智艷芳，劉 慧，張 婷，班振英，張 威，曾憲旭

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

子宮頸癌是女性癌癥死亡的第四大原因，全球每年約有50萬宮頸癌新發(fā)病例和30萬死亡病例[1]。目前，消除宮頸癌已成為國際社會共同關(guān)注的熱點。在我國，宮頸癌的發(fā)病不容忽視，2018年中國宮頸癌新發(fā)病例近11萬，死亡病例近5萬[2]。盡管高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papilloma virus，HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的重要危險因素[3-4]，但截止目前，宮頸癌的發(fā)病機制仍不十分明確。近年來研究顯示，陰道微生態(tài)失衡很可能參與了宮頸病變的發(fā)生及發(fā)展[5-6]。

陰道微生態(tài)是由陰道解剖結(jié)構(gòu)、周期性的內(nèi)分泌變化、陰道局部免疫系統(tǒng)和陰道內(nèi)微生物菌群組成，陰道正常微生物菌群是陰道微生態(tài)的核心內(nèi)容[7]。研究表明，微生物群在許多器官中具有促癌作用，如幽門螺桿菌感染可能導致胃炎、胃潰瘍、胃黏膜萎縮及最終胃癌的發(fā)生[8]；結(jié)腸內(nèi)菌群與宿主的相互作用可能導致結(jié)、直腸癌的發(fā)生[9-10]。目前，女性生殖道內(nèi)大量的細菌微生物群落是否具有類似的促癌作用尚不明確。因此，本研究比較并分析了經(jīng)宮頸薄層液基細胞學檢查(thinprep cytologic test，TCT)異常與正常者的陰道微生態(tài)變化及HR-HPV感染情況，旨在探討陰道微生態(tài)與HR-HPV感染及宮頸病變發(fā)生的關(guān)系，以期為宮頸癌的預防及治療提供有效的參考依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年7月到2021年3月就診于鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦科門診行TCT、HR-HPV及陰道微生態(tài)檢測的患者1 200例，年齡為20～55歲，平均年齡(35.28±8.34)歲?；颊咧蠺CT結(jié)果陽性600例為陽性組，其中未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)組300例、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)組150例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)組100例、宮頸鱗癌(squamous cell carcinoma，SCC)組50例。TCT結(jié)果陰性600例為陰性組。

1.2 納入和排除標準

納入標準：①年齡在20～55歲，有性生活史；②月經(jīng)規(guī)律，檢查時未絕經(jīng)；③檢查前3天未進行陰道沖洗、用藥及性行為；④檢查前2周無抗生素和激素用藥史；⑤自愿接受宮頸HPV、TCT篩查和陰道微生態(tài)檢測。

排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②有宮頸錐切或全子宮切除史；③有其他生殖器官感染性疾?。虎芎喜乐氐男?、肝、腎、造血系統(tǒng)等疾病及精神??；⑤使用免疫抑制劑，患有各種免疫性疾病或惡性腫瘤等免疫功能低下者。

該研究經(jīng)鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準(2017醫(yī)倫審第88號)。

1.3 標本的采集

陰道分泌物的采集：窺陰器暴露宮頸，將無菌棉棒置于陰道上1/3側(cè)壁輕輕刮取3～5次，所采樣本置入塑料軟管中盡快檢測。

宮頸脫落細胞的采集：窺陰器暴露宮頸，用TCT專用刷取材，將刷頭中間部分深入宮頸內(nèi)口，兩側(cè)抵住宮頸外口，順時針旋轉(zhuǎn)3～5圈，將刷頭放入裝有細胞保存液的樣品管中充分涮洗，擰緊瓶蓋，貼好標簽送檢TCT及HR-HPV。

1.4 臨床實驗室的檢測

1.4.1 TCT的檢查

由鄭州大學第三附屬醫(yī)院病理科3名經(jīng)驗豐富的細胞病理學醫(yī)生根據(jù)宮頸細胞學The Bethesda System 2014版報告系統(tǒng)進行診斷。細胞學結(jié)果具體分類為：ASCUS、LSIL、HSIL和SCC。

1.4.2 HR-HPV的檢測

嚴格按HR-HPV E6/E7(16、18/45)mRNA試劑盒使用說明書進行操作，檢測HPV16、HPV18/45型，通過信號擴增法進行定量檢測。結(jié)果判讀標準：根據(jù)信號-截點(S/CO)比值進行結(jié)果判讀，S/CO值>0.5判讀為陽性；反之則判讀為陰性。

1.4.3 宮頸陰道分泌物的檢測

將分泌物濕片鏡檢，并用陰道炎聯(lián)合檢測試劑盒檢測分泌物中的過氧化氫、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶及pH值，嚴格按照說明書操作。過氧化氫<2μmol/L為陽性，唾液酸苷酶≥7IU/L為陽性，脯氨酸氨基肽酶≥1.1IU/L為陽性，白細胞酯酶≥9IU/L為陽性，乙酰氨基葡萄糖苷酶≥0.1IU/mL為陽性，pH值檢測正常范圍為3.8～4.5，乳酸桿菌高倍鏡下≥100個為陽性。

細菌性陰道炎(bacterial vaginosis，BV)判斷標準采用Amsel法：①患者陰道分泌物質(zhì)稀??；②陰道分泌物pH值>4.5；③陰道分泌物中存在線索細胞，將l滴生理鹽水加入到陰道分泌物中，使用高倍鏡觀察，視野中線索細胞超過20%；④將1滴10%的氫氧化鉀加入分泌物中，出現(xiàn)腥臭味。以上4項中出現(xiàn)任意3項即診斷為BV。

結(jié)果判讀：清潔度Ⅰ、Ⅱ度為正常，Ⅲ、Ⅳ度為異常；乳酸桿菌、過氧化氫陽性為正常，陰性為異常；加德納菌、真菌、BV、滴蟲陰性為正常，陽性為異常；雜菌、白細胞酯酶+及以內(nèi)為正常，2+及以上為異常；陰道pH值3.8～4.5為正常，pH>4.5或<3.8為異常；唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶陰性為正常，陽性為異常。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用例數(shù)(百分率)[n(%)]表示，用R×C卡方(χ2)檢驗，用Logistic回歸模型統(tǒng)計微生態(tài)指標與宮頸病變的比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)，并評估陰道微生態(tài)指標及HR-HPV感染在宮頸病變發(fā)生中的交互作用，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 陽性組與陰性組陰道微生態(tài)各項指標與宮頸病變的關(guān)系

與陰性組相比，陽性組乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率均顯著增高，經(jīng)卡方檢驗差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；以因變量為TCT，自變量為陰道微生態(tài)各指標及HR-HPV，通過Logistic回歸分析得出：乳酸桿菌異常時宮頸病變發(fā)生的風險是其正常時的2.319倍、過氧化氫異常時宮頸病變發(fā)生的風險是其正常時的2.201倍、白細胞酯酶異常時宮頸病變發(fā)生的風險是其正常時的3.376倍、HR-HPV感染時宮頸病變發(fā)生的風險是其非感染時的7.114倍，見表1。

表1 陽性組與陰性組陰道微生態(tài)各項指標異常率及HR-HPV感染率的比較[n(%)]Table 1 Comparison of abnormal rates of various vaginal microecological indicators and infection rate of HR-HPV between the positive group and the negative group[n(%)]

因素組別例數(shù)(n)異常例數(shù)χ2POR(95%CI)白細胞酯酶陽性組600319(53.1)98.7140.0003.376(2.644～4.310)陰性組600151(25.2)唾液酸苷酶陽性組600157(26.2)0.1090.7411.045(0.806～1.353)陰性組600152(25.3)脯氨酸氨基肽酶陽性組600154(25.6)0.3610.5481.084(0.834～1.408)陰性組600145(24.2)乙酰氨基葡萄糖苷酶陽性組600152(25.3)0.4510.5021.094(0.841～1.424)陰性組600142(23.7)HR-HPV陽性組600403(67.2)243.8920.0007.114(5.503～9.197)陰性組600134(22.3)

2.2 不同級別宮頸病變陰道微生態(tài)指標異常率及HR-HPV感染率的比較

將陽性組600例宮頸病變患者分為ASCUS組、LSIL組、HSIL組和SCC組；其乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率隨宮頸病變級別的加重而明顯增高，經(jīng)趨勢χ2檢驗差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

再將陽性組600例宮頸病變患者進一步分為HSIL+組(包括SCC和HSIL)和LSIL-組(包括LSIL和ASCUS)，HSIL+組的乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率均顯著高于LSIL-組，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 不同級別宮頸病變中乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率的比較[n(%)]Table 2 Comparison of abnormal rates of Lactobacillus,hydrogen peroxide,leukocyte esterase and infection rate of HR-HPV in different grades of cervical lesions[n(%)]

表3 HSIL+組與LSIL-組的乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率的比較[n(%)]Table 3 Comparison of abnormal rates of Lactobacillus,hydrogen peroxide,leukocyte esterase and infection rate of HR-HPV in the HSIL+ group and the LSIL- group[n(%)]

2.3 HR-HPV感染與陰道微生態(tài)指標在宮頸病變發(fā)生中的交互作用

以乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶正常，且HR-HPV陰性者為對照，用Logistic回歸模型分析結(jié)果顯示：HR-HPV感染與乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常均存在交互作用，HR-HPV感染與乳酸桿菌異常同時存在的宮頸病變發(fā)生風險大于HR-HPV感染或乳酸桿菌異常單獨存在時，HR-HPV感染與過氧化氫異常同時存在的宮頸病變發(fā)生風險大于HR-HPV感染或過氧化氫異常單獨存在時，HR-HPV感染與白細胞酯酶異常同時存在的宮頸病變發(fā)生風險大于HR-HPV感染或白細胞酯酶異常單獨存在時，見表4。

表4 乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常與HR-HPV感染在宮頸病變發(fā)生中的交互作用Table 4 Interaction of abnormalities of Lactobacillus,hydrogen peroxide and leukocyte esterase with HR-HPV infection in the occurrence of cervical lesions

3 討論

目前認為在宮頸病變的發(fā)生發(fā)展過程中還有其他重要因素參與其中，且很有可能在HPV感染中也發(fā)揮重要作用，而陰道微生態(tài)失衡成為近年來研究的熱點之一。相關(guān)研究表明，陰道微生態(tài)與HPV感染甚至于宮頸病變的演變之間存在著密切的關(guān)系[11]。

3.1 乳酸桿菌和過氧化氫與宮頸病變的關(guān)系

正常的陰道微生態(tài)系統(tǒng)在預防女性生殖道感染中起著重要作用。目前對于陰道微生態(tài)系統(tǒng)的評價包括陰道病原微生物形態(tài)學檢測和微生物代謝產(chǎn)物及酶等功能學檢測[12-13]。盡管女性生殖道內(nèi)微生物種類繁多，但主要以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌群。乳酸桿菌可以產(chǎn)生乳酸，使陰道pH值保持在3.8～4.5。此外，陰道乳酸桿菌還可以產(chǎn)生過氧化氫、細菌素、類細菌素等物質(zhì)，可殺滅及抑制其他病原菌的生長，保持其在陰道菌群中的優(yōu)勢地位，借此維持陰道微生態(tài)的平衡。陰道內(nèi)一旦乳酸桿菌減少，其所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)也會減少，而加德納菌及雜菌數(shù)量就會隨之增加，最終導致陰道微生態(tài)失衡；而陰道微生態(tài)一旦失衡，外來微生物便可輕易入侵并導致生殖道內(nèi)的炎癥。本研究顯示：在宮頸病變患者中，陰道分泌物中乳酸桿菌、過氧化氫的異常率明顯高于正常者，且隨宮頸病變的加重，二者的異常率呈上升趨勢，與宮頸病變發(fā)生風險顯著關(guān)聯(lián)。Korshunov等[14]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者陰道內(nèi)乳酸桿菌的比例減少，各種炎癥致病菌的比例增加。逯彩虹等[15]研究結(jié)果表明，宮頸癌發(fā)生與陰道黏膜乳酸桿菌減少、陰道菌群失調(diào)相關(guān)。上述報道與本研究結(jié)果一致?？梢娙樗釛U菌具有很好的抗感染和預防宮頸病變的作用；而乳酸桿菌的減少、微生態(tài)的失衡，勢必會增加HPV感染的機會及宮頸病變發(fā)生的幾率。此外，有研究表明，陰道微生態(tài)內(nèi)過氧化氫濃度降低與宮頸上皮內(nèi)瘤變相關(guān)[16]。這與本研究結(jié)果一致。由此可見，通過測定陰道微生態(tài)中乳酸桿菌的數(shù)量、過氧化氫的濃度評估陰道微生態(tài)的平衡狀態(tài)，對HPV感染及宮頸病變的發(fā)生具有一定的預測作用；而對陰道微生態(tài)失衡進行積極的干預，則可以預防HPV感染及宮頸病變的發(fā)生。盡管有研究表明，BV與宮頸上皮內(nèi)瘤變相關(guān)[17]；但本研究結(jié)果卻顯示，BV與宮頸病變的發(fā)生無明顯關(guān)聯(lián)(P=0.274)。

3.2 白細胞酯酶與宮頸病變的關(guān)系

白細胞酯酶是人體白細胞產(chǎn)生的一種特異性酶類，白細胞酯酶增多是白細胞增多且結(jié)構(gòu)遭到破壞的直接證據(jù)，反映局部上皮黏膜組織浸潤受損與強烈炎癥反應。白細胞酯酶只存在于中性粒細胞內(nèi)，因此白細胞酯酶可以反映白細胞的存在，但白細胞并不能反映白細胞酯酶的存在。陰道微生態(tài)檢測包括白細胞的測定和白細胞酯酶的測定。本研究顯示，白細胞酯酶異常率在宮頸病變患者中顯著升高，且隨宮頸病變的加重，其異常率呈明顯上升趨勢，與宮頸病變發(fā)生風險有關(guān)。這表明白細胞酯酶的異常很可能參與了HPV感染及宮頸病變的發(fā)生發(fā)展。與此同時，本研究并未發(fā)現(xiàn)白細胞陽性率在細胞學陰性組與陽性組間具有顯著性差異。有研究表明白細胞酯酶與宮頸癌間質(zhì)浸潤相關(guān)[18]；但目前鮮見有關(guān)白細胞酯酶與宮頸病變關(guān)系的研究，其在宮頸病變發(fā)生中的相關(guān)作用尚待進一步探討。

本研究顯示，陽性組的HR-HPV感染率顯著高于陰性組，且隨宮頸病變的加重，感染率顯著上升，HR-HPV感染時宮頸病變發(fā)生的風險是其非感染時的7.114倍(95%CI：5.503～9.197)。可見，HR-HPV感染是宮頸病變發(fā)生中最重要的原因。有研究提示，陰道微生態(tài)某些指標的失衡可以促進HR-HPV感染的發(fā)生[19]，進而導致宮頸癌的發(fā)生。李俐等[20]研究發(fā)現(xiàn)，HPV16感染及過氧化氫、唾液酸苷酶陽性對宮頸病變的發(fā)生具有交互作用。然而，過氧化氫、唾液酸苷酶陽性與HR-HPV感染對宮頸病變發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生怎樣的影響尚未明確。本研究通過Logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，HR-HPV感染與乳酸桿菌、過氧化氫及白細胞酯酶的異常在宮頸病變的發(fā)生中均存在顯著的交互作用，提示在考慮多種因素的基礎上，如果HR-HPV感染與乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常同時存在，則會增加宮頸病變的發(fā)生風險。因此，保持陰道微生態(tài)平衡不僅可以預防或者減少HR-HPV感染的發(fā)生，還可能會加速HPV病毒的清除，阻止宮頸病變的進展，甚至是促進宮頸病變回退正常?？梢姡贖R-HPV感染與宮頸病變患者的治療中，積極糾正陰道微生態(tài)紊亂顯得尤為重要。

總之，陰道微生態(tài)中乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常與HR-HPV感染存在交互作用，與宮頸病變發(fā)生密切相關(guān)。積極糾正陰道微生態(tài)失衡可能為HR-HPV感染及宮頸病變的防治提供新的診療思路。但本研究的樣本量有限，且病例具有一定的地域局限性。后期將進一步擴大樣本量，篩選與HR-HPV持續(xù)感染及病變進展過程關(guān)系密切的因子進行信號通路的研究，為指導HR-HPV持續(xù)感染后的處理及預防宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的進展提供更多依據(jù)。