壯藥白桐樹多酚提取工藝優(yōu)化

姜 曉， 王志堯， 王 韜， 馬艷妮， 常 霞， 王卓雅

（1.鄭州云德生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002； 2.河南省納普生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002）

白桐樹Claxylon indicum（Reinw.ex BL）Hassk在壯醫(yī)藥書籍和方劑中的藥名為“美巧懷”，《廣西民族藥簡編》《壯族民間用藥選編》《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》等有書籍中均記載白桐樹能“祛風(fēng)毒，除濕毒，散瘀腫，調(diào)龍路，通水道，調(diào)谷道，用于發(fā)旺（痹證）”. 另外，《生草藥性備要》《本草求原》《全國中草藥匯編》《中藥大辭典》、1977年版《中國藥典》一部、《中華本草》《中藥制劑匯編》、廣州部隊編《常用中藥手冊》等中醫(yī)藥書籍均記載白桐樹有“祛風(fēng)除濕、散瘀止痛”之效，可用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的防治［1-5］.但目前對于白桐樹的研究多數(shù)集中于解熱鎮(zhèn)痛、抑菌作用、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，而有關(guān)白桐樹在抗RA方面研究鮮見報道. 作者前期研究發(fā)現(xiàn)白桐樹酚類成分明顯可改善CIA模型小鼠的各種體征.

白桐樹屬植物含酚類、生物堿、二萜、三萜、皂苷等化學(xué)成分［7-10］，其中酚類（主要是木脂素、新木脂素、香豆素）是該屬植物主要成分［11］，也是有效成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等多種活性. 目前，關(guān)于白酮樹酚類成分的研究較少，并未有明確的方法來提取白桐樹的酚類成分，這制約了常用民族藥白桐樹更廣泛的臨床應(yīng)用.因此，研究開發(fā)一種簡便快捷的白桐樹酚類化合物提取分離方法，對于深入研究白桐樹酚類成分抗RA作用的物質(zhì)基礎(chǔ)以及充分開發(fā)和利用壯藥白桐樹資源具有重要意義.

沒食子酸是一種常見多酚類物質(zhì)，以沒食子酸為代表的多酚類化合物在堿性溶液中可將鎢鉬酸還原成藍色化合物，該類成分在760 nm 左右處有最大吸收，且吸收值與多酚化合物含量成正比，因此可以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量多酚類成分的總含量［12-15］. 因此，本課題以多酚含量為指標(biāo)，對照品為沒食子酸，采用Folin-Ciocalteu 比色法測定白桐樹中的多酚含量，再通過提取時間、提取次數(shù)及溶劑體積進行單因素實驗，最后再通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝.

1 材料與方法

1.1 儀器

T9紫外可見分光光度計；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；生物安全柜（Thermo Scientific）；進口二氧化碳培養(yǎng)箱NBS Galaxy170s（Eppendorf）；離心機（Cence湘儀TDZ5-WS）；酶標(biāo)儀（Bio-rad，型號Imark）.

1.2 材料試劑

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號110831-201605）；福林酚（北京索萊寶科技有限公司，批號921P037）；無水碳酸鈉（國產(chǎn)分析純）；甲醇（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號2021年030113）；乙醇（天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，批號2020年112040）；白桐樹藥材購自河南禹州四季青藥材行.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

精密稱量沒食子酸對照品10.86 mg，并加入適量蒸餾水定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.108 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL容量瓶中，再量取6 mL蒸餾水，搖勻后用移液槍吸取0.5 mL福林酚試劑，搖勻并等待1 min，再用移液槍吸取1.5 mL的碳酸鈉溶液（75 g/L），混勻后用蒸餾水定容至刻度線. 在75 ℃下加熱10 min，待冷卻后在760 nm 下測定吸光度，得到回歸方程Abs=0.998 7×c+0.026 42（R2=0.998 7）.

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 穩(wěn)定性實驗

稱量樣品0.2 g至錐形瓶中，加入25 mL的蒸餾水超聲30 min，共提取3次，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL以下，用蒸餾水定容至50 mL. 各吸取1～10 mL容量瓶中，再加入6 mL水，0.5 mL福林酚試劑混勻，1 min后加入1.5 mL碳酸鈉試劑（75 g/L）混勻后定容，在75 ℃下加熱10 min冷卻后在760 nm 下測量0、2、4、6 h后吸光度. RSD=1.56%，所以樣品的穩(wěn)定性較好.

1.4.2 精密度實驗

按照1.4.1步驟制作樣品溶液，重復(fù)測定六次吸光度，在760 nm下測定吸光度，RSD=0.02%，表明精密度較優(yōu).

1.4.3 重復(fù)性實驗

按照1.4.1步驟制作六份供試品溶液，在760 nm下測定吸光度，RSD=4.07%，表明重復(fù)性較好.

1.4.4 加樣回收率實驗

按照1.4.1 步驟制作一份供試品溶液，量取9 份1 mL 的供試品溶液到10 mL 的容量瓶中，加入0.1、0.2、0.3 mL 的沒食子酸對照品溶液，然后再依次加入6 mL水、0.5 mL福林酚混勻，1 min后吸取1.5 mL 碳酸鈉溶液（75 g/L）到容量瓶中，混勻后在75 ℃下加熱10 min，待冷卻后在760 nm下測吸光度. 加樣回收率平均值為98.10%，RSD=1.72%.

1.5 單因素影響實驗與響應(yīng)面法

分別以溶劑體積、超聲時間和提取次數(shù)為單因素影響實驗變量，根據(jù)提取多酚含量（質(zhì)量比，單位μg/g），選出最適宜的參數(shù)，根據(jù)得出參數(shù)設(shè)置響應(yīng)面法優(yōu)化工藝的變量和水平，具體實驗情況見下文.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響實驗結(jié)果

2.1.1 溶劑體積的篩選

稱取0.2 g藥材，分別加入10、25、50、100、150 mL 的蒸餾水，提取兩次，將提取所得的濾液混合，然后濃縮至50 mL 以下，再用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中. 各吸取1～10 mL 容量瓶中，再量取6 mL 水放入內(nèi)，然后用移液槍吸取0.5 mL的福林酚試劑混勻，1 min 后用移液槍加入1.5 mL 碳酸鈉試劑（75 g/L）混勻后定容，在75 ℃下加熱10 min，冷卻后在760 nm 下測吸光度. 結(jié)果如圖1，可知溶劑體積在100 mL下多酚含量（723.19 μg/g）最大.

圖1 溶劑體積對提取物中多酚含量的影響Fig.1 Effect of solvent volume on polyphenol content in extract

2.1.2 提取次數(shù)的篩選

稱取0.2 g藥材，加入25 mL蒸餾水，分別提取1、2、3、4、5次，濾液定容至50 mL容量瓶，按照2.1.1的方法測吸光度. 結(jié)果如圖2，提取4次時多酚含量820.9 μg/g最大.

圖2 提取次數(shù)對提取物中多酚含量的影響Fig.2 Effect of extraction times on polyphenol content in extract

2.1.3 超聲時間的篩選

稱取0.2 g 藥材，加入25 mL 蒸餾水，提取2 次，超聲時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h. 濾液混勻后定容至50 mL容量瓶，按照2.1.1的方法測吸光度，結(jié)果如圖3，超聲時間2 h多酚含量（735.29 μg/g）最大.

圖3 超聲時間對提取物中多酚含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polyphenol content in extract

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

從單因素影響實驗的結(jié)論中得到最優(yōu)的溶劑體積為100 mL左右，超聲時間為2 h左右，提取次數(shù)為4 次左右，為了進一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)將采用響應(yīng)面法.

三個自變量為：A（溶劑體積）、B（超聲時間）、C（提取次數(shù)）；響應(yīng)值為多酚含量；設(shè)置三水平因素，如表1所示，然后根據(jù)這三個變量和三個水平進行響應(yīng)面法實驗設(shè)計.

表1 白桐樹多酚提取工藝優(yōu)化實驗水平與因素Tab.1 Experimental levels and factors of polyphenol extraction process optimization of Claxylon indicum

2.2.1 模型方差分析

采用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)，白桐樹多酚提取實驗結(jié)果見表2.

表2 白桐樹多酚提取工藝優(yōu)化實驗結(jié)果Tab.2 Results of optimization of polyphenol extraction process of Claxylon indicum

使用Design expert.7.0軟件可得到三因素的方程模型：

式中：E為多酚含量；A為溶劑體積；B為超聲時間；C為提取次數(shù).

由下表3方差分析表可知P＜0.000 1，該模型顯著，R2為0.997 5；由F值可知，三個因素A、B、C對于多酚含量的影響大小順序為B（超聲時間）＞A（溶劑體積）＞C（提取次數(shù)），A2、B2、C2、AB、AC、BC交互影響極為顯著，因此，提取工藝的參數(shù)對多酚含量的影響較大.

表3 方差分析表Tab.3 ANOVA of regression analysis

2.2.2 響應(yīng)面分析

三因素A（溶劑體積）、B（超聲時間）、C（提取次數(shù)）交互影響如圖4～圖6. 由圖4（a）、圖5（a）、圖6（a）的等高線圖可知當(dāng)A（溶劑體積）、B（超聲時間）、C（提取次數(shù)）取值較小時等高線密度較大，而當(dāng)取值較大時等高線密度小，因此在三因素取值較小時對多酚含量的影響較為顯著，而當(dāng)取值較大時對多酚含量的影響較??；由圖4（b）、圖5（b）、圖6（b）的響應(yīng)面可知，當(dāng)三因素取值較小時他們的曲線較陡，而當(dāng)取值較大時曲線較為平緩，因此證明當(dāng)取值較小時對多酚含量的影響較大，而取值較大時對多酚含量的影響較小，與等高線圖分析結(jié)果一致.

圖4 E=f（A，B）的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of E=f（A，B）

圖5 E=f（A，C）響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of E=f（A，C）

圖6 E=f（B，C）響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of E=f（B，C）

經(jīng)過該實驗，測得最優(yōu)的工藝提取參數(shù)為：溶劑體積81.59 mL、超聲時間2.07 h，提取次數(shù)4.29 次，這樣的參數(shù)下得到的多酚含量最好，而在單因素影響實驗中預(yù)測參數(shù)：溶劑體積100 mL、超聲時間2 h、提取次數(shù)4次與最終的理論值恰好符合，證明該實驗結(jié)果與預(yù)測值有很好的擬合性，在該提取工藝的參數(shù)下可以獲得較優(yōu)的多酚含量值.

3 結(jié)論

本研究以多酚含量為指標(biāo)，對照品為沒食子酸，采用Folin-Ciocalteu 比色法測定白桐樹中的多酚含量，再通過提取時間、提取次數(shù)及溶劑體積進行單因素實驗，最后再通過響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最佳的提取工藝為：樣品的溶劑為水，提取時間為2 h，提取次數(shù)為5次，溶劑體積為150 mL. 優(yōu)化的提取工藝操作簡單、重復(fù)性好，對于壯藥白桐樹多酚的有效提取具有一定的參考價值.