鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金體外生物相容性研究

許東光，馬春華,2,3*，冷玉敏,3，楊浩

（1.南陽師范學(xué)院 機電工程學(xué)院，河南南陽 473061；2.重慶大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 400044；3.河南省稀土合金材料工程技術(shù)研究中心，河南南陽 473061；4.南陽師范學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河南南陽 473061）

由于鎂合金在人體內(nèi)具有原位降解的能力，其生物相容性、骨傳導(dǎo)性有能力積極刺激人體新骨骼的形成，優(yōu)良的強度、延展性、抗疲勞性和生物耐腐蝕性是鎂合金作為生物降解種植體在骨科應(yīng)用中的重要前提，是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮墓切迯?fù)金屬材料。近年來，Mg-Zn-Zr鎂合金，特別是ZK40（Mg-4Zn-0.5Zr）和ZK60（Mg-6Zn-0.5Zr）鎂合金由于具有良好的生物安全性和生物相容性受到廣大研究學(xué)者的關(guān)注。除了上述商用鎂合金系列外，研究者還開發(fā)了新的鎂合金用于骨科領(lǐng)域，包括Mg-Ca、Mg-Sr、Mg-Zn和Mg-RE合金系列[1]。

以往的研究表明[2-8]，營養(yǎng)元素（如Ca、Sr、Zn、Si和Mn）和微量無毒元素（如Zr、Nd和Y）單獨或一起添加到Mg基質(zhì)中，不會造成有害的局部組織反應(yīng)，易被周圍組織吸收?；谌苎蚆C3T3-E1細(xì)胞粘附試驗結(jié)果表明，Mg-6Zn合金具有良好的體外生物相容性[9]。YU等[10]對擠壓態(tài)Mg-6Zn鎂合金的體外生物相容性進(jìn)行了評價，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Mg-6Zn鎂合金植入兔子的腸道1、2和3周后，能夠上調(diào)體內(nèi)閉合蛋白（Occludin）和緊密連接蛋白（ZO-1）的表達(dá)，并促進(jìn)周圍腸道組織緊密連接的再生。

因此，本文通過pH測試、合金體外溶血率測試、CCK-8細(xì)胞毒性試驗以及細(xì)胞形態(tài)觀察等方法對鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金的體外生物相容性進(jìn)行了探討研究，以確定其作為可降解生物醫(yī)用金屬材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實所用基礎(chǔ)材料為洛陽邁格鎂業(yè)有限公司提供的純鎂和鍛造態(tài)鎂合金板材，純鎂板的純度為99.98%，鍛造態(tài)鎂合金板材的名義成分為Mg-5.45Zn-0.38Zr（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)和Mg-5.45Zn-0.38Zr-0.73Y（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)，經(jīng)過合金配比—熔鑄—板坯—軋制生產(chǎn)工藝制成。純鎂及鍛造態(tài)鎂合金板材的實際化學(xué)成分如表1所示。

表1 純鎂及鍛造態(tài)鎂合金的實際化學(xué)成分

1.2 儀器與試劑

FA1004電子天平，上海天平儀器廠；HM350A電火花線切割，深圳?，敂?shù)控有限公司；WD-9415B超聲波清洗器，北京市六一儀器廠；Nikon D3300數(shù)碼相機，日本尼康公司；DX708D金相顯微鏡，上海上光新光學(xué)科技有限公司；CMT5305微機控制電子萬能試驗機，美斯特工業(yè)系統(tǒng)（中國）有限公司；400HBS-3000數(shù)顯布氏硬度計，萊州華銀實驗儀器有限公司；D8 ADVANCE型X射線多晶衍射儀，德國布魯克公司；ZEISS Sigma 500場發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國蔡司公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；CHI 660D電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；Forcipol 2V研磨拋光機，英國科密特公司；HF90 CO2培養(yǎng)箱，力新儀器（上海）有限公司；Leica DMi8倒置相差顯微鏡，德國徠卡公司；MK3酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾公司；PHS-3C精密酸度計，上海大普儀器有限公司。

無水乙醇，99.5%，天津市風(fēng)船試劑科技化工有限公司；冰乙酸，99.5%，天津市津北精細(xì)化工有限公司；模擬體液（SBF），東莞市創(chuàng)峰自動化科技有限公司；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），中國科學(xué)院細(xì)胞庫；1640細(xì)胞培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清（FBS），美國GeminiBio公司；CCK-8檢測試劑盒，日本Dojindo公司。

1.3 合金浸提液的制備

鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金樣品（直徑20 mm，厚度3 mm）使用無水乙醇超聲清洗，用去離子水快速沖洗烘干，紫外燈輻照滅菌，正反面各照射30 min，然后放于無菌離心管中，保存在無菌箱中待用。以1640細(xì)胞培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，按試樣表面積（cm2）與浸提介質(zhì)體積（mL）之比為1.25∶1.00的比例加入1640細(xì)胞培養(yǎng)液，并置于37 ℃恒溫、95%相對濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，得到合金浸提液原液[11-12]。然后加入1640培養(yǎng)基，以單純1640培養(yǎng)基為陰性對照組，以含有0.64%苯酚作為陽性對照組。合金材料均經(jīng)過121 ℃高溫高壓滅菌。

1.4 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

HUVEC接種于含10%的FBS、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫、95%相對濕度和5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次溶液。當(dāng)細(xì)胞生長成單層匯合至80%時進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

將培養(yǎng)基倒掉，加2 mL的PBS沖洗一下，加1～2 mL的0.25% EDTA-胰酶（室溫），鏡檢細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞變形后去除胰酶，加入含有FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。吸管輕柔吹打，盡量讓細(xì)胞均勻分散，后取出培養(yǎng)基在1 000 r/min離心5 min；去掉上清液，加入3 mL完全培養(yǎng)基后重置，接種到3個培養(yǎng)皿中，放到37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 CCK-8法細(xì)胞毒性測試

細(xì)胞懸液處理細(xì)胞24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，混勻后在培養(yǎng)箱中孵育1 h，測定450 nm波長處的吸光值。細(xì)胞的相對增殖率（RGR）通過式（1）計算：

式中，ODT1為實驗組材料的平均吸光度值，ODN1為陰性對照組（培養(yǎng)液+CCK-8）的平均吸光度值。

根據(jù)ISO 10993-5：1999[11]標(biāo)準(zhǔn)要求，細(xì)胞增殖率和細(xì)胞毒性的相對關(guān)系見表2。其中，0級和1級表示沒有細(xì)胞毒性，2級表示輕度細(xì)胞毒性，3級表示中度細(xì)胞毒性，4級表示明顯細(xì)胞毒性。

表2 細(xì)胞增殖率與細(xì)胞毒性分級的對應(yīng)關(guān)系

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中（5 000個/孔），37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加細(xì)胞懸液之前細(xì)胞拍照記錄。分別于第1 d、4 d和7 d在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照記錄。

1.7 體外溶血率測試

（1）浸提液的制備

所有樣品均使用無水乙醇超聲清洗，用去離子水快速沖洗烘干，紫外燈輻照滅菌，正反面各照30 min，放于無菌離心管中，保存在無菌箱中待用。按照ISO標(biāo)準(zhǔn)制備浸提液[13]：將2種試驗樣品（鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金）按照樣品表面積（cm2）∶溶液體積（mL）為1.25∶1的比例分別浸泡于50 mL生理鹽水中，于（37±0.5）℃無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（2）體外溶血試驗

分實驗組、陰性對照組和陽性對照組，基礎(chǔ)溶液分別為浸提液、生理鹽水及蒸餾水。3組分別加入200 μL樣品至0.6 mL的小試管中，37 ℃恒溫水浴30 min。10 mL生理鹽水與8 mL人抗凝血（含0.5 mL濃度為20 g/L的草酸鉀）混合，之后分別取200 μL加入各試管，37 ℃水浴 60 min，1 500 r/min離心 5 min，上清液在分光光度計545 nm波長處測定吸光度，每組3個平行樣本，計算平均值。根據(jù)公式（2）計算溶血率（HR）：

其中，ODT2、ODN2和ODP2分別代表實驗組、陰性對照組（生理鹽水）和陽性對照組（蒸餾水）吸光度值，溶血率小于5%表示材料無明顯溶血。

1.8 統(tǒng)計分析

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料對模擬體液pH值的影響

圖1為純鎂及鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金在（37±0.5）℃恒溫SBF中浸泡240 h的pH值變化曲線。從圖1中可以看到，在浸泡腐蝕的初期，所有樣品的pH值上升都較快，浸泡48 h后pH值上升到最高點，都在10以上。發(fā)生此種現(xiàn)象的主要原因是鎂合金在浸泡腐蝕過程中，其表面會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并析出大量的H2，陰極溶解會生成OH-，在模擬體液體積保持不變的情況下，體系中的OH-含量必然會越來越多，隨著浸泡腐蝕的不斷進(jìn)行，模擬體液不斷地被堿化，鎂合金腐蝕也越嚴(yán)重。這個堿化特性也決定了鎂合金在實際體液環(huán)境中表面總是更易于堿化。

圖1 純鎂及鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金對SBF體系pH值變化的影響

從圖1可以看出堿化效應(yīng)最終使得體系pH值穩(wěn)定在9.5左右。但是應(yīng)當(dāng)注意的是，當(dāng)合金植入生物體內(nèi)時，由于生物體內(nèi)體液環(huán)境是動態(tài)交換循環(huán)的，所以體內(nèi)pH值的升高將會刺激生物體內(nèi)的酸堿平衡系統(tǒng)進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，因此并不會像體外模擬實驗一樣升高到9.5。

2.2 合金材料的溶血特性

由表3可知，鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr合金溶血率為0.6%，鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr-Y合金溶血率為0.5%，均低于5%，表明鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金不會導(dǎo)致嚴(yán)重溶血現(xiàn)象發(fā)生。根據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)[12]，鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金在體外降解過程中對紅細(xì)胞無明顯的破壞作用，具有優(yōu)良的血液相容性。

表3 Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金溶血實驗結(jié)果（n=3）

2.3 合金材料的體外生物相容性

2.3.1 鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金的細(xì)胞毒性

CCK-8法研究合金材料的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果見表4。從表4可知，細(xì)胞在鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr（合金A）和Mg-Zn-Zr-Y（合金B(yǎng)）鎂合金材料不同濃度浸提液中分別培養(yǎng)1 d、4 d 和7 d后，在同一時間節(jié)點，細(xì)胞的活性（OD值）與陰性對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；細(xì)胞在同一濃度浸提液中培養(yǎng)不同時間的細(xì)胞活性之間差異顯著（P＜0.05）。

表4 不同組別吸光度(OD)及細(xì)胞相對增殖率(RGR)結(jié)果（n=3）

培養(yǎng)7 d后，當(dāng)浸提液濃度為10%時，細(xì)胞的相對增殖率均大于90%，細(xì)胞毒性為0～1級；當(dāng)浸提液濃度為50%時，細(xì)胞的相對增殖率為15.1%～38.2%，細(xì)胞毒性為3～4級，呈中度和明顯細(xì)胞毒性；當(dāng)浸提液濃度為100%時，細(xì)胞的相對增殖率為13.6%～14.9%，細(xì)胞毒性為4級，呈明顯細(xì)胞毒性。

CCK-8實驗結(jié)果表明鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金材料的浸提液濃度為10%時，對細(xì)胞的毒性較小，幾乎不影響細(xì)胞的增殖；而當(dāng)浸提液的濃度為50%或100%時，對細(xì)胞有毒性作用，且會影響細(xì)胞的增殖。

2.3.2 鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y合金對細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2為HUVEC在不同濃度（100%、50%、10%）鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr合金浸提液和對照組中培養(yǎng)1 d、4 d和7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)。圖3為HUVEC在不同濃度（100%、50%、10%）鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液和對照組中培養(yǎng)1 d、4 d、7 d后在倒置相差顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)。

圖2 不同濃度Mg-Zn-Zr浸提液對HUVEC細(xì)胞形貌的影響（10×）

圖3 不同濃度Mg-Zn-Zr-Y合金浸提液對HUVEC細(xì)胞形貌的影響（10×）

從圖2和圖3可以看出，培養(yǎng)第1 d，細(xì)胞密度低，50%Mg-Zn-Zr浸提液和100%、50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，其他濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎全部貼附在培養(yǎng)板的底部，細(xì)胞呈現(xiàn)扁平梭形，輪廓清晰；培養(yǎng)第4 d，細(xì)胞增殖迅速，形態(tài)正常；培養(yǎng)第7 d，100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，10%濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，成團簇增長。然而，在同一時間節(jié)點不同組的細(xì)胞形態(tài)與陰性對照組無明顯差異。

3 結(jié)論

本文研究了鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr和Mg-Zn-Zr-Y鎂合金對模擬體液pH值及其浸提液對HUVEC細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金在模擬體液中的腐蝕速度均高于純鎂的腐蝕速度；鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y合金不會導(dǎo)致嚴(yán)重溶血，體外降解過程中對紅細(xì)胞無明顯的破壞作用，具有優(yōu)良的血液相容性；鍛造態(tài)Mg-Zn-Zr/-Y鎂合金材料的浸提液濃度為10%時，幾乎不影響細(xì)胞增殖，而當(dāng)浸提液的濃度為50%或100%時，對細(xì)胞有一定的毒性作用，會影響細(xì)胞增殖；在100%和50%Mg-Zn-Zr-Y浸提液培養(yǎng)7 d后，HUVEC出現(xiàn)死亡，10%濃度浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量則顯著增加，成團簇增長。