劉思雨 張?jiān)卢?黃 江 崔月琦 劉 宇，2 周玉龍，2 朱戰(zhàn)波，2* 張澤財(cái)，2*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶，163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶，163319)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛胃腸道、呼吸道和生殖疾病的重要病原體，它所引起的疫病呈世界性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成了持續(xù)的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。BVDV可以引起宿主動(dòng)物的免疫抑制和持續(xù)性感染，從而促進(jìn)牛群中BVDV的循環(huán)。BVDV進(jìn)化出了多種策略來逃避宿主的先天性免疫[3-4]。

已有研究表明BVDV感染的BALB/c小鼠在第14天時(shí)仍可在體內(nèi)檢測(cè)到病毒[5]。同時(shí)，Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)，BVDV感染的BALB/c小鼠脾臟出現(xiàn)明顯的病理組織學(xué)變化，骨髓中巨核細(xì)胞數(shù)量也明顯增加。另外，2016年，Choi等[7]研究也證實(shí)BVDV感染的BALB/c小鼠在第9天時(shí)仍可以在脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中檢測(cè)到病毒抗原。近期研究也證實(shí)BVDV感染的BALB/c小鼠在第7天時(shí)出現(xiàn)明顯的病毒血癥[8]。此外，本研究團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，致細(xì)胞病變(CP)型和非致細(xì)胞病變(NCP)型BVDV感染的小鼠均呈現(xiàn)白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的減少，以及病毒血癥[9]，表明BALB/c小鼠可以作為感染模型用于BVDV致病機(jī)制的研究。

先天性免疫是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道防線，在抗感染免疫中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。研究證實(shí)，宿主先天性免疫受體可通過識(shí)別入侵的BVDV粒子，進(jìn)而啟動(dòng)一系列免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒效果。NLRP3炎癥小體是先天性免疫中重要模式識(shí)別受體，是由NLRP3受體、適配器ASC和Caspase-1組成的寡聚復(fù)合體。組裝后的NLRP3炎癥小體將會(huì)觸發(fā)pro-Caspase-1自切割為成熟的Caspase-1，隨后，介導(dǎo)IL-1β的分泌，對(duì)宿主抵御微生物至關(guān)重要[10]。越來越多的研究證實(shí)，NLRP3炎癥小體參與多種病毒的致病機(jī)制，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒，呼吸道合胞病毒和豬瘟病毒等[11-13]。然而BVDV體內(nèi)感染后NLRP3炎癥小體的活化規(guī)律，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究擬探究BVDV感染后誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活的規(guī)律，以及NLRP3炎癥小體激活與病毒復(fù)制的相關(guān)性，為BVDV拮抗宿主先天性免疫的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BVDV標(biāo)準(zhǔn)株NADL(CP型)由黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心保存。4～6周齡雌性的SPF級(jí)BALB/c小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)部。

1.2 主要試劑

兔源NLRP3單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔源Caspase-1和IL-1β單克隆抗體購自安諾倫生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量qRT-PCR試劑盒購自Takara公司。

1.3 動(dòng)物分組和處理

將BALB/c小鼠在隔離器中預(yù)飼喂適應(yīng)一周后，隨機(jī)分成8組，即1個(gè)對(duì)照組和7個(gè)攻毒組，每組各5只。攻毒組每只腹腔注射105TCID50的CP型BVDV，對(duì)照組注射等量的PBS，小鼠自由采食和飲水。在攻毒后的不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12、24、48、96、168和240 h)分別采集小鼠的十二指腸、脾臟和血液。所有試驗(yàn)均獲得黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)NLRP3、Caspase-1和IL-1β mRNA表達(dá)

無菌取攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的十二指腸進(jìn)行研磨，提取總核糖核苷酸(RNA)，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸(cDNA)，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；β-actin為內(nèi)參。引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Real-time PCR

反應(yīng)條件：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，水9.5 μL，上下游引物各1 μL，目的模板1 μL共25 μL體系在95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s條件下共40個(gè)循環(huán)。SteponePlus軟件測(cè)定其Ct值，將正常對(duì)照組設(shè)定為1，采用2-ΔΔCt法分析進(jìn)行mRNA表達(dá)水平，ΔΔCt=試驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-空白組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

1.5 Western Blot分析NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)

取攻毒后24 h和168 h(7天)小鼠十二指腸，加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白。取30 μg樣品進(jìn)行80 V恒壓電泳40 min，然后120 V恒壓電泳45 min，切下目的蛋白凝膠并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%的脫脂乳封閉2 h后分別加入一抗為兔源的NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)的單克隆抗體和兔源的Tubulin(1∶5 000)的單克隆抗體4 ℃過夜。加入1∶8 000稀釋的山羊抗兔的二抗后，37 ℃孵育1 h，使用ECL顯色劑對(duì)膜進(jìn)行顯色，于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光成像，得到灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)小鼠十二指腸、脾臟和血液的病毒載量

取攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的十二指腸、脾臟進(jìn)行研磨并將小鼠眼球采集抗凝血，提取總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以cDNA為模版，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。BVDV引物序列，上游為：5′-GAGTACAGGGTAGTCGTCAG-3′，下游為5′-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3′，擴(kuò)增長度130 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-2.909 4X-40.812計(jì)算出病毒載量。

1.7 十二指腸和脾臟病理組織學(xué)檢查

在病毒感染第7天時(shí)，無菌采取對(duì)照組和感染組的十二指腸和脾臟，將其在4%的多聚甲醛中固定一周后經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、蘇木素-伊紅染色、封片等步驟，制作組織切片并觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV感染小鼠體內(nèi)NLRP3、Caspase-1和IL-1β基因表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果表明，小鼠感染BVDV后十二指腸中NLRP3、Caspase-1和IL-1β的mRNA表達(dá)量從第12 h開始逐步升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰(P<0.05)；在感染第48 h和96 h(4 d)時(shí)，其基因表達(dá)與對(duì)照組相比并無明顯的變化(P>0.05)；但在感染第168 h(7 d)時(shí)，其表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，感染第240 h(10 d)時(shí)略有升高但仍低于對(duì)照組(圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)BVDV感染早期小鼠十二指腸NLRP3(a)、Caspase-1(b)和IL-1β(c)的mRNA表達(dá)水平Fig.1 Relative mRNA levels of NLRP3 (a), Caspase-1 (b) and IL-1β (c) by qRT-PCR in the early stage of BVDV infection

2.2 BVDV感染小鼠體內(nèi)NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)情況

由圖2可知，Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腹腔注射BVDV的小鼠在24 h時(shí)，小鼠十二指腸中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。由圖3可知,其變化趨勢(shì)與mRNA表達(dá)水平的結(jié)果相一致；當(dāng)BVDV感染第168 h(7 d)時(shí)，小鼠十二指腸中的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。此變化趨勢(shì)與mRNA表達(dá)水平的結(jié)果相一致。上述結(jié)果表明BVDV感染早期，小鼠體內(nèi)的NLRP3-(Caspase-1)/IL-1β信號(hào)通路被激活，感染第168 h(7 d)時(shí)，NLRP3炎癥小體活化被抑制。

1和2分別代表各組中2個(gè)不同小鼠的十二指腸樣本。1 and 2 represent duodenal samples from 2 different mice in each group.

1和2分別代表各組中2個(gè)不同小鼠的十二指腸樣本。1 and 2 represent duodenal samples from 2 different mice in each group.

2.3 小鼠體內(nèi)病毒含量的檢測(cè)

qRT-PCR結(jié)果表明，BVDV感染早期的小鼠十二指腸和脾臟中病毒載量逐漸升高。在感染的168 h(7 d)十二指腸、脾臟和血液中病毒載量均達(dá)到高峰(圖4)。

圖4 小鼠十二指腸(a)、脾臟(b)和血液(c)病毒載量Fig.4 Viral load in the duodena (a), spleen (b) and blood (c) of all infected mice

2.4 小鼠十二指腸、脾臟病理組織學(xué)變化

與空白對(duì)照組小鼠相比較，BVDV感染后第7天小鼠十二指腸呈現(xiàn)為腸腺上皮大量壞死，基層變厚并且有較多的炎性細(xì)胞浸潤；脾臟可見淋巴細(xì)胞變性、壞死，間質(zhì)疏松和水腫(圖5)。

(a)小鼠十二指腸對(duì)照組與感染組；(b)小鼠脾臟對(duì)照組與感染組

3 討 論

NLRP3炎癥小體是目前研究最多的NLR家族成員[14]，炎癥小體的活化包含2個(gè)步驟：首先，宿主細(xì)胞對(duì)微生物的模式識(shí)別誘導(dǎo)了pro-IL-1β和NLRP3的轉(zhuǎn)錄[15]；其次，危險(xiǎn)信號(hào)激活炎癥小體，導(dǎo)致Caspase-1的活化，并將細(xì)胞因子前體切割為成熟的具有生物活性的IL-1β和IL-18，以及觸發(fā)細(xì)胞焦亡[16-17]。IL-1β作為炎癥反應(yīng)上游的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)并起到清除病原體的作用[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，小鼠感染BVDV早期NLRP3、Caspase-1和IL-1β水平隨時(shí)間推移逐步升高，在感染后24 h的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，表明BVDV感染早期可以導(dǎo)致小鼠體內(nèi)NLRP3炎性小體激活。

NLRP3炎癥小體在許多抗病毒免疫中被激活，然而，研究表明NLRP3炎癥小體的活化在不同病毒致病機(jī)制中發(fā)揮的作用可能存在差異。Cui等[20]研究證實(shí)，ZIKV感染可以通過介導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活促進(jìn)cGAS的降解，進(jìn)而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，導(dǎo)致ZIKV逃避宿主抗病毒反應(yīng)。另外，有研究表明，丙型肝炎病毒具有抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化的作用[21]。近期研究也證實(shí)，甲型流感病毒感染小鼠1周時(shí)，NLRP3和Caspase-1的表達(dá)比感染早期進(jìn)一步升高，IL-1β的轉(zhuǎn)錄和分泌也進(jìn)一步增強(qiáng)，促進(jìn)了甲型流感病毒感染[22-23]。本研究中，與許多前期研究結(jié)果相似的是，在BVDV感染早期，NLRP3炎癥小體被激活，然而在BVDV感染小鼠的第7天，發(fā)現(xiàn)NLRP3、Caspase-1和IL-1β基因和蛋白的表達(dá)量均明顯降低。

進(jìn)一步對(duì)小鼠血液、脾臟和十二指腸中病毒載量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染早期的小鼠十二指腸和脾臟中病毒載量逐漸升高，血液中病毒載量逐漸下降。然而，在BVDV感染的第7天病毒載量均達(dá)到高峰，這與實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的BVDV感染小鼠模型結(jié)果相一致[9]。通過病理組織學(xué)檢查證明BVDV感染后引起了病理損傷，感染模型成立。NLRP3炎癥小體活化及病毒載量變化規(guī)律表明NLRP3炎癥小體在病毒感染早期被激活后，在一定程度上抑制了病毒的復(fù)制，但對(duì)病毒感染后期抑制效果不明顯。值得注意的是，小鼠十二指腸、脾臟和血液的病毒載量在感染第7天最高，第10天的病毒載量開始下降，可能是特異性免疫應(yīng)答被激活，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，在小鼠體內(nèi)，BVDV感染早期的NLRP3炎性小體被激活，然而隨著宿主體內(nèi)病毒載量增加，可能對(duì)其激活具有一定的抑制作用。本研究初步揭示了BVDV感染與NLRP3炎癥小體活化的相關(guān)性，為BVDV拮抗宿主先天性免疫的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。然而，BVDV感染本體動(dòng)物后NLRP3炎癥小體激活及其抗病毒機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。