有機酸Fe2+與無機酸Fe2+馴化的保加利亞乳桿菌發(fā)酵特性的比較分析

馬章獻

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 200000）

缺鐵是當前世界上主要的營養(yǎng)問題之一，主要影響育齡婦女、嬰兒與兒童[1-2]。這通常由膳食鐵攝入不足、攝入食物中鐵的利用率低，或兩者兼而有之引起[3]。增加鐵的攝入量是缺鐵人群最主要的改善營養(yǎng)狀況的方式[4-8]。乳制品是鈣和磷的主要膳食來源[9]，但它們的鐵含量極低[10-11]。富含鐵的乳品將有助于滿足通常食用更多乳制品的缺鐵高危人群的營養(yǎng)需求。目前已有關于制造富含鐵的乳制品的報道[12-14]，其中對鐵強化酸奶的研究較為豐富[15-16]。例如益生菌聯(lián)合富馬酸亞鐵能夠顯著提高缺鐵性貧血患者的治療效果，改善患者貧血癥狀，其中有機鐵比無機鐵對腸胃刺激性小且易于吸收[17-18]。

酸奶在乳制品市場中占據了較大的比重，攪拌型酸奶作為其中的一種類型，口味多樣、營養(yǎng)豐富，越來越受到大家的歡迎[19-20]。酸奶發(fā)酵劑是為制作酸奶和乳酸菌飲料而調制的特定微生物的培養(yǎng)物[21]，保加利亞乳桿菌是酸奶生產中常用的發(fā)酵劑[22]。

正確選擇合適的鐵源對于生產富含鐵的酸奶非常重要，本研究分析了不同含F(xiàn)e2+鹽發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)出的保加利亞乳桿菌在接種酸奶發(fā)酵過程中酸度、黏度等發(fā)酵活力參數(shù)，為酸奶的鐵強化以及發(fā)酵劑優(yōu)化選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）LB117，由潤盈生物工程（上海）有限公司研發(fā)中心實驗室乳酸菌菌種資源庫提供。

一水葡萄糖，食品級，阜豐集團有限公司；硫酸鎂、硫酸錳與磷酸氫二鉀，食品級，江蘇紫東食品有限公司；檸檬酸氫二銨，食品級，南通市飛宇食品科技有限公司；富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵與檸檬酸鐵銨，食品級，連云港龍?zhí)┩称放淞嫌邢薰?；牛肉浸粉，食品級，山東玉寶生物科技股份有限公司；蛋白胨，食品級，榮氏生物制品（蘇州）有限公司；酵母膏，食品級，山東圣琪生物有限公司。

1.1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；BioFlo/CelliGen 115玻璃通氣發(fā)酵罐、5417R臺式冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；DV-C 數(shù)顯黏度計（S63轉子），美國Brookfield公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，牛肉浸粉10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，吐溫-80 1 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.05 g，用水定容至1 L。

保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，牛肉浸粉2 g，蛋白胨15 g，酵母膏6 g，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，吐溫-80 1g，硫酸鎂0.25 g，硫酸錳0.05 g，F(xiàn)e2+鹽（富馬酸亞鐵/硫酸亞鐵/檸檬酸亞鐵/檸檬酸鐵銨）0.25 g，用水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

取保加利亞乳桿菌（LB117）脫脂乳凍干管，接入121 ℃滅菌15 min后冷卻至室溫備用的200 mL液體MRS培養(yǎng)基中，三角瓶規(guī)格為500 mL。37 ℃培養(yǎng)15 h，每代接種量為2%，傳3代種子液備用。

1.2.2 馴化傳代培養(yǎng)

分別配制含富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵銨的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基各4 L，編號為1、2、3、4，121 ℃滅菌15 min后冷卻至37 ℃，接種1.2.1備用種子液，接種量為2%，（37±1）℃培養(yǎng)10～15 h，培養(yǎng)期間控制pH在5.0左右，直到OD值≥8，傳15代種子液備用。

1.2.3 種子液制備

分別配制含富馬酸亞鐵、硫酸亞鐵、檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵銨的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基各4 L和1組不含F(xiàn)e2+鹽的保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基4 L，分別編號1、2、3、4、5，121 ℃滅菌15 min后冷卻至37 ℃，1～4號接種1.2.2對應編號的備用種子液，5號接種1.2.1備用種子液，接種量為2%，（37±1）℃培養(yǎng)10～15 h，培養(yǎng)期間控制pH為5.0左右，直到OD值≥8，發(fā)酵液迅速降溫至10 ℃以下備用。

1.2.4 酸奶制作與指標檢測

取純牛奶（1 L/盒），編號 1、2、3、4、5，在無菌環(huán)境中接種對應培養(yǎng)基編號的1.2.3備用種子液，接種量6%，于42 ℃下恒溫培養(yǎng)。分別于接種時、接種后每2 h取樣測定酸度與pH，酸度＞60°T后每0.5 h取樣一次，當測得發(fā)酵乳pH≤4.6且酸度＞70°T后終止發(fā)酵，發(fā)酵結束后測定酸奶黏度并進行菌數(shù)計數(shù)。

（1）菌數(shù)計數(shù)

取1.0 mL發(fā)酵液加到裝有9.0 mL生理鹽水的試管中混勻，形成10-1濃度的菌懸液。然后從10-1濃度的菌懸液中取1.0 mL菌懸液到另外一個裝有9.0 mL生理鹽水的試管中混勻，形成10-2濃度的菌懸液，重復此操作直至得到10-6與10-7濃度的菌懸液。取適宜梯度的菌懸液500 μL到不同的空平板中，再倒入適量的MRS瓊脂培養(yǎng)基，搖晃均勻后做好標記置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2 d左右，待單菌落形成后計數(shù)[23]。

（2）酸度測定

采用滴定法測定酸度。稱取10 mL酸奶，用濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定，換算出酸奶的吉爾涅爾度。

（3）黏度測定

轉速30 r/min，攪拌30 s后用黏度計測量讀數(shù)。

（4）感官評定

以20人的評價小組對酸奶進行評分檢驗。評價內容為拉絲性、氣味、滋味、細膩度、稠厚感、爽滑度、好感度，每個指標滿分均為20分。

1.2.5 數(shù)據分析

用SPSS 23.0進行數(shù)據分析，Duncan氏新復極差法（SSR法）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌種子液活菌數(shù)測定

以保加利亞乳桿菌種子液活菌數(shù)為考察對象，可以發(fā)現(xiàn)有機酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌富馬酸亞鐵組最高，無機酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌活菌數(shù)與對照組相近，且均較低（見表1）。

表1 保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)

通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)，無機酸Fe2+對活菌數(shù)沒有顯著影響，有機酸Fe2+馴化后活菌數(shù)顯著增加，且富馬酸亞鐵組增長效果最好，表明有機酸Fe2+馴化是保加利亞乳桿菌增殖因子，可促進保加利亞乳桿菌的增長[18]。

2.2 對酸奶黏度的影響

黏度是反映酸奶質量的重要指標，它是乳成分在發(fā)酵及貯運過程中發(fā)生變化的直接體現(xiàn)，影響酸奶的感官質量。在發(fā)酵過程中，保加利亞乳桿菌將乳糖和葡萄糖、果糖轉變?yōu)槿樗?，使牛奶pH由6.5降低至4.6以下，使酪蛋白和乳清蛋白聚集凝固并包裹住水和脂肪。體系中顆粒的大小是影響?zhàn)ざ鹊囊粋€重要因素，酪蛋白凝固使體系內顆粒直徑急劇增加，其形成的膠狀結構限制了水的自由活動，且酪蛋白的沉淀及保加利亞乳桿菌產生的胞外多糖等均可導致發(fā)酵乳的黏度增加。

添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對發(fā)酵乳的黏度影響見圖1。由圖1可知，發(fā)酵乳的黏度排序為1號組＞3號組＞4號組＞5號空白對照組，2號組與5號空白對照組非常接近。有機鐵Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶黏度高于空白對照組，而無機酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶黏度與空白對照組非常接近，說明有機Fe2+（富馬酸亞鐵、檸檬酸亞鐵與檸檬酸鐵銨）馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶在酸奶感官質量方面有一定優(yōu)勢，推測在馴化過程中菌株胞外多糖生產能力有所提高，改變菌種發(fā)酵黏度極低的特點，增強了酸奶質構。

圖1 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的黏度

2.3 對發(fā)酵時間的影響

產酸快慢決定著發(fā)酵周期的長短，產酸能力反映菌株的發(fā)酵活力[24]。發(fā)酵時間是評價發(fā)酵菌活力的重要指標，發(fā)酵時間越短越有利于企業(yè)節(jié)省成本、提高效率。添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對發(fā)酵時間的影響見圖2。對比發(fā)現(xiàn)對照組發(fā)酵速度最慢，說明用有機酸Fe2+與無機酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌都可有效增加發(fā)酵活力，縮短酸奶發(fā)酵時間，其中富馬酸亞鐵的效果最明顯（P＜0.05）。

圖2 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵時間

2.4 對酸奶活菌數(shù)的影響

益生菌發(fā)揮相應的功效必須以活菌數(shù)為先決條件[25]。酸奶在發(fā)酵完成后于4 ℃冷藏，在這樣的低溫下，乳酸菌等益生菌處于休眠或半休眠狀態(tài)，所以活菌酸奶只要嚴格低溫保存，在保質期內其口感可基本保持一致。添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對酸奶發(fā)酵終點（pH4.5）時活菌數(shù)的影響見圖3，1號組、3號組與4號組活菌數(shù)顯著高于5號空白對照組和2號組，即有機酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌比無機酸Fe2+馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌在功效發(fā)揮方面有一定優(yōu)勢。

圖3 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的活菌數(shù)

2.5 發(fā)酵過程中酸度變化對比

乳酸可促進乳蛋白的吸收，抑制腸內病原性微生物的生長，酸奶中由乳酸產生的酸度能增進產品的風味，增加人的食欲[26]。添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對酸度的影響見圖4，產酸速度排序為1號組＞3號組＞2號組＞4號組＞5號組（空白對照），說明用有機酸Fe2+與無機酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌都可高效產生乳酸，發(fā)酵速度快。

圖4 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵期間酸度變化

2.6 發(fā)酵過程中pH變化對比

發(fā)酵酸奶中的pH隨著乳酸的產生不斷下降，反映出保加利亞乳桿菌在發(fā)酵乳中的活躍程度，添加不同F(xiàn)e2+鹽培養(yǎng)后的保加利亞乳桿菌對酸奶發(fā)酵pH的影響見圖5，1號組pH下降最迅速，4號組與5號組（空白對照）比較接近，其趨勢與酸度產生的速度基本符合；當pH降低至4.5左右時，所有菌種都會受到發(fā)酵產物的抑制，pH不再變化。

圖5 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的發(fā)酵期間pH變化

2.7 酸奶感官評定結果

感官評定結果見圖6，在拉絲性、滋氣味、稠厚感、好感度等方面，1號組評價最好，2號組與5號組在爽滑度和細膩度方面評價較好，與上述各指標評價結果相互印證。總體來看，使用富馬酸亞鐵培養(yǎng)馴化后的保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶，有利于改善感官品質。

圖6 不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳的感官評定

3 結論

鐵在生物生理過程（特別是線粒體呼吸作用、調節(jié)細胞因子的形成以及核酸的合成方面）起著關鍵作用，因此許多微生物的增殖等生命活動取決于鐵的活性[27-29]。本文對有機酸Fe2+（富馬酸亞鐵、檸檬酸亞鐵與檸檬酸鐵銨）與無機酸Fe2+（硫酸亞鐵）分別馴化傳代培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵活力進行了對比。結果表明，用有機酸Fe2+與無機酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌都可有效增加發(fā)酵活力，縮短酸奶發(fā)酵時間，其中接種6%富馬酸亞鐵馴化傳代的保加利亞乳桿菌種子液時，酸奶發(fā)酵時間最短，產酸和產黏能力最強，酸奶活菌數(shù)最高，發(fā)酵活力最強。增進酸奶風味方面無機酸Fe2+馴化培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌要遜色一些，而經過有機酸Fe2+（富馬酸亞鐵）馴化的菌株發(fā)酵活力增強后，對風味的貢獻也明顯增強，為酸奶的鐵強化以及發(fā)酵劑優(yōu)化選擇提供參考。