 的影響是前期迅速上升，而后期緩慢降低。張元等[20]發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下野生型紫菜出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)外溢、逐漸壞死等現(xiàn)象。本研究中，22℃下條斑紫菜RGR 在0～48 h 迅速上升，芽孢桿菌增強了條斑紫菜抗逆性，促進(jìn)了條斑紫菜RGR 上升，隨后藻體顏色變淡，96 h 后出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，對照組的藻體腐爛程度更為劇烈。而牟宗娟[21]研究表明：在22℃海水下條斑紫菜在36 h 開始病爛，這進(jìn)一步表明芽孢桿菌可增強條斑紫菜的抗逆性。在高溫脅迫下，條斑紫菜生長和細(xì)胞內(nèi)部分生理生化指標(biāo)存在一定的變化規(guī)律。王文磊等[22]根據(jù)光合參數(shù)結(jié)果觀察到，對紫菜附生菌施加脅迫時，菌體受到顯著的影響，但在正常條件下幾乎完全恢復(fù)，表明菌體對紫菜的抗逆性影響程度與菌體自身狀態(tài)密切相關(guān)。前期實驗發(fā)現(xiàn)，在15℃下菌株Bacillus sp.LPyS1 對條斑紫菜具有促生長作用，與條斑紫菜形成互利共生的關(guān)系，這與熊玉琴等研究結(jié)果一致[23]，而在22℃高溫下Bacillus sp.LPyS1 對條斑紫菜造成了一定程度的脅迫，表現(xiàn)在48 h 后隨著芽孢桿菌對條斑紫菜抗逆性的影響作用逐漸降低，條斑紫菜RGR 緩慢下降。宋丹丹等[24]研究發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌Pseudoalteromonas sp.NPyS3 對顆石藻（Erdschreiber）生長的影響遠(yuǎn)高于非生物因素的影響，由此推測Bacillus sp.LPyS1 可能通過分泌某些代謝產(chǎn)物而增強了條斑紫菜抗逆性，從而影響RGR 變化，高溫會影響藻類的生長與生理組分以及細(xì)菌的生長和代謝，改變微生物菌群結(jié)構(gòu)[25]，影響條斑紫菜的生長。

高溫脅迫使藻體內(nèi)活性氧含量上升，使不飽和脂肪酸過氧化為MDA，破壞膜結(jié)構(gòu)的完整性[26,27]。本研究結(jié)果表明：0～72 h 內(nèi)，酶抗氧化物（如SOD、POD）和非酶抗氧化分子（如MDA、藻膽蛋白）先上升后下降，這與條斑紫菜RGR 的變化趨勢一致，其中0～48 h 芽孢桿菌對條斑紫菜抗逆能力的影響遠(yuǎn)大于高溫脅迫的影響。SOD、POD 活性的變化趨勢與Contreras-Porcia 等對P.columbina 的研究結(jié)果一致[28]，這表明在實驗前期條斑紫菜受到較大的脅迫，但是，RGR 依然處于快速上升狀態(tài)，說明期間芽孢桿菌極大地增強了條斑紫菜的抗逆性，發(fā)揮了益生作用。共培養(yǎng)組MDA 含量在6 h 顯著上升達(dá)到最高值，為141.97 nmol/g，高于張元所測定耐高溫型與野生型壇紫菜MDA 的含量[29]，而后下降并處于相對平穩(wěn)狀態(tài)，這指示芽孢桿菌有利于提升條斑紫菜抗逆能力。本研究表明，高溫有利于促進(jìn)條斑紫菜藻膽蛋白合成，這與黃林彬等[30]測定的葉綠素a、藻膽蛋白含量變化結(jié)果相同。

藻體為減小細(xì)胞損傷，通過調(diào)節(jié)滲透壓來調(diào)整，積累脯氨酸、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物，提升細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力[31]。與對照組相比，共培養(yǎng)組Pro、可溶性蛋白在12 h、24 h 和48 h 時均具有顯著性差異，這與賀亮研究高溫脅迫下半葉馬尾藻（Sargassum hemiphyllum）的生理響應(yīng)變化一致[32]，表明芽孢桿菌對條斑紫菜的抗逆性具有重要影響，由此推測高溫脅迫下，通過與芽孢桿菌等益生菌的共培養(yǎng)增強條斑紫菜的抗逆性，為條斑紫菜抗高溫和高產(chǎn)新品種選育奠定實驗基礎(chǔ)。前期實驗研究表明，24 h是Bacillus sp.LPyS1 對數(shù)生長期與形成穩(wěn)定生物膜的平臺期，推測22℃下促使芽孢桿菌在條斑紫菜表面形成了穩(wěn)定的生物膜，導(dǎo)致條斑紫菜與環(huán)境物質(zhì)交換的難度增加，造成后期條斑紫菜葉狀體腐爛。

綜上所述，在培養(yǎng)初期，Bacillus sp.LPyS1 能夠促進(jìn)條斑紫菜的生長，但是，隨著培養(yǎng)時間的延長，條斑紫菜的抗逆性及益生作用會變化。在與高溫的共同作用下，后期出現(xiàn)了腐爛現(xiàn)象，可能是22℃高溫下芽孢桿菌對條斑紫菜的抗逆能力隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低；或是22℃高溫下芽孢桿菌在條斑紫菜表面快速增殖形成的生物膜影響了藻體與外界進(jìn)行物質(zhì)交換，這有待進(jìn)一步驗證。本實驗通過建立藻-菌共培養(yǎng)體系為進(jìn)一步揭示條斑紫菜抗高溫變化規(guī)律和培育抗高溫紫菜新品種提供了一定參考。在高溫天氣下，應(yīng)實時了解條斑紫菜養(yǎng)殖海域的微生物群落組成與功能變化，及時發(fā)現(xiàn)紫菜養(yǎng)殖水環(huán)境中的微生物脅迫隱患，全面合理地預(yù)防條斑紫菜病害發(fā)生。