麻痹性貝毒在毛蚶體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程研究*

林卓如 耿慧霞 唐文嬌, 5 于仁成, 2, 3, 4

麻痹性貝毒在毛蚶體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程研究*

林卓如1, 3耿慧霞1唐文嬌1, 5于仁成1, 2, 3, 4①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 4. 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071; 5. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 山東青島 266003)

麻痹性貝毒能夠在貝類體內(nèi)累積, 威脅海產(chǎn)品消費(fèi)者健康。在以往調(diào)查中, 多次在毛蚶()體內(nèi)發(fā)現(xiàn)高含量的麻痹性貝毒, 但對(duì)于毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化過程及其食品安全風(fēng)險(xiǎn)還缺乏認(rèn)識(shí)。通過室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn), 選擇太平洋亞歷山大藻()和鏈狀裸甲藻()作為產(chǎn)毒藻種, 研究了兩種有毒藻種所產(chǎn)麻痹性貝毒在毛蚶體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程。結(jié)果表明, 毛蚶體內(nèi)主要出現(xiàn)了三種麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化過程, 一是R1位羥基的還原反應(yīng), 二是-磺酰氨甲?；惗舅豏4位磺酸基團(tuán)的水解反應(yīng), 三是含羥基苯甲酸(hydroxybenzoate)基團(tuán)的鏈狀裸甲藻毒素在R4位的水解反應(yīng)。毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的生物轉(zhuǎn)化過程復(fù)雜, 對(duì)毛蚶毒性的影響具有一定的不確定性, 未來仍需要進(jìn)一步深化毛蚶體內(nèi)毒素累積、代謝、轉(zhuǎn)化過程的研究, 同時(shí)加強(qiáng)對(duì)毛蚶體內(nèi)毒素含量的全面監(jiān)測(cè), 防范毛蚶可能導(dǎo)致的麻痹性貝毒中毒風(fēng)險(xiǎn)。

麻痹性貝毒; 毛蚶; 太平洋亞歷山大藻; 鏈狀裸甲藻; 鏈狀裸甲藻毒素; 毒素轉(zhuǎn)化

麻痹性貝毒中毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)是沿海地區(qū)常見的一類中毒事件, 多因消費(fèi)者誤食含有麻痹性貝毒(paralytic shellfish toxins, PSTs)的貝類造成, 嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致死亡。麻痹性貝毒是一類神經(jīng)毒素, 能夠與神經(jīng)細(xì)胞的鈉離子通道結(jié)合, 阻斷信號(hào)傳導(dǎo), 對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用(Kao, 1965; Ritchie, 1977)。麻痹性貝毒中毒的典型癥狀包括肢體麻木、皮膚刺痛、惡心、嘔吐、發(fā)燒、肌肉麻痹等, 嚴(yán)重時(shí)可能出現(xiàn)呼吸衰竭和休克等(于仁成等, 2016)156。在海洋環(huán)境中, 麻痹性貝毒主要由甲藻產(chǎn)生, 常見的產(chǎn)毒甲藻包括亞歷山大藻屬()中的部分藻種(如太平洋亞歷山大藻.、鏈狀亞歷山大藻.、微小亞歷山大藻.等)、裸甲藻屬的鏈狀裸甲藻()和梨甲藻屬中的個(gè)別藻種(var.)。其中, 亞歷山大藻屬和裸甲藻屬的產(chǎn)毒藻種在我國近海較為常見(于仁成等, 2016)159～160。麻痹性貝毒通常累積在貝類中, 我國沿海地區(qū)曾多次發(fā)生過因食用染毒貝類導(dǎo)致的麻痹性貝毒中毒事件, 對(duì)消費(fèi)者身體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅(林燕棠等, 1999; 于仁成等, 2016156～157, 陳火榮, 2018)。

麻痹性貝毒是一類具有四氫嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物(圖1), 已知毒素同系物近60種, 在不同位點(diǎn)取代基種類的差異會(huì)影響毒素成分的性質(zhì)和毒性。在以往研究中, 通常根據(jù)R4位點(diǎn)取代基的差異, 將常見麻痹性貝毒分為3類:-磺酰氨甲?；惗舅?、氨基甲酸酯類毒素和脫氨甲?；惗舅?表1)。其中氨基甲酸酯類毒素的毒性最高, 而-磺酰氨甲?；舅赜捎赗4基團(tuán)過大, 影響與鈉離子通道的結(jié)合, 表現(xiàn)出最低的毒性(Leal, 2022)13。近年來, 在鏈狀裸甲藻中發(fā)現(xiàn)了一類新的羥基苯甲酸酯石房蛤毒素, 并依據(jù)產(chǎn)毒藻名稱將其命名為鏈狀裸甲藻毒素(toxins), 簡(jiǎn)稱GC毒素(Negri, 2003)。這類毒素R4位點(diǎn)上的取代基為羥基苯甲酸基團(tuán)。大部分麻痹性貝毒為水溶性毒素, 而GC毒素因其羥基苯甲酸基團(tuán)而具有一定的脂溶性特征。GC毒素與小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的鈉離子通道具有較強(qiáng)的結(jié)合能力, 說明其可能具有較高的毒性(Llewellyn, 2004)101。此外, 由于GC毒素具備一定的脂溶性, 研究者推測(cè)其在生物體內(nèi)的保留時(shí)間會(huì)長于其他麻痹性貝毒, 可能會(huì)對(duì)消費(fèi)者身體健康造成更大的危害(Llewellyn, 2004)103。

圖1 麻痹性貝毒結(jié)構(gòu)

表1 不同種類麻痹性貝毒的結(jié)構(gòu)

Tab.1 Substituents of different paralytic shellfish toxins

貝類在攝食麻痹性貝毒產(chǎn)毒藻后, 體內(nèi)的麻痹性貝毒具有明顯的蓄積、轉(zhuǎn)化和排出過程, 進(jìn)而影響貝類的毒性狀況。根據(jù)以往研究得到的認(rèn)識(shí), 貝體內(nèi)麻痹性貝毒具有多類轉(zhuǎn)化過程, 根據(jù)其轉(zhuǎn)化條件可分為化學(xué)轉(zhuǎn)化過程和酶促轉(zhuǎn)化過程(Suzuki, 1998)。麻痹性貝毒R2與R3基團(tuán)的差向異構(gòu)化反應(yīng)屬于典型的化學(xué)轉(zhuǎn)化過程, 由藻類中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的異構(gòu)體逐漸轉(zhuǎn)化為貝類中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的異構(gòu)體(Jaime, 2007)。此外,-磺酰氨甲酰基類毒素水解產(chǎn)生氨基甲酸酯類毒素也是化學(xué)轉(zhuǎn)化過程, 該反應(yīng)傾向于在酸性條件下發(fā)生(田華, 2009)。貝類體內(nèi)發(fā)生的毒素酶促轉(zhuǎn)化過程主要是通過水解反應(yīng)生成脫氨甲?；惗舅? 包括氨甲?；饷笇?duì)氨基甲酸酯類毒素的水解以及磺氨甲?；饷笇?duì)-磺酰氨甲?；惗舅氐乃?Raposo, 2020)4。目前, 對(duì)于GC毒素在貝體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程仍缺乏足夠的了解, 有研究認(rèn)為GC毒素在貝體內(nèi)也會(huì)通過酶促水解產(chǎn)生脫氨甲?；惗舅?Vale, 2008)191。貝類對(duì)于麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化具有明顯的種間差異, 扇貝和蛤?qū)β楸孕载惗镜霓D(zhuǎn)化過程較為強(qiáng)烈, 其體內(nèi)的毒素組成與產(chǎn)毒藻存在較大差異; 牡蠣和貽貝對(duì)麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化相對(duì)較弱, 更多表現(xiàn)為毒素比例的變化(Botelho, 2020; 包振民等, 20214)。還有研究表明, 貝類攝食產(chǎn)毒藻后能夠?qū)⒙楸孕载惗究焖俅x轉(zhuǎn)化為新型的低毒性M類毒素(Dell’Aversano, 2008; Li, 2012), 并將其快速排出體外, 以達(dá)到脫毒的目的。因此, 深入探究貝體內(nèi)麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化過程, 解析不同貝類對(duì)毒素的轉(zhuǎn)化特征, 有助于準(zhǔn)確評(píng)估貝體內(nèi)麻痹性貝毒的致毒風(fēng)險(xiǎn), 更好地防控麻痹性貝毒中毒事件。

毛蚶()廣泛分布于我國沿海地區(qū), 是常見的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類。主要產(chǎn)區(qū)位于渤海和黃海海域, 包括渤海灣、遼東半島和黃海大陸架海域等(張福崇等, 2020)。到目前為止, 我國沿海尚未出現(xiàn)因食用毛蚶導(dǎo)致的麻痹性貝毒中毒事件。但是, 以往調(diào)查中發(fā)現(xiàn)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒含量可以達(dá)到較高水平, 在天津漢沽和河北秦皇島海域的毛蚶樣品中, 麻痹性貝毒毒性甚至超出農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量限量標(biāo)準(zhǔn)(柳陽, 2017)70, 極有可能導(dǎo)致中毒事件發(fā)生。目前對(duì)于毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的累積、轉(zhuǎn)化和排出過程還缺乏科學(xué)認(rèn)識(shí), 有必要通過科學(xué)研究深入了解毛蚶暴露于有毒藻后體內(nèi)麻痹性貝毒的動(dòng)態(tài)變化過程, 進(jìn)而闡明其對(duì)毛蚶毒性的影響。對(duì)此, 本研究通過模擬實(shí)驗(yàn), 選擇太平洋亞歷山大藻(.)和鏈狀裸甲藻(.)作為典型產(chǎn)毒藻種, 研究了毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化過程, 以期揭示毛蚶中麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化特征和規(guī)律, 為防控麻痹性貝毒中毒事件提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)中用到的有機(jī)溶劑包括甲醇(色譜級(jí), Merck, 德國)、乙腈(色譜級(jí), Merck, 德國)、甲酸(色譜級(jí),≥99%, 麥克林)、硝酸(工藝超純, 66.6%～68.0%, 國藥)、磷酸(優(yōu)級(jí)純, 國藥)、鹽酸(優(yōu)級(jí)純, ≥36%, 國藥)、乙酸(色譜級(jí), ≥99.0%, 科密歐)、氨水(優(yōu)級(jí)純, 25%～28%, 國藥)、四丁基磷酸二氫銨(≥99.00%, Fulka, 美國)、庚基磺酸鈉(Wako, 日本)、高碘酸H5IO6·2H2O(≥99.0%, Sigma, 美國)。實(shí)驗(yàn)中使用的超純水由超純水機(jī)(Millipore Simplicity, 美國)制備。毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GTX1&4、GTX2&3、STX、NEO、dcGTX2&3、dcSTX、dcNEO、C1&2、GTX5、GTX6)購自加拿大國家研究院海洋生物科學(xué)研究所, 在有效使用期內(nèi)使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)生物

實(shí)驗(yàn)所用藻株包括太平洋亞歷山大藻(MEL2株)和鏈狀裸甲藻(MEL11株)。太平洋亞歷山大藻(以往通過形態(tài)學(xué)方法鑒定為塔瑪亞歷山大藻復(fù)合種.species complex, ATHK藻株)來自暨南大學(xué), 分離自南海; 鏈狀裸甲藻于2017年分離自福建莆田近海, 并經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定(Lin, 2022)。實(shí)驗(yàn)用海水取自青島市匯泉灣, 經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后, 煮沸滅菌, 冷卻后加入到經(jīng)過高溫滅菌的錐形瓶中, 按照L1培養(yǎng)基配方(Guillard, 1993)加入營養(yǎng)鹽、微量元素和維生素, 接入藻種后進(jìn)行培養(yǎng)。太平洋亞歷山大藻培養(yǎng)溫度為18 °C, 光照強(qiáng)度為3 000 lx, 光暗循環(huán)為L: D=12 h: 12 h; 鏈狀裸甲藻培養(yǎng)溫度為20 °C, 光照條件同上。

實(shí)驗(yàn)用毛蚶(.)采自山東青島近海, 殼長(4.50±0.27) cm, 殼寬(3.45±0.24) cm, 殼高(2.82±0.28) cm, 軟組織凈重(6.94±1.04) g。購入后先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴化, 期間持續(xù)通氣并每天更換培養(yǎng)海水。挑取馴化后健康活躍的毛蚶用于實(shí)驗(yàn), 每6只毛蚶分為1組, 培養(yǎng)于裝有3 L經(jīng)0.22 μm濾膜過濾海水的燒杯中, 實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)通氣并定期更換海水。

1.3 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻的室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

取一定量的太平洋亞歷山大藻培養(yǎng)液, 用10 μm篩網(wǎng)濃縮藻液中的藻細(xì)胞并置于一定量海水中混勻。取1 mL混勻后的藻液, 加入20 μL魯哥試劑(Lugol’s agent)固定, 在顯微鏡(Zeiss, Axio Vert A1, 德國)下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度。量取一定體積的藻液, 在≤0.05 MPa壓力下抽濾至1.2 μm玻璃纖維濾膜(GF/C, Whatman, 直徑47 mm)上, 置于-20 °C冷凍保存, 用于麻痹性貝毒分析。將剩余藻液加入燒杯中, 通過加入滅菌海水調(diào)整亞歷山大藻初始密度至2 000 cells/mL, 每只毛蚶投喂量約為1.0×106藻細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行48 h, 分別于投喂毛蚶后的第2、4、6、8和10 h取燒杯中水樣10 mL, 加魯哥試劑固定后計(jì)數(shù)剩余亞歷山大藻細(xì)胞密度, 用于計(jì)算毛蚶實(shí)際攝食的藻細(xì)胞數(shù)量。分別于投喂前和投喂后的第1、2、4、8、12、24和48 h取毛蚶樣品, 解剖毛蚶并采集全部軟組織, 于-20 °C下冷凍保存, 統(tǒng)一進(jìn)行麻痹性貝毒分析。

1.4 毛蚶攝食鏈狀裸甲藻的室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

鏈狀裸甲藻的濃縮和取樣方法與1.3部分中太平洋亞歷山大藻的濃縮與取樣方法相同。鏈狀裸甲藻初始密度設(shè)置為400 cells/mL, 每只毛蚶投喂量約2.0×105藻細(xì)胞, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行96 h。分別于投喂后第2、4、6、8、10和12 h取燒杯中水樣10 mL, 魯哥試劑固定后計(jì)數(shù)剩余藻細(xì)胞密度, 用于計(jì)算毛蚶攝食藻細(xì)胞數(shù)量。分別于投喂毛蚶后的第2、4、8、12、24、48、72和96 h取毛蚶樣品, 解剖毛蚶并采集全部軟組織, 于-20 °C下冷凍保存, 統(tǒng)一進(jìn)行麻痹性貝毒分析。

1.5 麻痹性貝毒分析

亞歷山大藻細(xì)胞及投喂亞歷山大藻的毛蚶樣品均采用高效液相色譜-柱后衍生-熒光檢測(cè)法進(jìn)行麻痹性貝毒分析, 毒素提取和分析過程參照柳陽(2017)37～42檢測(cè)方法進(jìn)行。鏈狀裸甲藻及投喂鏈狀裸甲藻的毛蚶樣品, 因其中含有GC毒素成分, 均采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行麻痹性貝毒分析, 毒素提取和分析過程如下。

1.5.1 鏈狀裸甲藻中毒素提取 將濾有藻細(xì)胞的玻璃纖維濾膜剪碎, 置于15 mL離心管中, 加入3 mL 0.05 mol/L醋酸溶液。使用渦旋振蕩器(IKA, MS1 Minishaker, 美國)混合均勻后, 在冰浴條件下使用超聲波細(xì)胞破碎儀(JY96-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī), 寧波新芝科器研究所, 國產(chǎn))對(duì)藻類樣品進(jìn)行破碎(設(shè)置功率為100 W, 每次處理2 s后靜置2 s, 持續(xù)處理5 min)。鏡檢確認(rèn)藻細(xì)胞完全破碎后, 將離心管置于高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3-16K, 德國)中, 8 000 r/min離心10 min, 取上清液待基質(zhì)凈化。

1.5.2 毛蚶中麻痹性貝毒提取 冷凍的貝類組織在室溫下解凍后, 用組織勻漿機(jī)(IKA, T10BS25, 美國)勻漿, 取5 g混勻的貝組織, 置于15 mL聚丙烯離心管中, 加入5 mL 0.05 mol/L醋酸溶液, 使用渦旋振蕩器震蕩混合, 混勻樣品置于水浴鍋(DK-8D, 上海一恒, 國產(chǎn))中煮沸約5 min, 自然冷卻至室溫后, 于高速離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min, 取上清液待進(jìn)行基質(zhì)凈化。

1.5.3 提取液基質(zhì)凈化 水溶性麻痹性貝毒提取: 使用甲醇-水交替活化固相萃取柱(Supelclean LC-18, 3 mL, Supelco, 美國)后, 將1 mL藻類或貝類提取液加入固相萃取柱中, 使用真空泵緩慢抽干(壓力≤20 kPa), 并將洗脫液收集于5 mL離心管中。再加入1.5 mL超純水洗脫柱上殘留的水溶性麻痹性貝毒, 緩慢抽干后, 與上一步洗脫液合并收集于5 mL離心管中。加入少量超純水將收集的洗脫液定容至2.5 mL。取1 mL洗脫液, 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。

GC毒素提取: 向上一步洗脫水溶性麻痹性貝毒后的固相萃取小柱, 加入0.5 mL 20%甲醇洗脫, 洗脫液收集于1.5 mL離心管中。再加入0.5 mL 80%甲醇洗脫, 洗脫液與上一步洗脫液合并收集于1.5 mL離心管中。加入少量超純水將收集的洗脫液定容至1 mL, 震蕩混勻后, 取1 mL洗脫液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.5.4 麻痹性貝毒的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 參照Costa等(2015)2055～2058建立的方法進(jìn)行麻痹性貝毒的液-質(zhì)聯(lián)用分析。采用超高效液相色譜儀(UltiMate 3000, Thermo Fisher, 美國)配合三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(Qtrap?-4500, AB Sciex, 美國)進(jìn)行毒素分析, 所用色譜柱為酰胺鍵合硅膠色譜柱(TSK-gel Amide-80, 5 μm, 2.0 mm×250 mm, 日本)。流動(dòng)相A為50 mmol/L甲酸水溶液(pH=2.6), 流動(dòng)相B為含有50 mmol/L 甲酸的95%乙腈水溶液(pH=2.6), 采用梯度洗脫(表2), 流速 200 μL/min, 進(jìn)樣量 2 μL,柱溫箱溫度30 °C, 樣品池溫度4 °C。以標(biāo)準(zhǔn)毒素對(duì)質(zhì)譜儀的響應(yīng)進(jìn)行調(diào)諧并優(yōu)化檢測(cè)參數(shù)。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如下: 電噴霧離子源進(jìn)行離子化, 氣簾氣電壓20 V, 霧化氣電壓設(shè)置為Medium, 電噴霧電壓5 500(+) V, 離子源溫度550 °C, 加熱輔助電壓1和2分別為45 Pa和55 Pa, 碰撞室入口電壓為10 V, 碰撞室出口電壓為9 V, 電子倍增管電壓CEM為1 800 V。在此基礎(chǔ)上對(duì)去簇電壓和碰撞能參數(shù)進(jìn)行調(diào)諧優(yōu)化。由于GC毒素尚無標(biāo)準(zhǔn)品, 其去簇電壓和碰撞能參照Costa等(2015)2058提出的方法進(jìn)行設(shè)置。采用正離子掃描模式下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)對(duì)毒素進(jìn)行檢測(cè), 優(yōu)化后毒素離子對(duì)及去簇電壓和碰撞能設(shè)置見表3。在對(duì)無標(biāo)準(zhǔn)品的麻痹性貝毒進(jìn)行分析時(shí), 假定其與結(jié)構(gòu)相近的其他有標(biāo)毒素具有相同的質(zhì)譜響應(yīng), 即C3、C4、GC1、GC2、GC3、GC4、GC5與GC6分別參照C1、C2、GTX2、GTX3、STX、GTX1、GTX4和NEO的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析。

表2 液-質(zhì)聯(lián)用法分析麻痹性貝毒的洗脫梯度

Tab.2 Elution gradient in paralytic shellfish toxin analysis by HPLC-MS

表3 麻痹性貝毒質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

Tab.3 Mass spectrometry detection parameters of paralytic shellfish toxins

續(xù)表

2 結(jié)果

2.1 太平洋亞歷山大藻與鏈狀裸甲藻產(chǎn)毒情況

本研究中太平洋亞歷山大藻產(chǎn)生的麻痹性貝毒主要包括GTX1&4、GTX5和C1&2等, 毒素比例從高到低依次為GTX4 (45.6%)、GTX1 (24.3%)、C1 (17.7%)、C2 (7.8%)和GTX5 (4.5%)(圖2a)。毒素含量約8.38 fmol/cell。鏈狀裸甲藻產(chǎn)生的水溶性毒素成分主要為GTX5、GTX6、C1、C2、C3、C4, 以及微量的dcSTX和dcGTX2&3, 約占毒素總量的59%; 脂溶性的GC毒素主要包括GC2、GC3、GC5和GC6以及微量的GC1(圖2b), 約占毒素總量的41%。各種水溶性毒素的比例從高到低依次為GTX6 (37.58%)、C2 (12.63%)、C4 (5.90%)、GTX5 (1.66%)、C1 (0.82%)、C3 (0.16%)、dcSTX (0.08%)和dcGTX2&3 (0.02%); 而GC毒素比例由高到低依次為GC5 (27.38%)、GC6 (6.38%)、GC3 (5.24%)和GC2 (2.16%), GC1毒素含量低于定量限。經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算, 該株藻種麻痹性貝毒的含量約為456 fmol/cell。

2.2 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻后體內(nèi)麻痹性貝毒變化情況

投喂亞歷山大藻前, 毛蚶體內(nèi)未檢出麻痹性貝毒。投喂8 h內(nèi)毛蚶已幾乎完全濾食藻細(xì)胞, 12 h后水體內(nèi)無剩余藻細(xì)胞。在投喂后第1 h內(nèi)毛蚶體內(nèi)即檢測(cè)到麻痹性貝毒, 含量為0.03 nmol/g。毒素含量在1～12 h內(nèi)逐漸增加, 至12 h時(shí)達(dá)到峰值1.41 nmol/g (圖3a)。在此期間, 毛蚶毒性也逐步上升, 并在12 h達(dá)到最高值111 μg STXeq/kg。計(jì)算結(jié)果表明, 毛蚶幾乎將投喂的太平洋亞歷山大藻中全部毒素都攝入體內(nèi)。此后, 毛蚶開始排出毒素, 毒素含量逐漸下降, 毒性也相應(yīng)下降, 至48 h毒性下降到44 μg STXeq/kg。實(shí)驗(yàn)過程中毛蚶的毒性變化與其體內(nèi)毒素含量變化基本一致。

圖2 太平洋亞歷山大藻(a)與鏈狀裸甲藻(b)產(chǎn)毒狀況

圖3 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻(a)和鏈狀裸甲藻(b)后體內(nèi)毒素含量與毒性變化情況

實(shí)驗(yàn)期間毛蚶體內(nèi)共檢測(cè)到4種麻痹性貝毒, 分別是GTX2、GTX3、C1、C2。其中GTX2、GTX3在亞歷山大藻中未檢出, 而亞歷山大藻中的GTX1、GTX4和GTX5在毛蚶中未檢出。毛蚶中最主要的毒素成分是C1和GTX2, C2和GTX3占比較低。實(shí)驗(yàn)期間毛蚶體內(nèi)C1占比逐漸下降, 而GTX2占比逐漸上升(圖4a)。

2.3 毛蚶攝食鏈狀裸甲藻后體內(nèi)麻痹性貝毒變化情況

投喂鏈狀裸甲藻前, 毛蚶體內(nèi)未檢出麻痹性貝毒。投喂鏈狀裸甲藻12 h內(nèi), 毛蚶幾乎完全濾食鏈狀裸甲藻細(xì)胞。利用液-質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的譜圖見圖5。毛蚶暴露于鏈狀裸甲藻中2 h后體內(nèi)即可檢出麻痹性貝毒, 暴露后前4 h毛蚶體內(nèi)毒素保持快速增加, 達(dá)到2.91 nmol/g, 毛蚶毒性達(dá)到149 μg STXeq/kg(圖3b)。此后毛蚶體內(nèi)毒素總量雖然保持上升趨勢(shì), 但上升速率明顯降低, 第24 h毒素含量達(dá)到最高水平3.18 nmol/g, 毒性也達(dá)到峰值207 μg STXeq/kg。據(jù)估算, 毛蚶未能將投喂的鏈狀裸甲藻中全部毒素?cái)z入體內(nèi), 累積毒素總量約占鏈狀裸甲藻中毒素總量的24%。自24 h后, 毛蚶開始排出毒素, 體內(nèi)毒素總量逐漸下降。

在攝入鏈狀裸甲藻后, 毛蚶體內(nèi)檢出的水溶性麻痹性貝毒成分主要包括GTX5、GTX6、dcSTX、STX、C1&2、C3&4、GTX2&3和dcGTX2&3, 其中GTX2&3和STX在鏈狀裸甲藻中未檢出。毒素累積階段, 毛蚶體內(nèi)GTX6占比最高, 且逐漸增加; 其次是dcSTX和GTX5(圖4b), dcSTX和dcGTX2&3占比也明顯高于鏈狀裸甲藻。在毒素排出階段, dcSTX逐漸成為毛蚶體內(nèi)主要的水溶性毒素組分, 最高占比達(dá)到34%, 而GTX6所占比例逐漸下降。在鏈狀裸甲藻產(chǎn)生的麻痹性貝毒中, dcSTX所占比例極小, 但在毛蚶體內(nèi)逐漸成為最主要的毒素成分。毛蚶體內(nèi)的C1&2、C3&4、dcGTX2&3、GTX2&3和STX毒素含量較低, 占毒素總量的比例也較小。對(duì)脂溶性麻痹性貝毒的分析結(jié)果表明, 實(shí)驗(yàn)過程中毛蚶體內(nèi)GC毒素占比略低于鏈狀裸甲藻。實(shí)驗(yàn)開始后4 h內(nèi), 毛蚶體內(nèi)GC毒素含量逐漸增加, GC2是主要的脂溶性麻痹性貝毒成分, GC3含量略低于GC2(圖4b)。4 h后, GC毒素總量逐漸下降, GC3開始成為主要的毒素成分, 其次是GC2、GC5和GC6則含量較低。

圖4 毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻(a)和鏈狀裸甲藻(b)后體內(nèi)麻痹性貝毒占比變化情況

圖5 利用液-質(zhì)聯(lián)用法分析毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的色譜圖

注: a: 水溶性麻痹性貝毒標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖; b: 毛蚶樣品中水溶性麻痹性貝毒色譜圖; c: 毛蚶樣品中GC毒素色譜圖

3 討論

毛蚶是我國近海常見的貝類, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(陳辰, 2015)。本研究發(fā)現(xiàn), 毛蚶在暴露于產(chǎn)毒藻后, 會(huì)快速累積麻痹性貝毒, 具備一定的毒素累積能力。在產(chǎn)毒藻赤潮期間, 毛蚶有可能通過攝食產(chǎn)毒藻而蓄積高含量的麻痹性貝毒, 對(duì)消費(fèi)者健康乃至生命安全造成威脅。因此, 對(duì)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化過程與規(guī)律的探究對(duì)于深入了解麻痹性貝毒風(fēng)險(xiǎn)、保護(hù)海產(chǎn)品消費(fèi)者健康具有重要意義。目前, 針對(duì)貝類體內(nèi)麻痹性貝毒的累積、轉(zhuǎn)化和排出過程已開展了大量研究, 揭示了貽貝、扇貝、牡蠣等諸多貝類中麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化過程和規(guī)律(Choi, 2003; Kwong, 2006; Wiese, 2010)。本研究選擇了太平洋亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻作為產(chǎn)毒藻種, 前者主要產(chǎn)生-磺酰氨甲酰基類毒素和氨基甲酸酯類毒素, 后者主要產(chǎn)生-磺酰氨甲?；惗舅睾椭苄缘腉C毒素, 二者毒素組成存在一定的互補(bǔ)性, 通過對(duì)比分析毛蚶暴露于上述兩種產(chǎn)毒藻后體內(nèi)麻痹性貝毒含量和組成的變化, 對(duì)毛蚶轉(zhuǎn)化麻痹性貝毒的過程進(jìn)行了研究和分析。

3.1 R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)

毛蚶暴露于太平洋亞歷山大藻后, 體內(nèi)出現(xiàn)了較多的GTX2&3, 這在投喂的太平洋亞歷山大藻中沒有檢測(cè)到; 而太平洋亞歷山大藻產(chǎn)生的GTX1&4, 在毛蚶中卻未被檢出。說明在毛蚶體內(nèi)發(fā)生了麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化。毛蚶體內(nèi)出現(xiàn)的GTX2&3可能是由GTX1&4通過R1位點(diǎn)的羥基還原反應(yīng)產(chǎn)生, 這一反應(yīng)目前也已在扇貝、貽貝等多種貝類中被確認(rèn)(Shimizu, 1981; Andres, 2019)。本研究發(fā)現(xiàn), 暴露于太平洋亞歷山大藻后, 毛蚶體內(nèi)未檢測(cè)到GTX1&4, 這可能由于貝類對(duì)不同毒素的選擇性排出(DeGrasse, 2014; Tobke, 2021)造成的。然而, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 暴露于太平洋亞歷山大藻的毛蚶體內(nèi)毒素總量與投喂的亞歷山大藻中毒素總量基本相當(dāng), 表明實(shí)驗(yàn)期間毛蚶對(duì)毒素的選擇性排出過程可以忽略。由此推測(cè), 毛蚶中的GTX1&4主要通過羥基還原過程生成了GTX2&3。在向毛蚶投喂太平洋亞歷山大藻的實(shí)驗(yàn)中, 所有取樣階段均未在毛蚶體內(nèi)檢測(cè)到GTX1&4, 表明毛蚶中R1位點(diǎn)羥基的還原反應(yīng)具有較高的反應(yīng)速率。在部分貝類中, 當(dāng)存在谷胱甘肽等還原劑時(shí), R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)還可能伴有R2和R3位點(diǎn)磺酸基團(tuán)的還原(Bricelj, 1998362; 朱明遠(yuǎn)等, 2003)。本研究發(fā)現(xiàn), 毛蚶在暴露于太平洋亞歷山大藻時(shí), GTX2&3產(chǎn)生后并未出現(xiàn)STX, 推測(cè)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的還原反應(yīng)具有一定的位點(diǎn)特異性。

對(duì)比分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè), R1位點(diǎn)的羥基還原反應(yīng)與毛蚶攝入鏈狀裸甲藻后STX的產(chǎn)生也有一定關(guān)系。STX的產(chǎn)生源自GTX5 R4位點(diǎn)的磺酸基水解過程。本實(shí)驗(yàn)中使用的太平洋亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻均能產(chǎn)生少量GTX5, 但毛蚶在攝入鏈狀裸甲藻后體內(nèi)出現(xiàn)STX, 而攝入太平洋亞歷山大藻后卻未檢測(cè)到STX, 推測(cè)鏈狀裸甲藻中高含量的GTX6在毛蚶體內(nèi)發(fā)生R1位點(diǎn)羥基的還原反應(yīng), 持續(xù)轉(zhuǎn)化生成GTX5并進(jìn)一步通過水解反應(yīng)產(chǎn)生了可檢測(cè)到的STX。而太平洋亞歷山大藻中GTX5含量較少, 即便發(fā)生了轉(zhuǎn)化, STX含量也不足以被檢測(cè)。

3.2 R4位點(diǎn)磺酸基和羥基苯甲酸基團(tuán)的水解反應(yīng)

根據(jù)以往研究, 毛蚶體內(nèi)出現(xiàn)的GTX2&3還可能源自C1&2 R4位磺酸基的水解過程, 這一過程也在多種貝類中被證實(shí)。Asakawa等(1995)研究認(rèn)為, 紫貽貝和牡蠣中可能存在C1&2水解轉(zhuǎn)化為GTX2&3的過程, Choi等(2003)933發(fā)現(xiàn)在翡翠貽貝消化腺中也存在類似過程, 邴曉菲等(2017)也證實(shí)了櫛孔扇貝中同樣存在此類毒素轉(zhuǎn)化過程。將毛蚶攝食太平洋亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻后體內(nèi)毒素成分的變化情況進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn), 在攝入同樣產(chǎn)C1&2但不產(chǎn)生GTX1&4的鏈狀裸甲藻后, 毛蚶體內(nèi)也出現(xiàn)了GTX2&3, 而鏈狀裸甲藻中的其他麻痹性貝毒都無法直接轉(zhuǎn)化為GTX2&3, 這說明毛蚶中的GTX2&3可以來自C1&2的水解。

在暴露于鏈狀裸甲藻的毛蚶體內(nèi)檢測(cè)到藻中含量極低的脫氨甲?；惗舅豥cGTX2&3與dcSTX, 表明鏈狀裸甲藻產(chǎn)生的某些毒素在毛蚶體內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)化, 生成了脫氨甲?；惗舅?。毛蚶在攝入太平洋亞歷山大藻后, 體內(nèi)并未檢測(cè)到任何脫氨甲?；惗舅? 側(cè)面反映了太平洋亞歷山大藻產(chǎn)生中的C1&2, GTX1&4等毒素成分不會(huì)在毛蚶體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成脫氨甲酰基類毒素。毛蚶攝入鏈狀裸甲藻后體內(nèi)出現(xiàn)的脫氨甲酰基類毒素只可能來自鏈狀裸甲藻中的獨(dú)特的GC毒素。Vale(2008)1已通過研究指出, GC毒素可以通過R4位羥基苯甲酸基團(tuán)的水解反應(yīng), 生成相應(yīng)的脫氨甲酰基類毒素。因此, 毛蚶體內(nèi)的脫氨甲?；惗舅刈钣锌赡軄碜訥C毒素的水解反應(yīng), 如GC1&2轉(zhuǎn)化生成dcGTX2&3, GC3轉(zhuǎn)化生成dcSTX。毛蚶攝入太平洋亞歷山大藻后未產(chǎn)生脫氨甲酰基類毒素, 說明此類水解反應(yīng)具有一定的特異性, 僅對(duì)R4位點(diǎn)為羥基苯甲酸基團(tuán)的GC毒素有作用。本研究中未在毛蚶體內(nèi)檢測(cè)到GC4&5和GC6的水解產(chǎn)物dcGTX1&4和dcNEO, 其中, dcGTX1&4并未被納入本研究的檢測(cè)范圍, 無法證明GC4&5的水解反應(yīng)是否發(fā)生; 而本研究對(duì)dcNEO的檢測(cè)限相對(duì)較高, 對(duì)dcNEO的檢測(cè)具有一定局限性。因此, 目前仍無法確證毛蚶體內(nèi)是否存在GC4&5和GC6的水解轉(zhuǎn)化過程。本研究中使用的鏈狀裸甲藻GC5占比很高, 而毛蚶體內(nèi)GC5占比明顯下降, 說明GC5很可能在毛蚶體內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)化。毛蚶中GC2占比的明顯增加, 說明GC5極有可能通過R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)生成了相應(yīng)的GC2。這些轉(zhuǎn)化過程仍有待于更深入的研究進(jìn)行確證。

3.3 毛蚶體內(nèi)毒素轉(zhuǎn)化過程與其他貝類的差異

本研究發(fā)現(xiàn), 毛蚶體內(nèi)主要存在三類麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程, 分別是R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)、R4位點(diǎn)磺酸基團(tuán)的水解反應(yīng)和R4位點(diǎn)羥基苯甲酸基團(tuán)的水解反應(yīng)(圖6)。但是, 也有以往報(bào)道過的麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化過程在此次實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)。首先是麻痹性貝毒空間異構(gòu)體的差向異構(gòu)化反應(yīng)。在產(chǎn)毒藻種中, 通常型毒素占比更高, 而在貝類中麻痹性貝毒會(huì)通過差向異構(gòu)化生成更為穩(wěn)定的型毒素(Asakawa, 2006), 最后達(dá)到:=3:1的比例(Bricelj, 1998359; 柳陽, 201792)。本次實(shí)驗(yàn)中沒有觀察到明顯的差向異構(gòu)化反應(yīng), 可能與實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短、差向異構(gòu)化反應(yīng)速率較慢有關(guān)。但研究中也發(fā)現(xiàn), 鏈狀裸甲藻中型的GC1的含量很低, 占比遠(yuǎn)低于其型同分異構(gòu)體GC2; 而在毛蚶體內(nèi), 由GC1轉(zhuǎn)化而來的dcGTX2占比卻高于由GC2轉(zhuǎn)化而來的dcGTX3。這說明在GC1&2發(fā)生羥基苯甲酸基團(tuán)水解反應(yīng)的同時(shí), 也出現(xiàn)了差向異構(gòu)化反應(yīng)。但目前無法確定毒素的差向異構(gòu)化反應(yīng)與水解反應(yīng)時(shí)間的先后, 仍有待于進(jìn)一步研究。

圖6 毛蚶體內(nèi)可能發(fā)生的各類毒素轉(zhuǎn)化過程

注: 虛線箭頭表示該反應(yīng)為理論上可能發(fā)生的過程

此外, 本研究也未在毛蚶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)-磺酰氨甲?；惗舅鼗虬被姿狨ヮ惗舅厮馍擅摪奔柞；惗舅氐拿复俎D(zhuǎn)化過程(Raposo, 2020)4。Samsur等(2006)在錦蛤()中發(fā)現(xiàn)C1&2可以被轉(zhuǎn)化生成dcGTX2&3。在象拔蚌()中也發(fā)現(xiàn)C1&2轉(zhuǎn)化為GTX5后水解生成dcSTX的轉(zhuǎn)化反應(yīng)(Medina-Elizalde, 2018)。毛蚶在攝入產(chǎn)C1&2的太平洋亞歷山大藻后, 體內(nèi)未檢測(cè)到脫氨甲?；惗舅? 說明毛蚶中可能缺乏磺氨甲?；饷? 難以促成-磺酰氨甲?；乃夥磻?yīng)。同樣, 在多種貝類中發(fā)現(xiàn)的氨基甲酸酯類毒素轉(zhuǎn)化生成相應(yīng)的脫氨甲?；惗舅氐霓D(zhuǎn)化過程, 也是一種典型的酶促水解反應(yīng)。在中國飛蛤()中分離出了能夠轉(zhuǎn)化氨基甲酸酯類毒素為脫氨甲酰基類毒素的氨甲?；饷?Lin, 2004)。在本研究中, 毛蚶攝入太平洋亞歷山大藻后體內(nèi)并未檢測(cè)到脫氨甲酰基類毒素, 說明了毛蚶中也可能缺乏氨甲?；饷? 無法催化進(jìn)行此類轉(zhuǎn)化反應(yīng)。綜上, 毛蚶中可能缺少催化-磺酰氨甲?；虬奔柞；獾拿割? 但是存在能夠催化羥基苯甲酸基團(tuán)水解反應(yīng)的酶。

3.4 毒素轉(zhuǎn)化過程對(duì)毛蚶毒性的影響

毛蚶體內(nèi)發(fā)生的麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化過程可能會(huì)顯著影響毛蚶的毒性。本研究發(fā)現(xiàn)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化過程主要包括R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)、R4位點(diǎn)磺酸基團(tuán)水解反應(yīng)和R4位點(diǎn)羥基苯甲酸基團(tuán)水解反應(yīng)。R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)對(duì)毛蚶的毒性可能有重要影響。一般來說, R1位點(diǎn)為羥基的麻痹性貝毒組分毒性高于對(duì)應(yīng)的R1位點(diǎn)為氫的麻痹性貝毒組分(Leal, 2022)21, 因此, 毛蚶體內(nèi)的R1位點(diǎn)羥基還原反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致毒性降低。同樣, R4位點(diǎn)的水解反應(yīng)也會(huì)顯著改變毛蚶體內(nèi)毒素組成, 從而影響其毒性。在麻痹性貝毒中,-磺酰氨甲酰基類毒素與鈉離子通道的結(jié)合能力最差, 毒性也相對(duì)最低; 而氨基甲酸酯類毒素則是毒性最高的毒素, 脫氨甲?；惗舅氐亩拘晕挥趦烧咧g。-磺酰氨甲?；惗舅赝ㄟ^水解反應(yīng)生成相應(yīng)的氨基甲酸酯類毒素, 會(huì)導(dǎo)致貝類毒性的顯著上升。目前, 對(duì)于毛蚶中GC毒素的水解反應(yīng), 仍難以判斷其對(duì)毛蚶毒性的影響。此外, M毒素是貝類攝食麻痹性貝毒產(chǎn)毒藻后的重要代謝物, 毒性水平較低, 有助于其快速脫毒(Vale, 2010; Ding, 2017)。本研究聚焦于各類型麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化過程, 并未分析該類代謝物, 需要在后續(xù)研究中予以關(guān)注。總體而言, 毛蚶體內(nèi)的麻痹性貝毒轉(zhuǎn)化過程較為復(fù)雜, 對(duì)毒性的影響需要結(jié)合產(chǎn)毒藻的毒素種類進(jìn)行具體分析。為防范毛蚶帶來的麻痹性貝毒中毒風(fēng)險(xiǎn), 仍需加強(qiáng)對(duì)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的監(jiān)測(cè), 避免造成中毒事件。

4 結(jié)論

本研究通過選擇典型產(chǎn)毒藻種開展模擬實(shí)驗(yàn), 揭示了毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的三類主要轉(zhuǎn)化過程, 包括R1位點(diǎn)羥基的還原反應(yīng)、R4位點(diǎn)磺酸基團(tuán)的水解反應(yīng), 以及R4位點(diǎn)羥基苯甲酸基團(tuán)的水解反應(yīng), 推測(cè)毛蚶體內(nèi)缺少可催化-磺酰氨甲?；惗舅睾桶被姿狨ヮ惗舅厮膺^程的酶。這些發(fā)現(xiàn)說明毛蚶對(duì)麻痹性貝毒的轉(zhuǎn)化反應(yīng)較為多樣化, 且有一定的獨(dú)特性, 可能導(dǎo)致毛蚶體內(nèi)毒素組成與產(chǎn)毒藻種或其他貝類存在差異, 需要加強(qiáng)對(duì)毛蚶體內(nèi)麻痹性貝毒的監(jiān)測(cè)和研究。

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BIOTRANSFORMATION OF PARALYTIC SHELLFISH TOXINS IN BLOOD CLAM

LIN Zhuo-Ru1, 3, GENG Hui-Xia1, TANG Wen-Jiao1, 5, YU Ren-Cheng1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 5. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The accumulation of paralytic shellfish toxins in marine bivalves pose severe threats to human health.may contain high concentrations of paralytic shellfish toxins, yet toxin biotransformation in.and its effect on the toxicity of the bivalve remain largely unknown. Therefore, biotransformation of paralytic shellfish toxins in.were investigated by feeding.with two toxin-producing dinoflagellates,and. Reduction of hydroxyl at R1, hydrolysis of sulfocarbamoyl group at R4 in-sulfocarbamoyl toxins, and hydrolysis of hydroxybenzoate group at R4 intoxins are the main biotransformation processes in.. The complex biotransformation of paralytic shellfish toxins in.contributes to the uncertainty of toxicity. To reduce risks associated with paralytic shellfish poisoning, further investigations on accumulation, transformation, and elimination of paralytic shellfish toxins in.should be carried out, and more efforts are needed to monitor toxins in..

paralytic shellfish toxins;;;;toxins; toxin biotransformation

X174

10.11693/hyhz20220100024

*國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃, 2017YFC1600701號(hào); 科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(xiàng), 2018FY100202號(hào); 國家自然科學(xué)基金委員會(huì)聯(lián)合基金項(xiàng)目, U20A20104號(hào)。林卓如, 博士研究生, E-mail: linzhuoru@qdio.ac.cn

于仁成, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: rcyu@qdio.ac.cn

2022-01-26,

2022-03-21