施用不同有機(jī)物料對砂質(zhì)土壤玉米成熟期根際細(xì)菌群落變化的影響

郝近羽 劉 瑾 陳源泉 代紅翠 李 超 徐 潔 隋 鵬*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，北京 100193；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，濟(jì)南 250100；3.吳橋縣科技局，河北 滄州 061800)

土壤微生物活躍于陸地生態(tài)系統(tǒng)中，是影響土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分循環(huán)和病蟲害防治等生態(tài)功能的關(guān)鍵因素之一[1]，對維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及改善土壤肥力等具有重要作用[2-3]。細(xì)菌是數(shù)量最多且種群最豐富的土壤微生物，作為生態(tài)系統(tǒng)碳、氮、磷循環(huán)中的核心環(huán)節(jié)，土壤細(xì)菌通過分解作用對養(yǎng)分元素進(jìn)行礦化，構(gòu)成特殊的無機(jī)—有機(jī)—生物復(fù)合體釋放到土壤中，推動著生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動[4]。作物根際是“作物—細(xì)菌—土壤”相互影響最強(qiáng)烈的區(qū)域，這種現(xiàn)象被稱為根際效應(yīng)(Rhizosphere effect)[5]。根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性受還田措施、土壤類型和作物品種等因素的影響，研究根際土壤細(xì)菌群落特征對于探究土壤對不同類型有機(jī)物料還田措施的響應(yīng)具有重要意義。

王伏偉等[6]基于Illumina平臺Miseq高通量測序技術(shù)對小麥分蘗期砂姜黑土耕層土壤細(xì)菌進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)施用化肥會導(dǎo)致土壤pH顯著下降、土壤板結(jié)，顯著降低了土壤細(xì)菌的豐富度，酸桿菌門相對豐度最??；秸稈還田顯著提高了土壤細(xì)菌的多樣性，大幅提高了土壤中放線菌門的相對豐度，這可能與秸稈還田處理中全氮含量較高有一定的關(guān)系，同時還大幅降低主要參與芳香化合物分解的鞘氨醇單胞菌的相對豐度。王穎等[7]將不同類型和比例的生物炭添加到黃土高原半干旱區(qū)土壤中，發(fā)現(xiàn)施用生物炭對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響，銨態(tài)氮是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子，土壤中銨態(tài)氮的含量與放線菌門的豐度呈顯著正相關(guān)，而與綠彎菌門的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。商麗榮等[8]以呼倫貝爾天然羊草草原退化打草場為研究對象，發(fā)現(xiàn)45 t/hm2的蚯蚓糞和菌渣混合施用可提高土壤細(xì)菌群落的生物多樣性，同時發(fā)現(xiàn)有效氮、有效鉀、有機(jī)質(zhì)和全鉀是細(xì)菌群落的主要驅(qū)動因素。關(guān)于秸稈[6]、生物炭[7]以及畜禽糞便[8]等類型的有機(jī)物料還田對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響的研究已有初步結(jié)論，但由于有機(jī)物料自身成分的復(fù)雜性以及各區(qū)域土壤類型多樣性，土壤微生物群落受土壤理化性質(zhì)影響的程度和機(jī)理尚無定論。

Illumina高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)被廣泛應(yīng)用于各種土壤環(huán)境的細(xì)菌多樣性研究領(lǐng)域，能夠比較真實(shí)地反映出環(huán)境細(xì)菌的代謝及生態(tài)響應(yīng)情況，具有通量高、準(zhǔn)確率高、操作簡便和成本低等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。近年來，已有較多文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于我國寧夏回族自治區(qū)銀北地區(qū)龜裂堿土[11]、內(nèi)蒙古自治區(qū)西遼河平原砂壤土[12]、山東省[13]以及云南省山區(qū)和半山區(qū)[14]等土壤類型對細(xì)菌群落多樣性的影響，但對于華北平原砂質(zhì)瘠薄型土壤方面的研究鮮有報(bào)道。本研究利用Miseq PE300高通量測序技術(shù)以及PICRUSt功能預(yù)測分析的方法，同時結(jié)合土壤環(huán)境因子，分析不同有機(jī)物料還田對玉米成熟期根際土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能，旨在探究有機(jī)物料還田后土壤理化性質(zhì)對細(xì)菌群落變化的影響，以期為該區(qū)域合理施用有機(jī)物料還田提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)依托中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳橋?qū)嶒?yàn)站，該實(shí)驗(yàn)站位于河北省滄州市吳橋縣(37°41′ N，116°37′ E)，年均氣溫13 ℃，年均降雨量562 mm，年均日照時數(shù)2 340 h，無霜期201 d，屬于溫帶季風(fēng)氣候。供試土壤類型為砂土，其中砂粒含量84.09%，粉粒含量9.73%，粘粒含量6.18%。長期定位試驗(yàn)始于2012年，試驗(yàn)開始前土壤有機(jī)質(zhì)含量為1.46 g/kg，全氮含量為0.21 g/kg，有效磷含量為4.86 mg/kg，速效鉀含量為55.85 mg/kg，pH 8.71。種植模式為冬小麥-夏玉米一年兩熟復(fù)種輪作，小麥品種為‘濟(jì)麥22’，條播，播量225 kg/hm2；玉米品種為‘鄭單958’，穴播，種植密度為67 500 株/hm2。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用微區(qū)試驗(yàn)方法，先剝離表土層，用水泥圍砌成微區(qū)，每個微區(qū)的面積為4.0 m×5.1 m=20.4 m2，然后將供試土壤均勻地回填到各微區(qū)內(nèi)，回填深度為50 cm。以秸稈(ST)還田為主對照，單施化肥(CF)為副對照，設(shè)置了豬糞(PM)、沼渣(BR)和秸稈生物炭(BC)3種有機(jī)物料還田，共5個處理，每個處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。所用秸稈來自試驗(yàn)地周圍普通大田收獲的小麥和玉米秸稈，腐熟的豬糞購于當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)場，沼渣為豬糞厭氧發(fā)酵而成，購于石家莊市泥香生物科技有限公司，秸稈生物質(zhì)炭購于河南省三利新能源公司。試驗(yàn)地產(chǎn)生的秸稈全部移除，不進(jìn)行還田。小麥秸稈在玉米苗期覆蓋還田，玉米秸稈、豬糞、沼渣和生物炭在小麥播種前翻耕還田，通過3次翻耕使有機(jī)物料、無機(jī)肥與耕作層土壤混勻，不會擾動底層土壤。

由表1可知，本試驗(yàn)3種有機(jī)物料還田處理和ST均以等氮量投入為原則，周年總還氮量均為555 kg/hm2(有機(jī)物料還氮量與無機(jī)肥施用量的總和)。3種有機(jī)物料還田的周年還碳量以主對照(秸稈投入量為小麥7 500 kg/hm2和玉米9 000 kg/hm2，ST)的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮其他物料的碳氮比以及農(nóng)田施用有機(jī)肥的實(shí)際情況，生物炭處理的還碳量與主對照相同，豬糞與沼渣處理的還碳量均為主對照的1/2。同時，處理組(PM、BR和BC)和對照組(ST和CF)在小麥季和玉米季播種期配施磷肥150 kg/hm2和鉀肥150 kg/hm2。

表1 不同有機(jī)物料的周年還田量Table 1 Annual application rate of different organic materials amendment kg/hm2

1.3 樣品采集

采用五點(diǎn)取樣法，于2020年10月(物料還田第8年)收獲期時收集玉米根際土壤。采集根際土壤的具體方法：采集時去除玉米根部大塊土壤裝入塑封袋帶內(nèi)，冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。然后晃動玉米根部，去除根部松散的表層土壤，使用無菌刷子收集與玉米根系緊密貼合的土壤，即為根際土壤[15]。將同一處理的多點(diǎn)取樣土壤樣本等量混合均勻后，按試驗(yàn)需求分別保存：用于提取土壤DNA的樣品用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存；用于測定土壤理化性質(zhì)的樣品需風(fēng)干、研磨。

1.4 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)的測定方法參考《土壤農(nóng)化分析》[16]，土壤全氮(TN)采用凱氏定氮法，有效磷(AP)采用鉬銻抗分光光度法，速效鉀(AK)采用火焰光度法，有機(jī)質(zhì)(SOM)采用重鉻酸鉀外加熱法，pH采用5∶1水浸-電位法，容重(SBD)采用環(huán)刀法，水分含量(SWC)采用烘干法。

1.5 土壤細(xì)菌群落多樣性測定

用DNA Kit(Omega Bio-Tek，Doraville，GA，USA)試劑盒提取玉米根際土壤DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，核酸蛋白儀(NanoDrop ND-2000)測定DNA 濃度和純度。選用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用TransGen AP221-02試劑盒，擴(kuò)增體系為20 μL：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上下游引物(5 μmol/L)各0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，DNA模板10 ng，ddH2O補(bǔ)至20 μL。于ABI GeneAmp?9700型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min。每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進(jìn)行純化，并用QuantusTMFluorometer(Promega，USA)進(jìn)行檢測定量。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始測序數(shù)據(jù)使用Fastp(Version 0.20.0)軟件[17]對序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH(Version 1.2.7)軟件[18]進(jìn)行拼接，使用UPARSE(Version 7.1)軟件[19]對97%相似水平的OTU(Operational Taxonomic Units)序列進(jìn)行聚類并剔除嵌合體，使用RDP classifier(Version 2.2)算法[20]對序列進(jìn)行分類學(xué)分析，與Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138)比對，得到每個OTU對應(yīng)的分類學(xué)信息。

利用Mothur(Version 1.31.2)軟件進(jìn)行α多樣性分析，包含豐富度(Chao 1和ACE)和多樣性(Shannon)?；贘accard距離算法，在考慮共有物種相對豐度的情況下，進(jìn)行β多樣性分析來比較各處理間的物種群落差異。去趨勢對應(yīng)分析(DCA，Detrended Correspondence Analysis)第一排序軸的梯度長度(LGA，Lengths of Gradient)為0.824 8，LGA<3說明土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間適合線性模型，采用Canoco 5進(jìn)行冗余分析(RDA，Redundancy Analysis)，用Duncan’s多重比較方法檢驗(yàn)差異顯著性，數(shù)據(jù)處理和作圖采用Microsoft Excel 2013、SPSS 20.0和R語言軟件。采用PICRUSt2軟件進(jìn)行功能預(yù)測分析，與EggNOG(Evolutionary genealogy of genes：Non-supervised Orthologous Groups)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得相關(guān)功能和代謝通路的預(yù)測信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細(xì)菌群落多樣性

由表2可知，細(xì)菌群落覆蓋度(Coverage)顯示各處理的土壤OTUs測序深度涵蓋了土壤中96%以上的細(xì)菌，能夠比較真實(shí)地反映土壤細(xì)菌群落的情況。各處理土壤細(xì)菌群落豐富度的2個指標(biāo)(Chao 1和ACE)由高到低均為：PM>BR>ST>BC>CF，說明豬糞、沼渣和生物炭還田后均可提高土壤細(xì)菌群落的豐富度，增加了群落內(nèi)物種的數(shù)目。各處理土壤細(xì)菌群落的多樣性(Shannon)由高到低為：ST>BC>BR>CF>PM，說明不同有機(jī)物料還田影響了根際土壤的細(xì)菌群落的物種豐富度和均勻度，生物炭和沼渣還田后顯著增加了土壤細(xì)菌群落多樣性，但豬糞還田后顯著降低了土壤細(xì)菌群落多樣性。

表2 不同有機(jī)物料還田后土壤細(xì)菌高通量測序結(jié)果及群落α多樣性指數(shù)Table 2 Illumina MiSeq sequencing results and α-diversity of soil bacterialcommunity under different organic materials amendment

由圖1可知，不同有機(jī)物料還田后土壤細(xì)菌群落的組間差異大于組內(nèi)差異(R2=0.937 8)。土壤細(xì)菌在OTU水平下的第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)對群落差異性的貢獻(xiàn)率分別為 51.22% 和12.90%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為64.12%。對照組(ST和CF)和BC處理均分布在PC1負(fù)值區(qū)域，且3個處理之間的距離較近，說明相似度較高，而PM和BR處理均分布在PC1正值區(qū)域，與上述3個處理之間有較為明顯的分離，表明不同有機(jī)物料還田后顯著改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(P<0.001)。

每個點(diǎn)代表一個樣品，同處理的樣品用同一種顏色表示，同處理的樣品連線后形成分組橢圓。Each point in the diagram represents a sample, and the samples of the same treatment are shown in the same color. Group ellipsoid is formed by the connection of the samples of the same treatment.

2.2 土壤細(xì)菌群落分布特征

由圖2可知，各處理的土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門(相對豐度>10%)主要為放線菌門(Actinobacteriota)占18.48%～26.85%、變形菌門(Proteobacteria)占18.79%～26.16%、酸桿菌門(Acidobacteria)占12.12%～17.27%以及綠彎菌門(Chloroflexi)占10.21%～15.73%。此外，BR和PM處理的優(yōu)勢菌門還包含厚壁菌門(Firmicutes)。各處理的優(yōu)勢菌門累計(jì)豐度占土壤總細(xì)菌群落相對豐度的75%以上，能夠在較大程度上代表土壤中主要細(xì)菌群落豐度的變化。BR和PM處理的厚壁菌門相對豐度較高，分別為12.11%和26.01%，分別約為ST(6.51%)的2和4倍，但是，BR和PM處理的其余4種優(yōu)勢菌門的相對豐度均有不同程度的降低，尤以PM的最低，其放線菌門和變形菌門的相對豐度比ST和CF分別降低14.51%和31.17%。BC的酸桿菌門相對豐度(17.27%)比ST(12.86%)提高34.29%。

圖2 不同有機(jī)物料還田后土壤細(xì)菌門水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of soil bacterial community based on phylum level under different organic materials amendment

由表3可知，PM的芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)和土孢桿菌屬(Terrisporobacter)的相對豐度較高，分別為4.51%、6.93%和4.27%，其中，同屬于厚壁菌門的梭菌屬和土孢桿菌屬的相對豐度均顯著高于其他4種處理(P<0.05)。BC的蓋勒氏菌屬(Gaiella)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的相對豐度較高，分別為1.56%、1.41%和1.20%，其中，屬于放線菌門的蓋勒氏菌屬的相對豐度比主對照(ST)提高31.67%(P<0.05)。同時，與ST相比，豬糞、沼渣和生物炭還田后顯著降低了土壤中類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和微枝形桿菌屬(Microvirga)的相對豐度(P<0.05)，此外，還在不同程度上降低了節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、紅桿菌屬(Solirubrobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、芽球菌屬(Blastococcus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的相對豐度，但上述豐度下調(diào)的菌屬在PM、BR和BC之間差異不顯著。

表3 不同有機(jī)物料還田后土壤主要細(xì)菌屬的差異性分析Table 3 Differential analysis of soil dominant bacteria genus under different organic materials amendment

2.3 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

由圖3可知，在門水平上，環(huán)境因子對土壤細(xì)菌群落變化的解釋率為61.83%，第一排序軸(RDA1)和第二排序軸(RDA2)的解釋率分別為51.58%和10.25%，表明環(huán)境因子在較大程度上可以解釋土壤細(xì)菌群落的差異。結(jié)果表明，土壤有效磷(AP)對土壤細(xì)菌群落分布影響最顯著(R2=0.872 1，P<0.05)。

每個點(diǎn)代表一個樣品，同處理的樣品用同一種顏色表示，同處理的樣品連線后形成分組橢圓；圖中的每個箭頭代表一個環(huán)境因子，TN，全氮；AP，有效磷；AK，速效鉀；SOM，土壤有機(jī)質(zhì)；pH，土壤pH；SBD，土壤容重；SWC，土壤水分含量。下同。Each point in the diagram represents a sample, and the samples of the same treatment are shown in the same color, group ellipsoid is formed by the connection of the samples of the same treatment. Each arrow in the diagram represents an environmental factor. TN, total nitrogen; AP, available phosphorus; AK, available potassium; SOM, soil organic matter; pH, soil pH; SBD, soil bulk density; SWC, soil moisture content. The same below.

由表4可知，與其他處理相比，豬糞還田后會通過提高土壤有效磷含量進(jìn)而影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。此外，與ST相比，BR顯著提高土壤全氮含量，還提高土壤水分含量但不顯著；BC顯著提高土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮以及水分含量，這可能是造成不同處理間土壤細(xì)菌群落差異的重要原因之一。

表4 不同有機(jī)物料還田土壤環(huán)境因子Table 4 Environmental factors of the soils in different organic materials amendment

由圖4可知，土壤有效磷與厚壁菌門的梭菌屬(R2=0.753 1，P<0.01)和土孢桿菌屬(R2=0.865 2，P<0.001)的相對豐度均呈顯著正相關(guān)，而與放線菌門的類諾卡氏菌屬(R2=-0.532 1，P<0.05)、節(jié)桿菌屬(R2=-0.534 4，P<0.05)、蓋勒氏菌屬(R2=-0.707 1，P<0.01)、芽球菌屬(R2=-0.760 7，P<0.001)和紅桿菌屬(R2=-0.771 4，P<0.001)以及變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(R2=-0.575 0，P<0.05)、屬于酸桿菌門的苔蘚桿菌屬(Bryobacter)(R2=-0.555 9，P<0.05)的相對豐度均呈顯著負(fù)相關(guān)。土壤pH與放線菌門的蓋勒氏菌屬(R2=0.700 0，P<0.01)的相對豐度呈顯著正相關(guān)，土壤容重與放線菌門的類諾卡氏菌屬(R2=0.632 7，P<0.05)的相對豐度呈顯著正相關(guān)，而土壤全氮(R2=-0.608 2，P<0.05)、有機(jī)質(zhì)(R2=-0.589 3，P<0.05)和水分含量(R2=-0.592 9，P<0.05)均與類諾卡氏菌屬的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，各環(huán)境因子還與一些未分類菌門之間存在正、負(fù)顯著相關(guān)性，環(huán)境因子對土壤放線菌相對豐度的影響最顯著，其次顯著改變了厚壁菌、變形菌和酸桿菌等細(xì)菌的相對豐度。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；越偏紅色表示R2越高，越偏綠色表示R2越低。Significant levels are: * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. Deeper red indicates higher R2, while deeper green indicates lower R2.

2.4 土壤細(xì)菌群落PICRUSt功能預(yù)測

通過與EggNOG數(shù)據(jù)庫比對，可以解析出對應(yīng)的直系同源簇(COG，Cluster of orthologous group)的功能信息和豐度，5種處理共獲得4 421個COG編號信息。由表5可知，各處理間土壤細(xì)菌群落的主要功能蛋白(酶)的種類基本相同，基因序列注釋到催化有機(jī)物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的脫氫酶/還原酶(COG1028)的豐度最高，其次為注釋到一些參與細(xì)胞合成/分解及代謝的組氨酸激酶(COG0642)、主要促進(jìn)劑(COG2814)、NAD依賴性差向異構(gòu)酶/脫水酶(COG0451)、RNA聚合酶(COG1595)和α/β水解酶(COG0596)等。

表5 不同有機(jī)物料還田后土壤細(xì)菌群落主要COG豐度Table 5 The main COG abundance of soil bacterial community underdifferent organic materials amendment 個

由表6可知，5種處理共得到401條代謝通路，按照KEGG代謝通路第一等級將功能分為六大類。基因序列注釋到新陳代謝通路的相對豐度最高(77.82%～78.57%)，其次為遺傳信息加工(6.77%～7.02%)、環(huán)境信息加工(5.14%～5.45%)、細(xì)胞過程(4.34%～4.50%)和人類疾病(3.34%～3.51%)，還有少數(shù)基因序列注釋到生物體系統(tǒng)(1.81%～1.86%)。由于新陳代謝通路為各處理的主要代謝通路類型，進(jìn)一步分析其在第三等級下代謝通路的相對豐度。與ST相比，PM、BR和BC的土壤菌群在嘧啶代謝(ko00240)、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250)和肽聚糖生物合成(ko00550)通路均具有優(yōu)勢，增幅分別為2.25%～6.74%、1.33%～4.00% 和3.13%～7.81%；但均降低了不同環(huán)境中的微生物代謝(ko01120)和脂肪酸代謝(ko01212)通路的相對豐度，降幅分別為0.79%～2.16%和1.08%～5.38%，見表6。此外，豬糞還田處理的土壤菌群還在丙酮酸代謝(ko00620)、卟啉和葉綠素代謝(ko00860)通路均具有優(yōu)勢，增幅分別為1.85% 和5.56%；但降低了甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(ko00260)、丙酸代謝(ko00640)和檸檬酸循環(huán)(ko00020)通路的相對豐度，降幅分別為1.03%、1.28% 和2.70%。

表6 KEGG代謝通路(第三等級)相對豐度的差異性分析Table 6 Differential analysis of KEGG metabolic pathway (level 3) relative abundance

3 討 論

3.1 不同有機(jī)物料還田對土壤細(xì)菌群落組成的影響

本研究中，不同有機(jī)物料還田后玉米根際土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著的變化，豬糞還田后雖然顯著增加土壤細(xì)菌群落所含物種的種類，但是土壤細(xì)菌群落的多樣性顯著降低，可能是因?yàn)樨i糞還田后土壤細(xì)菌群落分布的均一性較差，不同物種之間所含的個體數(shù)相差較大。這與Liu等[21]的研究結(jié)論一致，在水稻-油菜輪作種植區(qū)施用不同還氮量的豬糞(還田氮量分別為90、180和270 kg/hm2)，發(fā)現(xiàn)豬糞還田后使水稻季土壤細(xì)菌群落多樣性下降，且豬糞的還氮量越高，水稻季土壤細(xì)菌群落多樣性下降的幅度越大。與豬糞還田后的結(jié)果相反，生物炭還田后土壤細(xì)菌群落所含物種的豐富度較低，但土壤細(xì)菌群落分布的均一性較好，還田后可以顯著提高土壤細(xì)菌群落多樣性。而沼渣還田后能夠同時提高物種的豐富度和均勻度，進(jìn)而顯著提高土壤細(xì)菌群落的多樣性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，各處理的土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門的種類相同，均為放線菌門、變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，因此，土壤細(xì)菌群落的多樣性變化主要與上述優(yōu)勢菌門的相對豐度密切相關(guān)，其中，放線菌門和變形菌門的細(xì)菌在所有種類中所占的比例最大。已有研究表明，放線菌門和變形菌門廣泛分布于有機(jī)質(zhì)含量高、土壤疏松并且水分條件好的作物根際土壤周圍[22-23]。本研究中，生物炭還田后土壤酸桿菌門的相對豐度顯著高于其他處理，比秸稈處理增加34.29%，可能是由于生物炭還田后刺激了酸桿菌門在土壤中降解頑固的有機(jī)物質(zhì)的相關(guān)代謝活動[24]，為酸桿菌門提供了生長機(jī)會。土壤中酸桿菌門與變形菌門的數(shù)量相當(dāng)，但由于其難以培養(yǎng)，目前對酸桿菌門在自然環(huán)境中的功能還存在爭議[25-27]。一些研究表明酸性土壤環(huán)境有利于酸桿菌門的代謝活動，因?yàn)樯锾孔陨沓蕢A性，施入土壤中不利于酸桿菌門細(xì)菌的生長[28-29]。但有一些酸桿菌門的基因序列在中性和堿性的環(huán)境中被檢測出來后[30]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)不同施用量或類型的生物炭還田后可以在一定程度上增加酸桿菌門的相對豐度[31-35]，尤其是在作物的根際土壤中，酸桿菌門表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)能力[36]，同時王光華等[24]研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門可能參與了土壤的單碳化合物的代謝過程。本研究中，生物炭(BC)和沼渣(BR)處理的綠彎菌門相對豐度分別比養(yǎng)分含量最低的化肥處理(CF)降低13.22%和24.86%，說明有機(jī)物料在腐解過程中向土壤釋放的養(yǎng)分會在一定程度上抑制綠彎菌門的活性。綠彎菌門也是一類難以培養(yǎng)的微生物，不產(chǎn)氧的光合作用(Anoxygenic photosynthesis)是綠彎菌門固定大氣中CO2的最主要方式，這種特殊的光合特性使綠彎菌門以CO2為碳源產(chǎn)生能量時，會在有機(jī)質(zhì)含量較低的土壤中具有競爭優(yōu)勢[37-39]。本研究中，PM和BR的土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門還包含厚壁菌門，且PM土壤中優(yōu)勢菌門相對豐度是以厚壁菌門為首，PM可顯著增加厚壁菌門的梭菌屬和土孢桿菌屬的相對豐度。已有研究發(fā)現(xiàn)豬盲腸中有眾多分解粗纖維的厚壁菌門細(xì)菌，尤其是健康仔豬腸道中梭菌屬和土孢桿菌屬的相對豐度更高，因此，厚壁菌門普遍存在于豬的鮮糞中[40-41]。鮮豬糞在施入農(nóng)田前還需要堆肥，厚壁菌門是此過程中驅(qū)動反硝化作用的關(guān)鍵微生物，能夠利用氮源促進(jìn)豬糞發(fā)酵和腐熟[42]，豬糞還田會增加土壤中梭菌屬和土孢桿菌屬等厚壁菌門細(xì)菌的相對豐度，為作物提供養(yǎng)分并培肥土壤[43]。

3.2 不同有機(jī)物料還田后土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

本研究連續(xù)8年有機(jī)物料還田在很大程度上改變了土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響了土壤細(xì)菌群落的形成過程。畜禽糞便自身的磷含量普遍偏高，豬糞還田后可為土壤提供豐富的有機(jī)磷[44]，并大幅提升土壤厚壁菌的相對豐度[45]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)根際土壤厚壁菌門的部分菌屬能夠?qū)㈦y溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為作物可吸收利用的形態(tài)，從而增加土壤中可溶性磷的含量[46]，說明土壤環(huán)境因子與特定的土壤菌群之間是相互作用的。本研究中，土壤有效磷是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主效環(huán)境因子，它與梭菌屬和土孢桿菌屬的相對豐度均呈顯著正相關(guān)，說明豬糞還田后通過提高土壤有效磷的含量，進(jìn)而調(diào)控并增加土壤厚壁菌門的梭菌屬和土孢桿菌屬的相對豐度。這與Yang等[47]的研究結(jié)論一致，高含氮量的豬糞還田后導(dǎo)致土壤中磷的積累多于其他養(yǎng)分，有效磷含量既是影響細(xì)菌群落變化的決定性因素，也是導(dǎo)致高含氮量的豬糞還田后細(xì)菌群落多樣性下降的重要因素。但是，Huang等[48]研究發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌和真菌對于有效磷含量的升高并不敏感，土壤碳循環(huán)及化學(xué)性質(zhì)(如pH)的改變可能是磷含量影響細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化的間接機(jī)制。目前關(guān)于有效磷含量對土壤微生物影響的研究偏少，本研究中土壤有效磷影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵機(jī)制也有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

放線菌門廣泛分布于土壤環(huán)境中，受各環(huán)境因子的影響較大，放線菌在中性偏堿的土壤中生長較好[49]，增加土壤水分有利于放線菌的生長，土壤有機(jī)質(zhì)與放線菌的相互促進(jìn)作用明顯[50]，但李金融等[51]發(fā)現(xiàn)放線菌門菌群與有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)但不顯著，上述差異可能與土壤環(huán)境條件有較大關(guān)系。本研究中，土壤pH與蓋勒氏菌屬的相對豐度呈顯著正相關(guān)、土壤有機(jī)質(zhì)與類諾卡氏菌屬的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。秸稈生物炭是含碳量豐富的多孔性物質(zhì)，在自然條件下通常呈堿性，還田后會提高土壤pH和有機(jī)質(zhì)的含量[52]，說明生物炭還田后提高土壤pH引起蓋勒氏菌屬豐度顯著升高，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量使得類諾卡氏菌屬豐度顯著降低。此外，土壤水分含量也與類諾卡氏菌屬的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，沼渣還田后改變了土壤水分含量，進(jìn)而也調(diào)控了類諾卡氏菌屬豐度。綜上，由于放線菌門在屬水平下的養(yǎng)分偏好，蓋勒氏菌屬和類諾卡氏菌屬難以培養(yǎng)、營養(yǎng)需求特殊，對土壤養(yǎng)分的調(diào)整機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.3 不同有機(jī)物料還田對土壤細(xì)菌群落功能的影響

本研究結(jié)果表明，各處理的COG功能組成相似，從整體上看，土壤細(xì)菌群落細(xì)胞中相對豐度最高的是脫氫酶/還原酶，它是糖類、有機(jī)酸和氨基酸等物質(zhì)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的重要催化劑，大多數(shù)土壤細(xì)菌通過此途徑獲得能量[53]。其次是組氨酸激酶，可與下游靶蛋白一起構(gòu)成細(xì)胞雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，對土壤細(xì)菌的趨化性和密度感應(yīng)等多種功能有重要作用[54]。然后是參與碳水化合物代謝的主要促進(jìn)劑、RNA聚合酶和NAD依賴性差向異構(gòu)酶等功能蛋白協(xié)同調(diào)控土壤細(xì)菌群落細(xì)胞的合成、分解及代謝等活動[53]。進(jìn)一步分析土壤細(xì)菌群落與相關(guān)代謝的關(guān)系，各處理菌群均以新陳代謝的相關(guān)通路為主，活躍的代謝活動保證了土壤細(xì)菌的存活。與對照組(ST和CF)相比，豬糞(PM)、沼渣(BR)和生物炭(BC)還田處理不同程度的上調(diào)了土壤細(xì)菌群落的新陳代謝(如嘧啶代謝、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代謝、肽聚糖生物合成等)，其中，PM對土壤細(xì)菌群落新陳代謝通路的影響較為顯著。有機(jī)物料還田后為土壤帶來了較為充足的碳水化合物、含氮有機(jī)物、維生素和糖類等物質(zhì)，為土壤細(xì)菌群落的生長提供了新的營養(yǎng)和能量，進(jìn)而顯著影響了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。但鑒于PICRUSt功能預(yù)測分析的局限性，目前只能初步預(yù)測出細(xì)菌群落的相關(guān)功能，后續(xù)還需要借助宏基因組測序技術(shù)進(jìn)一步解釋影響上述代謝功能的具體原因。

4 結(jié) 論

針對華北平原砂質(zhì)土壤連續(xù)8年有機(jī)物料還田后玉米成熟期根際土壤研究發(fā)現(xiàn)，沼渣和生物炭處理均顯著增加了土壤細(xì)菌群落多樣性，放線菌門和變形菌門是沼渣和生物炭處理的優(yōu)勢細(xì)菌；但豬糞處理顯著降低土壤細(xì)菌群落多樣性，厚壁菌門為其優(yōu)勢細(xì)菌。土壤有效磷、pH、速效鉀和有機(jī)質(zhì)是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要因素，其中土壤有效磷對細(xì)菌群落分布的影響最顯著，與厚壁菌門的梭菌屬和土孢桿菌屬的相對豐度均呈顯著正相關(guān)。此外，豬糞、沼渣和生物炭處理均比秸稈處理上調(diào)了土壤細(xì)菌群落新陳代謝通路中的嘧啶代謝、丙氨酸/天冬氨酸和谷氨酸代謝以及肽聚糖生物合成代謝通路的相對豐度。綜上，合理施用沼渣還田可作為改良華北平原砂質(zhì)瘠薄型農(nóng)田的首選方式。