楊 洋，羊國(guó)根，楊懿德，許大鳳，崔權(quán)仁，李林秋，鄢 敏，周本國(guó)*，潘月敏

(1.四川省煙草公司宜賓市公司，四川宜賓 644600；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，安徽合肥 230036；3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，安徽合肥 230031)

由煙草疫霉()引起的煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上最主要的病害之一，主要危害煙草的莖基部和根，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。我國(guó)各煙區(qū)除黑龍江外均有發(fā)生，其中西南煙葉產(chǎn)區(qū)發(fā)病較重，每年因煙草黑脛病引起的經(jīng)濟(jì)損失超過1.2億元。近年來，煙草黑脛病發(fā)病率有加重趨勢(shì)，煙草黑脛病的控制主要依賴于化學(xué)防治，長(zhǎng)期過量使用化學(xué)殺菌劑，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留量超標(biāo)和抗藥性菌株產(chǎn)生。因此，推廣煙草黑脛病的綠色防控技術(shù)，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，保障煙葉綠色安全生產(chǎn)，煙草黑脛病的快速診斷是關(guān)鍵。

煙草黑脛病的傳統(tǒng)檢測(cè)依賴于病原菌的分離和田間癥狀觀察，而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，相繼出現(xiàn)了基于核酸的檢測(cè)體系，如常規(guī)PCR、多重PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，提高了煙草黑脛病的診斷效率。膠體金免疫層析技術(shù)是1990年由Beggs等建立的一種用來檢測(cè)人尿和血清中HCG的技術(shù)，膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，且不需要特殊儀器設(shè)備。目前，膠體金免疫層析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品安全、動(dòng)物傳染病、人畜共患病、植物病害、農(nóng)藥殘留和重金屬離子等方面的快速檢測(cè)。利用膠體金免疫層析試紙條能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)茶葉中草甘膦含量；以金黃色葡萄球菌菌體抗原免疫家兔獲得多克隆抗血清，膠體金免疫層析技術(shù)可以快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌。利用馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的兔多克隆抗體，研制的膠體金試紙條可用于PVX和PVY的快速檢測(cè)，且靈敏度高、無交叉反應(yīng)。

為建立高效、準(zhǔn)確、便攜的煙草黑脛病菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)，筆者以煙草黑脛病菌為抗原制備單克隆抗體，以膠體金為標(biāo)記材料研制膠體金免疫層析檢測(cè)卡，用于煙草黑脛病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，旨在建立免疫膠體金層析檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)煙草黑脛病菌早期診斷和病害監(jiān)測(cè)，對(duì)煙草黑脛病的早期預(yù)防具有重大意義。

1 材料與方法

供試菌株：煙草疫霉()，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院保存。供試土樣：四川省宜賓市烤煙產(chǎn)區(qū)健康煙草根際土壤、煙草黑脛病病株根際土壤，每份約50 g，放入無菌樣品袋，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?0%V8 培養(yǎng)基：取去離子水800 mL，分別加入100 mL V8 汁，CaCO0.2 g，瓊脂粉15 g，定容至1 L。試劑及儀器：牛血清白蛋白BSA、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。ST3100型pH計(jì)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司；臺(tái)式劃膜噴金機(jī)HGS510，杭州峰航科技有限公司。

單克隆抗體的制備。取6周齡雌性BALB/c小鼠4只進(jìn)行免疫，共進(jìn)行3次免疫，采取皮下多點(diǎn)注射，其中抗原免疫用量為25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第三次免疫用等量生理鹽水混合，腹腔注射。第二次免疫后10 d尾靜脈采血，通過間接法測(cè)定抗體效價(jià)。

采用有限稀釋法將細(xì)胞懸液連續(xù)稀釋至統(tǒng)計(jì)上每孔加樣僅含單個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至96孔板培養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)次克隆化操作，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率為100%時(shí)，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，而后凍存及制備腹水等。

將腹水離心15 min(4 000 r/min，室溫)，取上清，在4 ℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續(xù)攪拌30 min，離心30 min(13 000 r/min，4 ℃)，棄上清；沉淀溶于適量PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)；在4 ℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33%，繼續(xù)攪拌30 min，離心30 min(13 000 r/min，4 ℃)，棄上清；沉淀溶于適量PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)，4 ℃透析過夜，測(cè)定抗體含量，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。硫酸銨沉淀后繼續(xù)采用Protein G小柱進(jìn)行純化，新柱子先用5 mL超純水過柱，再用5 mL 0.4 mol/L PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱；抗體過柱，過程中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好地結(jié)合在結(jié)合位點(diǎn)上；繼續(xù)10 mL 0.4 mol/L PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱；5 mL 0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.7)洗脫結(jié)合位點(diǎn)上的抗體，并加入1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持為適合抗體保存的中性。

抗體配對(duì)篩選。配對(duì)篩選應(yīng)用雙抗夾心的ELISA方法對(duì)制備得到的抗體進(jìn)行篩選，篩選出可以配對(duì)的抗體對(duì)。

雙抗夾心的ELISA：用包膜緩沖液將包被抗體稀釋至10 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃包被3 h；洗板3～5次，每孔100 μL，25 ℃反應(yīng)45 min；洗板3～5次，加入酶標(biāo)抗體，每孔100 μL，25 ℃反應(yīng)45 min；洗板3～5次，加入顯色劑，25 ℃避光反應(yīng)15 min；加入100 μL終止液，測(cè)定OD。

單抗與單抗配對(duì)篩選：將單抗作為包被抗體，另一個(gè)單抗標(biāo)記HRP之后作為檢測(cè)抗體，應(yīng)用雙抗夾心的ELISA方法進(jìn)行配對(duì)篩選。

抗體標(biāo)記HRP：2 mg HRP溶于純水，加入高碘酸鈉，室溫反應(yīng)30 min；將5 mg抗體用偶聯(lián)緩沖液透析過夜；將HRP加入抗體溶液中，室溫反應(yīng)2 h；加入硼氫化鈉封閉反應(yīng)位點(diǎn)；磷酸鹽緩沖液透析過夜，加入等量甘油保存于-20 ℃。

膠體金試紙的制備。

膠體金制備。取超純水于燒杯中，加入燒金溶液A，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌混勻，開啟加熱至溶液沸騰，迅速加入新制備的燒金溶液B，繼續(xù)攪拌加熱，溶液逐漸變?yōu)樗{(lán)黑色，然后紫黑，再加熱出現(xiàn)紅色，繼續(xù)沸煮出現(xiàn)透明的橙紅色，繼續(xù)沸煮7～10 min，自然冷卻至室溫，加超純水定容。倒入棕色瓶，4 ℃避光保存。

膠體金標(biāo)記抗體。取1.5 mL膠體金，用0.1 mol/L的KCO調(diào)節(jié)pH，加入相應(yīng)量抗體，混合均勻，室溫反應(yīng)40 min。加入10%的BSA終止反應(yīng)，靜置30 min。1 500 r/min離心，棄凝聚的金膠粒形成的沉淀，8 500 r/min離心30 min，棄上清，沉淀物用金標(biāo)液復(fù)溶，4 ℃保存。

噴金與劃膜。將包被抗原稀釋至適當(dāng)濃度劃于T線，羊抗鼠二抗劃于C線，烘干待用；標(biāo)記好的膠體金噴于預(yù)處理過的金標(biāo)墊，烘干待用。

組裝與測(cè)試。按圖1所示將速測(cè)試紙各個(gè)組分組裝，并檢測(cè)配對(duì)效果，不用編號(hào)的金標(biāo)墊與膜兩兩組合，檢測(cè)配對(duì)效果。

注：1.底板；2.NC膜；3.吸水紙；4.金標(biāo)墊；5.樣品墊；6.T線；7.C線 Note：1.Bottom plate；2.NC membrane；3.Absorbent paper；4.Gold standard pad；5.Sample pad；6.T line；7.C line圖1 膠體金試紙條組裝Fig.1 Assembling of colloidal gold test strip

試紙條靈敏度檢測(cè)。將煙草黑脛病菌菌絲分別稀釋為10、100、1 000倍的溶液，分別用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

田間樣品測(cè)試。將從四川省宜賓市采集的煙草樣本利用膠體金測(cè)速卡進(jìn)行檢測(cè)。

煙草黑脛病菌膠體金速測(cè)卡定量檢測(cè)體系。將陽(yáng)性樣品(10 μg/mL)梯度稀釋后用金標(biāo)速測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用呈色分析儀讀取C、T線深度值，重復(fù)3組，計(jì)算T/C的平均值，建立線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

以煙草疫霉的菌絲和孢子作為抗原，小鼠經(jīng)4次免疫后，共獲得24個(gè)細(xì)胞株，純化后的抗體亞型主要為IgG1，其中單抗15和單抗24的抗體亞型為IgM；有22個(gè)抗體的效價(jià)達(dá)1∶128 000及以上，而單抗1和單抗15效價(jià)較低為1∶64 000。表明煙草黑脛病菌的單克隆抗體已制備成功，可用于后續(xù)抗體配對(duì)及膠體金免疫層析速測(cè)卡的研制(表1)。

表1 單克隆抗體亞型和效價(jià)Table 1 Antibody subtypes and titers

選擇13個(gè)煙草黑脛病菌的單克隆抗體進(jìn)行抗體兩兩配對(duì)篩選，判斷能否形成穩(wěn)定的雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。抗體配對(duì)篩選結(jié)果表明，金標(biāo)單抗6配對(duì)劃膜單抗18，金標(biāo)單抗16配對(duì)劃膜單抗14和18，金標(biāo)單抗19配對(duì)劃膜單抗18，金標(biāo)單抗22配對(duì)劃膜單抗12和單抗18均有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)(較強(qiáng)陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng))，篩選出能夠形成穩(wěn)定的雙抗體夾心結(jié)構(gòu)的抗體配對(duì)，可用于膠體金免疫層析試紙條的研制(表2和圖2)。

表2 抗體配對(duì)篩選Table 2 Antibody pairs screening

圖2 抗體配對(duì)篩選Fig.2 Antibody pairs screening

根據(jù)抗體配對(duì)篩選結(jié)果，選擇金標(biāo)單抗6配對(duì)劃膜單抗18組裝膠體金免疫層析速測(cè)卡，用于檢測(cè)菌絲樣品，稀釋100倍后肉眼仍能夠在T線上看到顯色反應(yīng)，而稀釋1 000倍后T線未呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，表明金標(biāo)單抗6配對(duì)劃膜單抗18的最低檢測(cè)抗原濃度為0.1 μg/mL，有較高的檢測(cè)靈敏度(圖3)。

圖3 煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測(cè)卡的靈敏度Fig.3 Sensitivity of colloidal gold rapid detection card for Phytophthora nicotianae

為明確煙草黑脛病菌膠體金速測(cè)卡現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)效果，從田間采集健康煙株和發(fā)病植株進(jìn)行檢測(cè)。所研制的煙草黑脛病菌膠體金速測(cè)卡能夠檢測(cè)出菌絲樣品和煙草黑脛病病根，T線呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，而對(duì)健康根、赤星病病葉和根黑腐病病根在T線未呈現(xiàn)顯色反應(yīng)，表明煙草黑脛病菌膠體金速測(cè)卡特異性較高，可在田間實(shí)現(xiàn)黑脛病的早期檢測(cè)(圖4)。

圖4 煙草黑脛病菌膠體金免疫速測(cè)卡田間樣本檢測(cè)Fig.4 Detection of field samples by colloidal gold rapid detection card of Phytophthora nicotianae

同時(shí)，從田間采集10份發(fā)病材料，利用煙草黑脛病菌膠體金速測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，其中室內(nèi)分離到的黑脛病菌和尖孢鐮刀菌分別是5和3份，膠體金速測(cè)卡檢出黑脛病菌7份，常規(guī)PCR檢出黑脛病菌9份。膠體金速測(cè)卡檢出率略低于PCR，但高于室內(nèi)分離純化鑒定(表3)。

表3 田間發(fā)病樣品檢測(cè)Table 3 Detection of diseased tobacco

利用呈色分析儀分別讀取反應(yīng)5、8、10 min后C線和T線深度值，并計(jì)算T/C，其T/C在5、8、10 min差異不大，因此最佳檢測(cè)時(shí)間可以選擇5 min(表4)。以稀釋倍數(shù)(即濃度的倒數(shù))為橫坐標(biāo)，T/C為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線=-0049 5+1279 3(=0972 6)，可用于定量檢測(cè)樣品中的煙草黑脛病菌數(shù)量(圖5)。

表4 煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測(cè)卡T/C比值Table 4 The T/C ratio of colloidal gold rapid detection card for Phytophthora nicotianae

圖5 煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測(cè)卡定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for quantitative detection of Phytophthora nicotianae with colloidal gold rapid detection card

3 結(jié)論與討論

煙草黑脛病是我國(guó)西南煙區(qū)主要的根莖類病害，煙草黑脛病的防治應(yīng)采取“預(yù)防為主，綜合防治”的策略，煙草黑脛病的早期監(jiān)測(cè)是有效控制該病害的重要前提。

目前，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)快速診斷已在植物病害檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，包括常規(guī)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR，然而存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格相對(duì)昂貴，且需要特殊的儀器設(shè)備和熟練的技術(shù)人員等方面的不足。近年來，又開發(fā)出多種基于核酸擴(kuò)增的等溫快速檢測(cè)技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)，已廣泛應(yīng)用于植物病原菌的快速檢測(cè)，然而這2種技術(shù)都容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

膠體金免疫層析技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)，是以膠體金為示蹤標(biāo)記物，與抗原抗體特異性反應(yīng)相結(jié)合的免疫分析技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品檢測(cè)和病原物檢測(cè)等領(lǐng)域，可實(shí)現(xiàn)定性、半定量以及定量檢測(cè)。膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用于植物病原物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，如以番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(TZSV)的核殼體蛋白為抗原，建立的膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)方便、快速、特異性強(qiáng)，其檢測(cè)下限是TZSV感染葉片的800倍稀釋液；以水稻條紋病毒(RSV)的病毒粒子為抗原制備單克隆抗體，建立的RSV膠體金免疫層析試紙條，特異性檢測(cè)水稻和灰飛虱中是否存在RSV，其靈敏度達(dá) 1∶20 480；以尖孢鐮刀菌一個(gè)65 kD蛋白為檢測(cè)靶標(biāo)建立的膠體金免疫層析技術(shù)，其敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為92.59%、81.25%和90.00%，對(duì)染病根莖的檢測(cè)下限為2.122 μg/mL抗原，檢測(cè)時(shí)間只需要5 min。

該試驗(yàn)使用煙草黑脛病菌的菌絲和孢囊孢子為抗原，制備單克隆抗體，研制煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測(cè)卡。所建立的煙草黑脛病菌膠體金免疫層析技術(shù)，其最大的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、不需要特殊的檢測(cè)儀器，通常只需5～10 min即可完成檢測(cè)；靈敏度高，其檢測(cè)下限為0.1 μg/mL抗原，能夠特異性檢測(cè)煙草黑脛病菌，沒有交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于煙草黑脛病田間快速準(zhǔn)確診斷，有較好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。