何炎峻，金圣子，王 爽，柳可欣，劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

犬腫瘤疾病在臨床上越來(lái)越常見(jiàn)，目前犬腫瘤疾病主要采用外科手術(shù)治療，結(jié)合化療藥物治療可明顯提高寵物存活率[1-2]。順鉑(cisplatin，CP)作為一種廣普抗腫瘤化療藥物，可用于治療多種癌癥?；熕幬餆o(wú)論在動(dòng)物或者人身上，對(duì)惡性腫瘤都有明顯的抑制作用[3]。CP在治療犬乳腺腫瘤上有良好的效果，可以誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。但是CP具有嚴(yán)重的毒副作用，無(wú)論在人或動(dòng)物的治療上都會(huì)引起嚴(yán)重的腎損傷，嚴(yán)重降低治療對(duì)象的生活質(zhì)量，限制了CP的臨床應(yīng)用[5]。CP主要由腎臟代謝，通過(guò)腎小球過(guò)濾或腎小管分泌，因此，CP容易在腎臟中蓄積而造成腎損傷[6]。當(dāng)發(fā)生腎損傷時(shí)，通過(guò)病理切片檢查可發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞壞死和空泡變性等腎損傷標(biāo)志現(xiàn)象[7]。研究表明，CP能夠誘導(dǎo)腎臟氧化應(yīng)激，降低總抗氧化能力(T-AOC)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，促使腎臟中丙二醛(MDA)含量增加，破壞腎小管上皮細(xì)胞，加重腎臟損傷[8]；CP可導(dǎo)致腎臟中瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子κB p65(NFκB p65)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子增多，誘導(dǎo)炎癥損傷破壞腎小管結(jié)構(gòu)，加重腎損傷[9]；CP還可誘導(dǎo)腎臟發(fā)生程序性壞死，從而在導(dǎo)致組織損傷同時(shí)誘導(dǎo)炎癥，導(dǎo)致腎小管結(jié)構(gòu)破壞，程序性壞死標(biāo)志物受體相互作用蛋白激酶-1(RIPK1)和RIPK3在組織中的表達(dá)增加[10]。CP作為一線抗腫瘤藥物，抗癌效果明顯，但其副作用對(duì)腎臟造成了嚴(yán)重?fù)p害。因此，亟需尋找一種合適的藥物來(lái)緩解CP對(duì)腎臟造成的損傷。

薯蕷皂苷元(diosgenin，Dio)是一種天然合成的淄體皂苷元，比較容易在山藥中提取到，具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎的作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Dio可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激緩解脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的腎損傷[12]；Dio不但可以減輕果糖誘導(dǎo)的腎臟病理組織改變，而且還可以通過(guò)緩解腎臟炎癥反應(yīng)緩解其誘導(dǎo)的大鼠腎損傷[13-14]。此外，Dio還可以緩解大鼠心肌炎癥[15]。CP作為一種抗腫瘤化療藥物，找到能緩解CP誘導(dǎo)腎損傷的藥物對(duì)臨床具有重要的意義。因此，本試驗(yàn)通過(guò)研究Dio干預(yù)對(duì)CP誘導(dǎo)的腎臟的病理變化、抗氧化能力、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞程序性壞死等的影響，以期為將Dio用于緩解CP誘導(dǎo)的腎損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

薯蕷皂苷元(Dio，純度≥98%)(成都德賽特生物科技有限公司)；CP(Sigma-Aldrich公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(中國(guó)上海金品化工科技有限公司)；T-AOC、MDA和CAT檢測(cè)試劑盒(南京建城生物工程研究所)；BCA檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；兔抗鼠TNF-α、IL-β、NFκB p65、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、IL-10、GAPDH抗體(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)。

倒置熒光顯微鏡(Echo公司)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Imager600，GE公司)；紫外分光光度計(jì)(Cary8454 UV-Vis，安捷倫科技有限公司)；熒光定量PCR儀(LightCycler96,Roche公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理

選取SPF級(jí)雄性Wistar大鼠24只(遼寧長(zhǎng)生生物有限公司)，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，濕度50%～60%，室內(nèi)光照12 h/12 h晝夜交替，自由采食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。將24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為對(duì)照組(C)、Dio組(Dio)、模型組(CP)和Dio+CP組(Dio+CP)。C和CP組每天灌胃6 mL 0.5% CMC-Na，Dio和Dio+CP組每天灌胃Dio(60 mg/kg)[13]，連續(xù)灌胃10 d。于試驗(yàn)第7天，CP和Dio+CP組尾靜脈單次注射CP(6 mg/kg)[16-17]，C和Dio組尾靜脈單次注射2 mL生理鹽水。CP給藥72 h后處死大鼠，無(wú)菌分離腎臟組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分用液氮速凍后于―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

取0.3 g腎臟組織樣本勻漿，用生理鹽水按照1∶9的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)? 500 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定T-AOC和CAT的活性及MDA的含量。

1.4 組織病理學(xué)檢查

將固定于4%多聚甲醛中的腎臟修剪為0.5 cm，于包埋盒中流水沖洗過(guò)夜，將組織放入70%酒精2 h、80%酒精15 min、90%酒精10 min、95%酒精8 min、無(wú)水乙醇2 min進(jìn)行梯度脫水，置二甲苯中6 min透明、浸蠟2.5 h，包埋后切成5 μm厚度的切片，在37 ℃水中展片，置于載玻片上，將載玻片放入二甲苯7 min、無(wú)水乙醇4 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精3 min、蒸餾水3 min進(jìn)行脫蠟，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎性因子mRNA表達(dá)

取0.1 g腎臟組織，采用總RNA提取試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中大鼠TNF-α、NFκBp65、IL-10、COX-2和IL-1β基因的序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系12 μL：上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL，2×TaqMasterMix 6.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

表1 引物信息

續(xù)表

1.6 Western blotting檢測(cè)炎癥因子蛋白的表達(dá)

將0.5 g各組腎臟組織加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分裂解勻漿。將勻漿4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗3次，分別加入兔抗鼠TNF-α(1∶500)、IL-β(1∶500)、NFκB p65(1∶500)、COX-2(1∶500)、IL-10(1∶500)、GAPDH(1∶500)一抗，室溫孵育12 h。然后用山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫下孵育1 h，TBST 洗滌后置ECL發(fā)光液中顯色，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察并拍照，最后用ImageJ Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 免疫組化檢測(cè)RIPK1和RIPK3蛋白的表達(dá)

取各組大鼠腎臟組織，石蠟包埋后切片(5 μm)。石蠟切片脫蠟封閉后，分別加入兔抗鼠RIPK1(1∶200)和RIPK3(1∶200)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；清洗后滴加山羊抗兔二抗(1∶150)，37 ℃靜置30 min；洗滌后滴加DAB顯色液避光顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法進(jìn)行組間差異比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Dio對(duì)CP所致大鼠腎損傷的影響

由圖1可知，對(duì)照組和Dio組腎臟結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常；CP組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、壞死和脫落，并且腎小管發(fā)生大面積空泡變性；Dio+CP組腎小管損傷明顯減輕。說(shuō)明腎損傷模型構(gòu)建成功。

黑色箭頭指示腎小管病變

2.2 Dio對(duì)CP誘導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，Dio組大鼠腎臟中MDA含量、T-AOC和CAT活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)，CP和Dio+CP組腎臟中MDA含量均極顯著升高(P<0.01)，T-AOC和CAT活性均極顯著降低(P<0.01)；與CP組相比，Dio+CP組腎臟中T-AOC和CAT活性均極顯著增加(P<0.01)，MDA含量極顯著降低(P<0.01)。

表2 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 Dio對(duì)CP誘導(dǎo)的大鼠腎臟炎癥反應(yīng)的影響

2.3.1 Dio對(duì)CP誘導(dǎo)的大鼠腎臟炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響 由表3可知，與對(duì)照組相比，Dio組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65、IL-1β和IL-10 mRNA的表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，CP組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β mRNA的表達(dá)量均極顯著升高、IL-10 mRNA的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，Dio+CP組大鼠腎臟中IL-1β mRNA的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)、IL-10 mRNA的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與CP組相比，Dio+CP組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β mRNA的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

表3 各組大鼠腎臟中炎癥相關(guān)因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.3.2 Dio對(duì)CP誘導(dǎo)的大鼠腎臟炎癥相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響 由表4可知，與對(duì)照組相比，Dio組大鼠腎臟中IL-1β、TNF-α、NFκB p65、IL-10和COX-2蛋白的表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，CP組大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表達(dá)量極顯著升高、IL-10蛋白的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，Dio+CP組TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)量分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)升高；與CP組相比，Dio+CP組大鼠腎臟中COX-2和NFκB p65蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，IL-10蛋白的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

表4 各組大鼠腎臟中炎癥相關(guān)因子蛋白的相對(duì)表達(dá)量

2.4 Dio對(duì)CP誘導(dǎo)的大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，RIPK1和RIPK3陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒，對(duì)照組中RIPK1和RIPK3少量表達(dá)。由表5可知，與對(duì)照組相比，Dio組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白的表達(dá)水平均無(wú)顯著差異(P>0.05)；CP和Dio+CP組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3的蛋白表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)；與CP組相比，Dio+CP組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白的表達(dá)分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)降低。

黑色箭頭指示陽(yáng)性標(biāo)志物

表5 各組大鼠腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

3 討 論

CP是一種常見(jiàn)的化療藥物，其抗癌廣、療效確切、無(wú)交叉耐藥性，廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤治療[3]，但具有較大的副作用，無(wú)論在人或者動(dòng)物上，CP治療后均會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腎損傷[18]，亟需藥物來(lái)緩解CP誘導(dǎo)的腎損傷，以促進(jìn)CP在醫(yī)療上的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，CP誘導(dǎo)腎損傷時(shí)，直接的病理表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞脫落和壞死[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CP處理后大鼠腎小管出現(xiàn)大面積上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，表明CP破壞了腎臟結(jié)構(gòu)，造成了腎損傷。王延輝等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Dio可以促進(jìn)腎小管受損細(xì)胞修復(fù)，增強(qiáng)腎臟功能，加快代謝，與本研究的結(jié)果相似。表明Dio干預(yù)顯著減輕了CP誘導(dǎo)的腎損傷。

研究表明，CP會(huì)誘導(dǎo)或加劇腎臟的氧化應(yīng)激損傷，造成明顯腎功能紊亂、加重腎損傷[21]；CP可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS增加，當(dāng)ROS在細(xì)胞內(nèi)的蓄積量超出機(jī)體的清除能力時(shí)便會(huì)造成氧化應(yīng)激損傷[19]；CP還會(huì)降低內(nèi)源性抗氧化酶的活性，使機(jī)體總抗氧化能力降低、抗氧化與氧化作用失衡[13]。MDA是過(guò)氧化產(chǎn)物，可通過(guò)腎臟中MDA含量判斷氧化損傷程度[22]。衡量機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)有T-AOC和CAT活性，而Dio可以通過(guò)提高機(jī)體抗氧化酶活性而提高機(jī)體抗氧化能力[23-25]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CP可顯著降低腎臟中T-AOC和CAT活性，而Dio干預(yù)則顯著緩解了腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)。曹亞軍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷能顯著降低衰老小鼠血清、肝臟和腦組織中MDA含量，提高機(jī)體抗氧化能力。Dio可以通過(guò)提高CAT活性和降低MDA含量緩解痛性糖尿病周?chē)窠?jīng)病變坐骨神經(jīng)中氧化應(yīng)激損傷[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，Dio干預(yù)顯著降低了腎臟中MDA含量，提高了腎臟中T-AOC和CAT活性。以上結(jié)果均表明Dio可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激緩解腎損傷。

給予CP會(huì)在腎臟近端小管大量聚集，引發(fā)腎臟炎癥反應(yīng)從而加重腎損傷[26]。一般認(rèn)為IL-1β、TNF-α、COX-2和NFκB p65是腎臟中重要的促炎因子，而IL-10作為抑炎因子可以抑制炎癥[27-28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CP引發(fā)腎損傷時(shí)，大鼠腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表達(dá)顯著升高，而IL-10蛋白的表達(dá)則顯著降低。褚春民等[29]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、NFκB p65和COX-2在炎癥組織中蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常組織，Dio可以顯著降低TNF-α、NFκB p65和COX-2的表達(dá)水平，減輕炎癥。Qiao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Dio可通過(guò)降低腎臟中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β等炎癥因子蛋白的表達(dá)水平緩解果糖誘導(dǎo)的腎損傷。也有研究表明，Dio可以提高機(jī)體IL-10抗炎因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用[30]。本研究結(jié)果與以上結(jié)果一致，Dio干預(yù)顯著降低了腎臟組織中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表達(dá)量，升高了IL-10蛋白的表達(dá)量，表明Dio能顯著緩解CP誘導(dǎo)的腎臟炎癥。程序性壞死是由基因調(diào)控的一種死亡方式，其信號(hào)調(diào)控十分復(fù)雜，目前認(rèn)為RIPK1和RIPK3參與調(diào)控程序性壞死的重要過(guò)程，是程序性壞死的陽(yáng)性標(biāo)志物[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，RIPK1和RIPK3是程序性壞死中的重要調(diào)節(jié)物，當(dāng)腎臟發(fā)生程序性壞死時(shí)，RIPK1和RIPK3蛋白在腎組織中表達(dá)升高[33]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CP處理后大鼠腎組織RIPK1和RIPK3蛋白的表達(dá)量顯著升高，表明在CP誘導(dǎo)腎損傷的過(guò)程中程序性壞死被激活。研究表明，細(xì)胞發(fā)生程序性壞死后，細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致內(nèi)容物釋放，內(nèi)容物作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(DAMPs)引發(fā)周?chē)M織發(fā)生免疫和炎癥反應(yīng)[34]。在腎臟中高濃度CP可激活程序性壞死，引發(fā)腎臟炎癥反應(yīng)[9,35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CP可以通過(guò)激活程序性壞死增加TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β炎癥細(xì)胞因子的分泌，加重腎臟炎癥反應(yīng)。研究表明，抑制RIPK1和RIPK3的表達(dá)可以減輕程序性壞死[36]。也有研究表明，RIPK3基因缺陷的小鼠不能發(fā)生程序性壞死[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，Dio干預(yù)顯著降低了腎臟中RIPK1和RIPK3蛋白的表達(dá)，抑制了促炎因子TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β的表達(dá)。說(shuō)明Dio緩解CP誘導(dǎo)的腎損傷機(jī)制與其抑制程序性壞死的激活和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，Dio干預(yù)可顯著降低腎臟中MDA含量，降低TNF-α、COX-2、IL-1β等炎癥相關(guān)蛋白及RIPK1、RIPK3蛋白的表達(dá)。說(shuō)明Dio干預(yù)可緩解CP誘導(dǎo)的腎損傷，其作用可能與抑制腎臟氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞程序性壞死密切相關(guān)。