福建醇化煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌多樣性研究

陳善義，李菁菁，劉景川，張瑞強(qiáng)，王雨晴，何 偉，簡(jiǎn)少平，詹仁鋒，方 璟，龍 騰，姜振錕*

福建醇化煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌多樣性研究

陳善義1，李菁菁1，劉景川2，張瑞強(qiáng)3，王雨晴4，何 偉1，簡(jiǎn)少平3，詹仁鋒1，方 璟1，龍 騰1，姜振錕1*

（1.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建 廈門(mén) 361021；2.龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，福建 龍巖 364021；3.廈門(mén)煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，福建 廈門(mén) 361026；4.福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，福州 350108）

為研究煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的多樣性，選取龍巖東肖、龍巖紅炭山、廈門(mén)東孚3座煙葉倉(cāng)庫(kù)1～5樓層的空氣為研究對(duì)象，于2019年1—12月利用空氣采樣法對(duì)倉(cāng)庫(kù)各樓層空氣中真菌進(jìn)行月度采集、分離、鑒定。結(jié)果表明：（1）3座倉(cāng)庫(kù)各樓層空氣中真菌的含量均呈現(xiàn)夏季多而其他季節(jié)少的規(guī)律，東肖、紅炭山倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的含量高于東孚倉(cāng)庫(kù)，其最高值分別是東孚倉(cāng)庫(kù)的10.9倍和9.4倍。（2）3座倉(cāng)庫(kù)空氣中共分離獲得835株真菌，歸屬于3個(gè)門(mén)、10個(gè)綱、54個(gè)屬、158個(gè)種，且優(yōu)勢(shì)菌屬為、和，菌株數(shù)量占倉(cāng)庫(kù)空氣中分離所得總菌株數(shù)比例大于10%的菌種為、、、和。韋恩圖分析結(jié)果表明，東肖、紅炭山、東孚倉(cāng)庫(kù)空氣中分離獲得的真菌種類數(shù)分別為68、92、68。其中，3座倉(cāng)庫(kù)共有的真菌為20種，東肖、紅炭山、東孚倉(cāng)庫(kù)特有的真菌種類數(shù)分別為26、45、37。（3）一年中，倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌種類在冬季相對(duì)較多，而在春末夏初相對(duì)較少。、和是倉(cāng)庫(kù)空氣中較為穩(wěn)定存在的真菌菌種。

倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)；空氣微生物采樣；真菌

片煙醇化是提高卷煙原料品質(zhì)的重要手段。片煙在倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)過(guò)程中若保管不當(dāng)（如倉(cāng)庫(kù)衛(wèi)生條件較差、庫(kù)內(nèi)環(huán)境溫濕度過(guò)大等）則容易發(fā)生霉變。煙葉的霉變是煙葉中真菌在適宜環(huán)境條件下大量生長(zhǎng)和繁殖的結(jié)果[1-2]。煙葉中含有真菌生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)和還原糖等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再加上煙葉本身吸濕性強(qiáng)的特性[3]，這些因素給倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)的片煙帶來(lái)了霉變的風(fēng)險(xiǎn)?？諝庵写嬖谥喾N真菌[4]，片煙在倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)過(guò)程易沾染真菌孢子。目前，有關(guān)煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌多樣性研究較少。姜振錕等[5]分析了倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌組成，而對(duì)于真菌的含量變化規(guī)律及多個(gè)地區(qū)倉(cāng)庫(kù)真菌區(qū)系的差異并未進(jìn)行系統(tǒng)地研究。為此，本研究選取龍巖、廈門(mén)兩地共3座煙葉倉(cāng)庫(kù)為研究對(duì)象，利用空氣采樣法對(duì)倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌進(jìn)行采集、分離及ITS鑒定，系統(tǒng)研究倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌含量的月度變化規(guī)律及不同倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的組成，旨在為片煙霉變的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

培養(yǎng)基：氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配置，于121 ℃下滅菌15 min，冷卻至50 ℃左右后，加入硫酸鏈霉素[購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]，使其終濃度為50 μg/mL，以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

其他試劑：Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、Plus DNA聚合酶、dNTP Mixture（10 mmol/L），購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器：空氣微生物采樣器，型號(hào)MAS-100NT，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；滅菌鍋，型號(hào)VX-95，購(gòu)自德國(guó)Systec公司；超凈工作臺(tái)，型號(hào)SW-CJ-1FD，購(gòu)自蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，型號(hào)BPC-500F，購(gòu)自上海一恒科技有限公司。

1.2 倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的采集、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

試驗(yàn)于2019年1—12月進(jìn)行，每個(gè)月進(jìn)行1次倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的采集。試驗(yàn)地點(diǎn)為龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司的東肖煙葉倉(cāng)庫(kù)（2012年建成并投入使用，庫(kù)內(nèi)環(huán)境年平均溫度24.7 ℃、年平均相對(duì)濕度64.2%）、紅炭山煙葉倉(cāng)庫(kù)（1995年建成并投入使用，庫(kù)內(nèi)環(huán)境年平均溫度19.6 ℃、年平均相對(duì)濕度64.7%）和廈門(mén)煙草工業(yè)有限責(zé)任公司的東孚煙葉倉(cāng)庫(kù)（2016年建成，庫(kù)內(nèi)環(huán)境年平均溫度25.9 ℃、年平均相對(duì)濕度58.3%），每個(gè)地點(diǎn)各選1座，每座共5層。試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樓層重復(fù)取樣3次。

倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的采集方法如下：以氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基為采集培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿蓋子打開(kāi)后，迅速放入空氣微生物采樣器內(nèi)的采樣頭上并固定好，蓋上采樣蓋，設(shè)定采樣體積為100 L，按儀器操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行采樣。采樣完成后，取下培養(yǎng)皿，迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋，用Parafilm封口膜進(jìn)行密封。

將所得培養(yǎng)皿帶回實(shí)驗(yàn)室，置于生化培養(yǎng)箱中，28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。待菌落長(zhǎng)出后，統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)皿形成的菌落數(shù)，以每100 L空氣采集獲得的菌落數(shù)（CFU/100 L）（CFU，colony forming unit，即菌落形成單位）為單位表征倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的含量，利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析。

1.3 真菌的物種鑒定

于超凈工作臺(tái)中，挑取不同形態(tài)（菌落形狀、顏色、表面狀態(tài)、隆起狀態(tài)、邊緣形狀、孢子顏色、菌絲顏色等）的單菌落，轉(zhuǎn)移至新的氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)3～5 d。從菌落的邊緣處挑取少量菌絲，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基中，重復(fù)3次上述操作進(jìn)行純化。

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品基因組DNA。PCR所用引物為ITS1-F（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[6]。反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+）、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L)、0.5 μLPlus DNA Polymerase（5 U/μL），10 μmol/L正、反向引物各1 μL，1 μL模板DNA，補(bǔ)足ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，參照張真娜等[7]的方法進(jìn)行真菌物種的鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌含量變化

由圖1可知，龍巖東肖、龍巖紅炭山及廈門(mén)東孚倉(cāng)庫(kù)各樓層空氣中真菌的含量均呈現(xiàn)夏季多而其他季節(jié)少的規(guī)律。龍巖東肖、龍巖紅炭山倉(cāng)庫(kù)中真菌的含量總體上高于廈門(mén)東孚倉(cāng)庫(kù)，最高值分別為1176.7和1018.7 CFU/100 L，是廈門(mén)東孚倉(cāng)庫(kù)最高值（108.3 CFU/100 L）的10.9倍和9.4倍。

注：a，龍巖東肖倉(cāng)庫(kù)；b，龍巖紅炭山倉(cāng)庫(kù)；c，廈門(mén)東孚倉(cāng)庫(kù)。

2.2 倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的分離和鑒定

利用氯硝胺18%甘油（DG18）瓊脂培養(yǎng)基，從3座倉(cāng)庫(kù)各樓層空氣中共分離獲得835株真菌。根據(jù)ITS鑒定結(jié)果進(jìn)行歸類，發(fā)現(xiàn)這835株真菌歸屬于3個(gè)門(mén)、10個(gè)綱、54個(gè)屬、158個(gè)種（表1）。屬于Ascomycota門(mén)的真菌有782株，所占比例為93.65%；屬于Basidiomycota門(mén)的真菌有50株，所占比例為5.99%；屬于Mucoromycota門(mén)的真菌有3株，所占比例為0.36%。Ascomycota門(mén)包含5個(gè)綱：Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes、Saccharomycetes和Sordariomycetes，共43個(gè)屬。Basidiomycota門(mén)包含4個(gè)綱：Agaricomycetes、Exobasidiomycetes、Microbotryomycetes、Tremellomycetes，共9個(gè)屬。Mucoromycota門(mén)僅有1個(gè)綱：Mucoromycetes，共2個(gè)屬。

2.3 不同倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的多樣性比較

在屬分類水平上進(jìn)行不同倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的多樣性比較（圖2），發(fā)現(xiàn)東肖倉(cāng)庫(kù)屬包含的菌株數(shù)目最多，占該倉(cāng)庫(kù)分離獲得的總菌株數(shù)的47.35%（116/245）；其次為屬、屬，分別占31.43%（77/245）、8.57%（21/245）。紅炭山倉(cāng)庫(kù)屬包含的菌株數(shù)目最多，占該倉(cāng)庫(kù)分離獲得的總菌株數(shù)的34.87%（106/304）；其次為屬、屬，分別占30.59%（93/304）、15.46%（47/304）。東孚倉(cāng)庫(kù)屬包含的菌株數(shù)目最多，占該倉(cāng)庫(kù)分離獲得的總菌株數(shù)的43.36%（124/286）；其次為屬、屬，分別占27.27%（78/286）、9.44%（27/286）。由此可見(jiàn)，、、這3個(gè)屬為東肖、紅炭山、東孚倉(cāng)庫(kù)的優(yōu)勢(shì)菌屬。

表1 倉(cāng)庫(kù)空氣中分離獲得的真菌種類數(shù)目

表1（續(xù)）

Table 1 continued

進(jìn)一步在種分類水平上進(jìn)行不同倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的多樣性比較。由圖3可知，東肖倉(cāng)庫(kù)中，菌株數(shù)量占該倉(cāng)庫(kù)分離所得總菌株數(shù)量比例大于10% 的菌種為、和，所占比例分別為11.84%（29/245）、10.61%（26/245）和10.20%（25/245）；紅炭山倉(cāng)庫(kù)中，菌株數(shù)量占該倉(cāng)庫(kù)分離所得總菌株數(shù)量比例大于10%的菌種為，所占比例為11.18%（34/304）；東孚倉(cāng)庫(kù)中，菌株數(shù)量占該倉(cāng)庫(kù)分離所得總菌株數(shù)量比例大于10%的菌種為、和，所占比例分別為13.29%（38/286）、12.24%（35/286）和10.14%（29/286）。

注：DX，龍巖東肖倉(cāng)庫(kù)；HTS，龍巖紅炭山倉(cāng)庫(kù)；DF，廈門(mén)東孚倉(cāng)庫(kù)。下同。

圖3 三座倉(cāng)庫(kù)主要真菌各種菌株數(shù)目所占比例

韋恩圖可以分析不同倉(cāng)庫(kù)共有和特有的真菌種類。由圖4可知，東肖、紅炭山、東孚倉(cāng)庫(kù)分離獲得的真菌種類數(shù)分別為68、92、68。其中，3座倉(cāng)庫(kù)共有的真菌有20種，東肖、紅炭山、東孚倉(cāng)庫(kù)特有的真菌種類數(shù)分別為26、45、37。由此可見(jiàn)，紅炭山倉(cāng)庫(kù)含有的真菌種類數(shù)最為豐富，且特有的真菌種類數(shù)最多。

圖4 不同倉(cāng)庫(kù)空氣真菌種類韋恩圖分析

2.4 不同倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的種類變化分析

由圖5可知，三座倉(cāng)庫(kù)空氣中每月分離所得真菌的種類數(shù)為7～26，其中1、2月份獲得的種類數(shù)最多，而4、5、6月份獲得的種類數(shù)較少。由此可見(jiàn)，一年中，倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌種類在冬季相對(duì)豐富，而在春末夏初相對(duì)單一。

圖5 不同倉(cāng)庫(kù)空氣真菌種類數(shù)月度變化

在12次的月度采樣中，對(duì)3個(gè)倉(cāng)庫(kù)空氣中出現(xiàn)6次及以上的真菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有8種真菌出現(xiàn)至少6次，為、、、、、、、。其中在東肖、紅炭山、東孚倉(cāng)庫(kù)的12次月度采樣中分別出現(xiàn)了10、11、11次。此外，和在東孚倉(cāng)庫(kù)的12次月度采樣中分別出現(xiàn)了11次和10次。這說(shuō)明，、和是倉(cāng)庫(kù)空氣中較為穩(wěn)定存在的真菌菌種。

表2 不同倉(cāng)庫(kù)空氣中出現(xiàn)6個(gè)月及以上的真菌種類統(tǒng)計(jì)

3 討 論

利用空氣采樣法對(duì)龍巖東肖、龍巖紅炭山、廈門(mén)東孚3座倉(cāng)庫(kù)各樓層空氣中真菌進(jìn)行了采集、分離、培養(yǎng)及ITS鑒定，發(fā)現(xiàn)倉(cāng)庫(kù)各樓層空氣中真菌的含量均呈現(xiàn)夏季多而其他季節(jié)少的規(guī)律，說(shuō)明倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌在夏季繁殖迅速。這種規(guī)律在向東紅[8]對(duì)川渝地區(qū)不同季節(jié)倉(cāng)儲(chǔ)片煙的真菌污染情況調(diào)查中也有發(fā)現(xiàn)。福建地處中國(guó)東南部，夏季高溫高濕，利于真菌的生長(zhǎng)和繁殖。因此，在片煙的倉(cāng)儲(chǔ)養(yǎng)護(hù)過(guò)程中，要重點(diǎn)做好夏季的防霉措施。比較3座倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，東孚倉(cāng)庫(kù)的真菌數(shù)量少于東肖和紅炭山倉(cāng)庫(kù)，可能原因是東孚倉(cāng)庫(kù)年平均環(huán)境相對(duì)濕度（58.3%）低于東肖倉(cāng)庫(kù)（64.2%）和紅炭山倉(cāng)庫(kù)（64.7%）。同處于龍巖市的紅炭山和東肖倉(cāng)庫(kù)年平均環(huán)境相對(duì)濕度相差不大，盡管紅炭山倉(cāng)庫(kù)年平均環(huán)境溫度（19.6 ℃）低于東肖倉(cāng)庫(kù)（24.7 ℃），但韋恩圖分析表明紅炭山倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的種類數(shù)（92種）依然大于東肖倉(cāng)庫(kù)（68種）?？赡艿脑蛴?個(gè)：一是使用年限較長(zhǎng)的倉(cāng)庫(kù)，空氣中的真菌得以更長(zhǎng)時(shí)間的富集；二是不同來(lái)源的片煙本身含有的真菌種類不一樣[9]。

本研究分離獲得的54個(gè)屬中，有5個(gè)屬可致煙草制品發(fā)生霉變。其中、、、4個(gè)屬可致醇化片煙發(fā)生霉變[8, 10-12]，屬對(duì)煙葉的致霉性尚未見(jiàn)報(bào)道，但可致成品卷煙煙支發(fā)生霉變[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，、、是醇化煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中的優(yōu)勢(shì)菌屬?？梢?jiàn)，福建地區(qū)醇化煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中的優(yōu)勢(shì)菌屬均為致霉菌，下一步應(yīng)對(duì)這些優(yōu)勢(shì)霉菌系統(tǒng)開(kāi)展生物學(xué)特性及致霉條件研究，以便為片煙的防霉養(yǎng)護(hù)提供理論支持。

在種分類水平上，姜振錕等[5]的研究中發(fā)現(xiàn)菌株數(shù)量占煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中分離所得總菌株數(shù)量比例大于10%的菌種為、和，是煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)空氣中的優(yōu)勢(shì)菌種。本研究發(fā)現(xiàn)除上述3種真菌以外，菌株數(shù)量占煙葉倉(cāng)庫(kù)空氣中分離所得總菌株數(shù)量比例大于10%的菌種還有和，可能是本研究采集的樓層更多，時(shí)間跨度更大，因而可發(fā)現(xiàn)更多的優(yōu)勢(shì)真菌種類。

對(duì)不同月份采集獲得的真菌種類數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，冬季真菌種類數(shù)相對(duì)較多，而春末夏初相對(duì)較少。這可能是冬季環(huán)境溫濕度相對(duì)較低，各類真菌生長(zhǎng)和繁殖較慢，而春末夏初時(shí)，氣溫回升，相對(duì)濕度較大，一些種類的真菌得以快速生長(zhǎng)和繁殖，并形成優(yōu)勢(shì)菌群，造成采集獲得的真菌種類數(shù)相對(duì)較少。

4 結(jié) 論

結(jié)果表明，福建地區(qū)煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)庫(kù)內(nèi)環(huán)境空氣中真菌的含量夏季多，其他季節(jié)少，東肖、紅炭山倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌的含量高于東孚倉(cāng)庫(kù)。煙葉醇化倉(cāng)庫(kù)庫(kù)內(nèi)環(huán)境中真菌種類豐富，3座倉(cāng)庫(kù)共獲得835株真菌，歸屬于3個(gè)門(mén)、10個(gè)綱、54個(gè)屬、158個(gè)種，菌株數(shù)量占倉(cāng)庫(kù)分離所得總菌株數(shù)量比例大于10%菌種為、、、和。一年中，倉(cāng)庫(kù)空氣中真菌種類在冬季相對(duì)較多，而在春末夏初相對(duì)較少。、和是倉(cāng)庫(kù)空氣中較為穩(wěn)定存在的真菌種類。

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Diversity of Aerial Fungi in Tobacco Warehouse in Fujian Province

CHEN Shanyi1, LI Jingjing1, LIU Jingchuan2, ZHANG Ruiqiang3, WANG Yuqing4, HE Wei1, JIAN Shaoping3, ZHAN Renfeng1, FANG Jing1, LONG Teng1, JIANG Zhenkun1*

(1. Technology Center, China Tobacco Fujian Industrial Co., Ltd., Xiamen, Fujian 361021, China; 2. Longyan Tobacco Industrial Co., Ltd., Longyan, Fujian 364021, China; 3. Xiamen Tobacco Industrial Co., Ltd., Xiamen, Fujian 361026, China; 4. Institute of Food Science and Technology, Fuzhou University, Fujian Center of Excellence for Food Biotechnology, Fuzhou 350108, China)

To study the diversity of fungi in the air of tobacco warehouses, monthly collection, isolation and identification of fungi in the air of floors 1-5 of 3 warehouses (Dongxiao in Longyan, Hongtanshan in Longyan and Dongfu in Xiamen) were carried out with the air sampling method from January to December in 2019. The results showed that: (1) The fungal quantity in the air of each floor of the three warehouses was high in summer but low in other seasons, and the content of fungi in the air of Dongxiao and Hongtanshan warehouses were higher than that of Dongfu, with the highest value being 10.9 and 9.4 times of Dongfu, respectively. (2) A total of 835 fungal strains, belonging to 3 phyla, 10 classes, 54 genera and 158 species, were obtained from the 3 warehouses. The dominant genera were,and.,,,andwere the species that accounted for more than 10% of the total isolates number in the air of the tobacco warehouses. The results of Venn diagram analysis showed that 68, 92 and 68 species of fungi existed in the warehouses of Dongxiao, Hongtanshan and Dongfu, respectively. 20 species were common to the 3 warehouses, and the numbers of specific species for the warehouses in Dongxiao, Hongtanshan and Dongfu were 26, 45 and 37, respectively. (3) The numbers of fungal species in the air of tobacco warehouses were relatively high in winter, but relatively low in late spring and early summer over a period of one year.,andwere relatively steady fungal species in the air of tobacco warehouses.

storage and maintenance; airborne microbes sampling; fungi

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.04.007

S435.72

A

1007-5119（2022）04-0048-07

福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（FJZYKJJH2018011）

陳善義（1988-），男，農(nóng)藝師，碩士，研究方向：煙草原料研究。E-mail：chensy188@126.com。*通信作者，E-mail：jzk23326@fjtic.cn

2022-02-11

2022-08-01