菌酶協(xié)同發(fā)酵對中草藥有效成分消化溶出率的影響

侍寶路，王梓旭，胡丹丹，王計偉

(安佑生物科技集團股份有限公司，江蘇太倉 215437)

我國擁有豐富的中草藥資源和幾千年的用藥歷史經(jīng)驗。中草藥作為天然傳統(tǒng)藥物，富含多種活性物質(zhì)，具有綠色、安全、低殘留等特點，在畜牧業(yè)中被應用于養(yǎng)殖動物增強免疫、疾病防治和醫(yī)藥保健。中草藥有效成分多分布于植物細胞內(nèi)和細胞間隙，新鮮藥材經(jīng)干燥后，細胞逐漸萎縮，活性物質(zhì)呈結(jié)晶或無定形狀態(tài)沉積于細胞內(nèi)，細胞質(zhì)膜的半透性喪失，導致胞內(nèi)物質(zhì)溶出障礙。植物細胞壁主要是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等大分子構(gòu)成，而常見的超聲波萃取技術、超臨界流體萃取技術、酶提取技術等中草藥提取技術均是通過破壞植物細胞壁，讓中草藥有效成分與溶劑接觸并溶出提取的過程。發(fā)酵中藥的本質(zhì)是利用微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的酶類消化植物細胞壁，釋放活性物質(zhì)，提高藥效，降低藥物副作用，產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)，達到中草藥與益生菌協(xié)同增效的效果。

王不留行為石竹科植物麥藍菜[(Neck.)Garcke]的干燥成熟種子，具有行血通經(jīng)、催生下乳、消腫斂瘡的功效；益母草為唇形科植物益母草(Houtt.)的新鮮或干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)、利水消腫、清熱解毒的功效；甘草為豆科多年生草本植物，具有補氣、止咳、清熱解毒、止痛等功效。日糧中添加王不留行可以提高哺乳母豬泌乳性能和抗氧化能力；益母草和甘草在母豬繁殖性能方面發(fā)揮有益作用。有研究發(fā)現(xiàn)，中草藥經(jīng)益生菌發(fā)酵后有效活性成分含量增加；劉洋等研究發(fā)現(xiàn)，王不留行和益母草經(jīng)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵后，可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量分別比未發(fā)酵組提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。目前，在生物酶法輔助提取中藥方面，研究較多的是非淀粉多糖酶，尤其是纖維素酶。前人對發(fā)酵中草藥成分含量變化的研究，多使用有機溶劑萃取發(fā)酵前后的中草藥樣品，檢測活性成分含量，但此方式并不能代表其活性成分的消化溶出效果。該研究通過篩選益生菌和纖維素酶并進行仿生消化處理，評估菌酶協(xié)同發(fā)酵對中草藥有效成分消化溶出率的影響，為發(fā)酵中草藥應用于母豬生產(chǎn)提供研究基礎。

1 材料與方法

試劑。氯化鈉、氯化鉀、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、胃蛋白酶(sigma，P7000)、淀粉酶(Sigma，A3306)、胰蛋白酶(Amersco，0785)、糜蛋白酶(Amersco，0164)；王不留行黃酮苷標準品(批號111853-201704，含量96.9%，購自中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

菌種。植物乳桿菌()、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142，均為安佑微生物研究所微生物實驗室甘油管保存。酵母菌：安佑微生物研究所菌種庫釀酒酵母菌7株，編號分別為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7，均為安佑微生物研究所微生物實驗室甘油管保存。非淀粉多糖酶：木聚糖酶，10萬U/g，購自武漢新華揚生物股份有限公司；纖維素酶M1、M2、M3和M4，均選購自市場。

原料。玉米粉均為市售，粉碎備用。中草藥組方：王不留行、益母草、甘草按4∶3∶3混合，以上中草藥均購自亳州藥材市場，為飼料級，按上述配方比例混合，粉碎過40目篩，備用。

培養(yǎng)基。乳酸菌培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基；芽孢桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；酵母菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：按“..”所述中藥組方配制中藥，將中藥和玉米粉按8∶2混合均勻，作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。

酵母菌篩選。將7株酵母菌甘油管接種于馬鈴薯葡萄糖平板上，28 ℃靜置培養(yǎng)2 d，挑較大菌落轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，得培養(yǎng)液，檢測活菌數(shù)。將培養(yǎng)液在8 000 r/min下離心30 min，棄除沉淀，保留上清液，以產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142作為指示菌，采用打孔法進行抑菌試驗，測量抑菌圈直徑。每個菌株進行3個重復，以活菌數(shù)和抑菌圈直徑為標準篩選出發(fā)酵效果較好的酵母菌。

發(fā)酵種子液制備。將“..”中篩選出的酵母菌接種至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，作為酵母菌和枯草芽孢桿菌種子液。植物乳桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，備用。

非淀粉多糖酶使用。將酵母菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的種子液、木聚糖酶和纖維素酶M1、M2、M3、M4在水中充分溶解，作為發(fā)酵菌液與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基混合，物料發(fā)酵初水分約為40%，酵母菌、植物乳桿菌和木聚糖酶在物料中的接種濃度分別為1.0×10CFU/g、1.0×10CFU/g和3 000 U/kg，纖維素酶M1、M2、M3和M4在物料中的接種濃度均為2 000 U/kg。分裝至帶呼吸閥的發(fā)酵袋密封，37 ℃靜置發(fā)酵5 d，測定發(fā)酵后物料中水分、總酸和中性洗滌纖維(NDF)含量，以發(fā)酵前樣品為空白對照組，計算NDF降解率，每個處理進行3個重復，篩選出效果較好的纖維素酶。

體外消化處理。參考廖睿等和Regmi等方法，略有改動，具體如下：

(1)胃緩沖液。稱取2.59 g氯化鈉和0.25 g氯化鉀，加350 mL去離子水溶解，用2 mol/L的鹽酸在39 ℃下調(diào)節(jié)pH至2.0，冷卻后將上述溶液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中定容。

(2)小腸緩沖液。稱取0.52 g無水磷酸氫二鈉、2.57 g無水磷酸二氫鈉和青霉素12萬U，加40 mL去離子水溶解，39 ℃下用磷酸(1 mol/L)或氫氧化鈉(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至6.30，冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容。

(3)模擬胃液(胃蛋白酶活性737.5 U/mL)。稱取胃蛋白酶147.5 kU，溶解于200 mL pH 2.0的胃緩沖液中，緩慢攪拌至溶解，臨用前配制。

(4)模擬小腸液。稱(量)取淀粉酶41.41 kU、胰蛋白酶12.82 kU、糜蛋白酶1.62 kU，溶解于17 mL去離子水中，緩慢攪拌至溶解15 min以上，臨用前配制。

稱取發(fā)酵前后樣品1 g(精確到0.001 g)于圓底燒瓶中，加入10 mL模擬胃液，39 ℃水浴消化4 h；加入6 mL小腸緩沖液、1.6 mL模擬小腸液，39 ℃水浴消化16 h；將未消化的殘渣收集抽濾裝置中，使用已稱重的定量濾紙過濾，并使用去離子水清洗；將殘留物與濾紙一起在(103±2)℃下烘至絕干，稱重，每個處理進行3個重復，測定消化處理前后樣品中王不留行黃酮苷含量。

常規(guī)指標檢測。飼料中的水分、總酸和粗蛋白質(zhì)含量測定分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—1994和GB/T 12456—2008 方法；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)參照 Van Soest 等方法進行測定；pH采用PHS-3C型酸度計直接測定。乳酸菌總數(shù)和酵母菌總數(shù)測定分別參照 GB 4789.35—2016和GB 4789.15—2016方法。

王不留行黃酮苷含量測定。

對照品溶液的制備。取王不留行黃酮苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備。取發(fā)酵前后樣品(過三號篩)約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定方法。參照《中國藥典》2015年版方法，其中，色譜柱為Agilent HC-C柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。測定消化處理前后樣品中王不留行黃酮苷含量，每個處理3個重復，計算出王不留行黃酮苷消化溶出率，并對比發(fā)酵前后王不留行黃酮苷含量的變化。

式中，為消化前樣品質(zhì)量(g)；為消化前樣品中王不留行黃酮苷含量(mg/kg)；為消化后樣品質(zhì)量(g)；為消化后樣品中王不留行黃酮苷含量(mg/kg)。

2 結(jié)果與分析

從表1可以看出，酵母菌J2、J3和J6 對產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142具有殺菌作用，其他酵母菌株無抑菌效果，綜合考慮，選用抑菌效果較好的酵母菌J3作為發(fā)酵菌株。

從表2可以看出，與發(fā)酵前CK組相比，發(fā)酵原料經(jīng)37 ℃靜置發(fā)酵5 d后，纖維素酶M3的總酸含量和NDF降解率分別為3.14%和 10.01%，為發(fā)酵效果較好的纖維素酶產(chǎn)品。

表1 酵母菌篩選試驗Table 1 Yeast screening test

表2 非淀粉多糖酶篩選Table 2 Screening of non-starch polysaccharide enzymes %

從發(fā)酵前后王不留行黃酮苷的體外消化溶出率(表3)可以看出，經(jīng)發(fā)酵后，王不留行黃酮苷消化溶出率略升高，消化溶出率由94.55%提升至96.46%。

表3 發(fā)酵前后王不留行黃酮苷消化溶出率比較Table 3 Comparison of the digestion and dissolution rate of flavonoid glycosides in Vaccaria segetalis before and after fermentation

3 討論

釀酒酵母作為常見的益生菌，具有較高的營養(yǎng)價值，以干性活酵母、酵母細胞壁、酵母核苷酸等產(chǎn)品形式應用于畜牧養(yǎng)殖中。該試驗中，有3組釀酒酵母菌培養(yǎng)液對產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142有明顯的抑菌效果，表現(xiàn)出殺菌特性。酵母菌的殺菌特性主要歸因于兩方面：一是營養(yǎng)競爭，二是產(chǎn)有機酸、乙醇、分泌毒素蛋白、過氧化氫等抑菌物質(zhì)。毒素蛋白是一種分泌的胞外蛋白或糖蛋白，它會破壞敏感菌的細胞膜，殺菌酵母常用于食品保鮮。在母豬飼糧中添加適量釀酒酵母，可改善母豬體況，縮短產(chǎn)仔和發(fā)情間隔，提高初乳品質(zhì)，改善母豬腸道健康，顯著降低哺乳期間仔豬腹瀉率和死亡率。因此，從發(fā)酵料的酵母菌總數(shù)和抑菌效果綜合考慮，確定釀酒酵母J3作為發(fā)酵中草藥的酵母菌株。

中草藥的生物酶解輔助提取法是利用酶反應的催化活性和高度專一性等特點，選擇相應的生物酶，水解植物細胞壁中纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)，以促進有效成分擴散溶解的方法，干燥植物體中近50%為纖維素，纖維素酶發(fā)揮重要作用。纖維素酶是能將纖維素水解的酶的總稱，是一類復雜酶體系總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，常用濾紙酶活(FPA，filter paper activity)作為生化轉(zhuǎn)化的應用指標，其中外切纖維素酶是最關鍵的限制性單酶因子，作用機理：內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，將纖維素長鏈降解為小分子纖維素或寡糖鏈；外切葡聚糖酶又稱作纖維二糖水解酶，與內(nèi)切葡聚糖酶協(xié)同作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，將纖維素鏈剝離并水解β-1，4-糖苷鍵釋放纖維二糖，經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。植物纖維中木聚糖在纖維素酶作用于纖維素時形成了一定的空間位阻效應，木寡糖對于纖維素酶具有一定程度的抑制作用，因此，該試驗使用木聚糖酶能夠提高纖維素酶解效率，降低纖維素酶的使用量。該試驗條件下，纖維素酶M3組降解NDF效果較好，且總酸含量較高，表明與其他組相比，纖維素酶M3中各成分酶組成較為合適，具體還需進一步研究。該試驗中各組纖維素酶對NDF含量降解效果有限，可能原因是王不留行、益母草和甘草均為草本植物，生長后期木質(zhì)化程度較高，木質(zhì)素限制水解酶接近多糖底物，以及通過非選擇性吸附使酶失活，從而限制酶解效果。

基于體外酶法的體外消化技術一直作為動物營養(yǎng)研究的重要手段之一。田樹海等研究發(fā)現(xiàn)，不同中草藥的干物質(zhì)體外消化率有很大差異；陳皮和枳殼纖維含量高，干物質(zhì)消化率較低，應該使用提取物；當歸、黨參中纖維含量少，干物質(zhì)消化率較高，可以直接添加到日糧中。該試驗條件下，王不留行黃酮苷體外消化溶出率均很高，表明王不留行可直接添加到日糧中飼喂，添加纖維素酶和木聚糖酶后經(jīng)乳酸菌和酵母發(fā)酵，對王不留行黃酮苷消化溶出率有一定促進作用，中草藥混合物中其他有效成分消化溶出率變化情況有待進一步試驗研究。

4 結(jié)論

該試驗將王不留行、益母草和甘草按4∶3∶3混合成中草藥原料，添加玉米粉作為輔料，以產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142作為指示菌，篩選出釀酒酵母J3的殺菌效果最佳，纖維素酶M3降解 NDF效果較好，降解率為10.01%。發(fā)酵原料含水量為40%，植物乳桿菌和釀酒酵母J3分別接種1.0×10和1.0×10CFU/g，纖維素酶M3和木聚糖酶的添加量分別為2 000 和3 000 U/kg時，37 ℃發(fā)酵5 d后，王不留行黃酮苷體外消化溶出率由94.55%提升至95.66%，可直接用于母豬日糧中。