唐慶鳳，李 玲，黃加祥，方文遠(yuǎn)，農(nóng)皓如，唐 艷，陸呈委，韋盤秋，馮 玲

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001；2.廣西壯族自治區(qū)水牛乳質(zhì)量與安全控制技術(shù)工程研究中心，南寧 530001；3.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

近年來國內(nèi)外牛奶質(zhì)量安全問題頻發(fā)，牛奶中霉菌毒素的污染嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的健康[1-3]。霉菌毒素是由曲霉、鐮刀菌和青霉等絲狀真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，在牛奶、奶制品、谷類飼料等農(nóng)畜產(chǎn)品中廣泛存在[4]。霉菌毒素對動物及人體具有致癌性、腎臟毒性、肝臟毒性、雌激素樣作用、遺傳毒性、免疫抑制、生殖障礙及刺激皮膚等效應(yīng)[5]。中國谷物霉菌毒素污染現(xiàn)象較為嚴(yán)重，污染率達(dá)90%以上[6-7]。奶牛采食霉菌毒素污染的飼料后，在牛奶中可檢測到相應(yīng)霉菌毒素和代謝產(chǎn)物[8]。鄭楠等[9]報道，霉菌毒素在牛奶中常見的種類為飼料中原毒素及其經(jīng)過牛體的代謝產(chǎn)物，將牛奶中常見的霉菌毒素按照風(fēng)險指標(biāo)重要程度依次排序為黃曲霉毒素M1(AFM1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZEL)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和伏馬菌素(FB)。國內(nèi)外學(xué)者均報道了水牛奶也存在霉菌毒素污染問題[10-12]。因此，研究廣西地區(qū)水牛奶的霉菌毒素污染狀況，保障廣西地區(qū)安全生產(chǎn)水牛奶，對廣西地區(qū)乃至全國的水牛奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。

以往研究主要針對水牛奶中AFM1的污染情況進(jìn)行調(diào)查[12]，而少有同時檢測水牛奶中AFM1及HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON、OTA的報道。雖然近年來規(guī)?；B(yǎng)殖是乳用水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向，但廣西區(qū)乳用水牛養(yǎng)殖仍以散養(yǎng)為主，且養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)飼養(yǎng)模式也占有一定的比例。在以往的研究中，很少有學(xué)者探究規(guī)模化養(yǎng)殖、養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)、農(nóng)戶散養(yǎng)這3種飼養(yǎng)模式水牛奶中霉菌毒物污染的水平。另外，廣西位于中國華南地區(qū)，位于北緯20°54′―26°24′、東經(jīng)104°28′―112°04′之間，南臨熱帶海洋，北接南嶺山地，西延云貴高原，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)[13]，由于受季風(fēng)影響，廣西降水量季節(jié)分配不均，干濕季分明，在春季的3―4月時降雨頻繁，易出現(xiàn)回南天，回南天出現(xiàn)時，空氣濕度接近飽和，飼料原料易產(chǎn)生霉菌毒素，從而易引起水牛奶霉菌毒素污染。秋季(9―11月)是干季，干燥少雨，如2020年秋季總降水量僅占全年降水量的18.36%[14]，飼料原料不易產(chǎn)生霉菌毒素，從而有利于降低水牛奶中霉菌毒素污染風(fēng)險。因此，本研究在2020年10―11月(秋季，干燥氣候)和2021年4月(春季，回南天)以廣西地區(qū)乳用水牛規(guī)模化養(yǎng)殖場(存欄50頭以上)、養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)、乳用水牛養(yǎng)殖戶(散養(yǎng))的秋季和春季原料水牛奶樣品為研究對象，檢測水牛奶霉菌毒素的污染水平，追蹤水牛奶中霉菌毒素污染的季節(jié)變化，了解不同飼養(yǎng)模式及季節(jié)對水牛奶質(zhì)量安全的影響，從而為水牛奶安全生產(chǎn)與消費(fèi)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在2020年10―11月和2021年4月，選取廣西地區(qū)乳用水牛主產(chǎn)區(qū)南寧市、欽北防、玉林等地采集水牛奶樣品。其中，每季規(guī)?；?存欄50頭以上)、養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)各飼養(yǎng)模式隨機(jī)采集原料水牛奶樣品8個，每季24個樣品，共計48個樣品，每個樣品取450 mL，樣品采集分布情況見表1。奶樣采集有奶罐和奶桶2種方式：奶罐采樣：采樣前將奶罐中的生鮮乳緩慢攪動后分別從奶罐的上、中和下部1/3處分別取生鮮乳樣品150 mL，混合成450 mL奶樣[15]；奶桶采樣：將奶搖勻，隨機(jī)取樣450 mL。奶樣采集分裝后，立即放入干冰中，然后轉(zhuǎn)移至―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品分布情況

1.2 主要試劑及儀器

AFM1試劑盒購自北京美正生物科技有限公司；HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON和OTA試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司。主要儀器有：酶標(biāo)儀(Bio-Rad iMark 12708，伯樂公司)；生化培養(yǎng)箱(SHP-150，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；FOSS多功能乳品分析儀(FT-120，福斯公司)。

1.3 霉菌毒素測定

按照ELISA試劑盒說明書檢測水牛奶中AFM1、HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON和OTA的含量。

1.4 牛奶中霉菌毒素限量

AFM1已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類致癌物質(zhì)，OTA被列為Ⅱ類致癌物質(zhì)[16]，但全球目前僅對牛奶中AFM1制定了限量標(biāo)準(zhǔn)，少部分國家對OTA進(jìn)行了限量，對于其他霉菌毒素只制定了每日最大容許攝入量(provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI)等相關(guān)制度，具體情況見表2。

表2 水牛奶中霉菌毒素限量

續(xù)表

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 廣西地區(qū)不同飼養(yǎng)模式下水牛奶霉菌毒素的污染狀況

2.1.1 水牛奶中AFM1的污染狀況 由表3可知，各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中AFM1含量均無顯著差異(P>0.05)。在48個樣品中有16個檢出AFM1，檢出率為33.33%。其中，養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)模式檢出率最高，為43.75%；散養(yǎng)模式最低，為18.75%。全部樣品的AFM1含量均低于中國限量標(biāo)準(zhǔn)0.5 μg/kg，但散養(yǎng)和規(guī)?；Ｊ礁饔?個樣品，共計2個樣品(4.17%)超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 μg/kg，散養(yǎng)模式樣品的平均含量高于其他2個飼養(yǎng)模式。

表3 不同飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中AFM1含量

2.1.2 水牛奶中其他霉菌毒素的污染狀況 由表4可知，各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于JECFA設(shè)定值，OTA的成人PTWI值也均低于JECFA設(shè)定值，且OTA的含量均低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)(<2 ng/mL)。與養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)模式相比，散養(yǎng)和規(guī)?；Ｊ缴a(chǎn)的原料水牛奶樣HT-2含量均顯著低于養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)模式(P<0.05)。與散養(yǎng)模式相比，規(guī)?；Ｊ缴a(chǎn)的原料水牛奶樣T-2含量顯著降低(P<0.05)。各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中α-ZEL、ZEN、DON和OTA含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 不同養(yǎng)殖模式生產(chǎn)的原料水牛奶中其他霉菌毒素含量

2.2 廣西地區(qū)不同飼養(yǎng)模式下不同季節(jié)水牛奶中霉菌毒素的污染狀況

2.2.1 水牛奶中AFM1的污染狀況 由表5可知，春季和秋季各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中AFM1含量均低于中國限量標(biāo)準(zhǔn)0.5 μg/kg，但秋季散養(yǎng)和規(guī)?；B(yǎng)殖各有1個奶樣AFM1含量超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)(0.05 μg/kg)，且秋季AFM1平均含量高于春季。春季樣品中AFM1的檢出率高于秋季，春季和秋季樣品中AFM1的檢出率分別為37.50%和29.17%。在3種飼養(yǎng)模式中，春秋兩季散養(yǎng)樣品中AFM1檢出率均最低，春季樣品中養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)檢出率最高為62.50%，秋季樣品中規(guī)?；B(yǎng)殖場檢出率最高為37.50%。

表5 原料水牛奶中AFM1含量

2.2.2 水牛奶中OTA的污染狀況 由表6可知，春季和秋季各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中OTA的含量均低于歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)2 ng/mL，OTA的成人PTWI均低于JECFA設(shè)定值100 ng/kg BW。秋季各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中OTA的平均含量均高于春季。

表6 原料水牛奶中OTA含量

2.2.3 水牛奶中HT-2和T-2的污染狀況 由表7和8可知，春季和秋季各模式生產(chǎn)的原料水牛奶中HT-2和T-2的成人PMTDI均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于JECFA設(shè)定值60 ng/kg BW。春季和秋季養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)生產(chǎn)的原料水牛奶中HT-2含量均顯著高于散養(yǎng)和規(guī)?；曫B(yǎng)模式(P<0.05)。

表7 原料水牛奶中HT-2含量

表8 原料水牛奶中T-2毒素含量

2.2.4 水牛奶中ZEN和α-ZEL的污染狀況 由表9和10可知，春季和秋季各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中ZEN和α-ZEL秋季的成人PMTDI均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于JECFA設(shè)定值500 ng/kg BW。春季和秋季散養(yǎng)模式生產(chǎn)的水牛奶中ZEN和α-ZEL含量均最低。春季和秋季養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)生產(chǎn)的水牛奶中α-ZEL含量均最高。

表9 原料水牛奶中ZEN含量

表10 原料水牛奶中α-ZEL含量

2.2.5 水牛奶中DON的污染狀況 由表11可知，春季和秋季各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中DON的成人PMTDI均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于JECFA設(shè)定值1 000 ng/kg BW。秋季各養(yǎng)殖模式生產(chǎn)的原料水牛奶中DON的平均含量均高于春季。

表11 原料水牛奶中DON含量

3 討 論

3.1 不同飼養(yǎng)模式下水牛奶中霉菌毒素的污染狀況分析

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)由寄生曲霉、黃曲霉和少量特異曲霉等真菌經(jīng)聚酮而產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[23]。目前，已發(fā)現(xiàn)有20多種AFs及相關(guān)衍生物[24]，其中，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)毒性最強(qiáng)，在飼料收割或儲存不當(dāng)時易產(chǎn)生AFB1從而污染飼料，當(dāng)奶牛攝入被AFB1污染的飼料后分泌的牛奶中會出現(xiàn)AFB1的羥基化代謝產(chǎn)物AFM1[25-26]。牛奶經(jīng)巴氏殺菌后，AFM1幾乎不被破壞，且AFM1具有強(qiáng)致癌性，嚴(yán)重影響人類健康，因此，許多國家和組織都調(diào)查了牛奶中AFM1的污染水平，且對乳及乳制品中AFM1設(shè)定了較為嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[17-18,27-28]。謝文沛[29]在甘肅省7個市的奶牛規(guī)模化和散養(yǎng)共采集252個原料水牛奶樣品，126個(50%)檢測出AFM1，所有檢出樣品AFM1含量均低于中國的國家限量標(biāo)準(zhǔn)，其中3個(1.19%)樣品超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)模場生產(chǎn)的牛奶中AFM1的平均含量和檢出率均低于散戶。本試驗結(jié)果表明，規(guī)模化和養(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)養(yǎng)殖生產(chǎn)的水牛奶中AFM1的平均含量低于散養(yǎng)，但水牛奶中AFM1的檢出率卻高于散養(yǎng)，可能由于散養(yǎng)飼喂的精料以品牌精料為主，飼料原料的霉菌毒素污染率低，且散養(yǎng)精粗飼料配比不固定，為降低飼養(yǎng)成本，會更多選擇新鮮粗飼料。另外，規(guī)?；宛B(yǎng)殖合作社或養(yǎng)殖小區(qū)養(yǎng)殖飼喂青貯飼料較散養(yǎng)多，而青貯飼料是最容易受真菌感染的飼料品種之一[30]。國內(nèi)對原料水牛奶中AFM1的污染水平研究較少，Guo等[31]2016―2017年從廣西、貴州、云南和廣東省的奶水牛養(yǎng)殖場采集136個原料水牛奶樣品，其中85個(62.5%)原料水牛奶樣品中檢測到AFM1，含量在4～243 ng/kg之間，均未超過中國限量標(biāo)準(zhǔn)，但8個(5.9%)樣品超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)，其中，廣西樣45個樣品AFM1檢出率為66.7%，超歐盟標(biāo)準(zhǔn)的有4個(8.89%)。本試驗結(jié)果顯示，全部水牛奶樣品的AFM1含量均低于中國限量標(biāo)準(zhǔn)0.5 μg/kg，但樣品AFM1檢出率(33.33%)和超歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)率(4.17%)均低于Guo等[31]的研究結(jié)果，可能由于近幾年廣西奶水牛養(yǎng)殖管理技術(shù)不斷提升，更注意飼料霉菌毒素污染控制。國外許多國家開展了水牛奶中AFM1污染水平研究，意大利南部、埃及伊斯梅利亞、土耳其、伊朗阿瓦茲和印度的水牛奶中AFM1的檢出率分別為7.2%[30]、52.0%[32]、27.0%[11]、38.7%[33]和50.0%[34]。Hussain等[35]采集了巴基斯坦旁遮普省55個水牛奶樣品，其中19個(34.5%)樣品檢出AFM1，15.8%樣品中AFM1含量高于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。本研究的原料水牛奶AFM1檢出率高于意大利及土耳其，與Hussain等[35]研究結(jié)果相似。

目前，牛奶中霉菌毒素的研究主要集中在AFM1，然而，牛奶中還存在HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN、DON、OTA等霉菌毒素，它們對動物及人類健康也會產(chǎn)生不同程度的影響。Huang等[36]開展牛奶中霉菌毒素檢測研究，發(fā)現(xiàn)牛奶中存在AFM1、OTA、ZEA和α-ZEL，其中，含2、3和4種霉菌毒素所占的比例分別為15.0%、45.0%和22.0%。Frey等[37]采集巴西68份液態(tài)奶樣本檢測其中黃曲霉毒素，結(jié)果表明AFM1、OTA、伏馬毒素B1(FB1)、FB2、α-ZEL和β-ZEL的檢出率分別為8.8%、25.0%、14.7%、4.4%、57.4%和41.2%，21個(30.9%)樣本中含有2～4種霉菌毒素，AFM1未超過巴西的限量標(biāo)準(zhǔn)(500 ng/L)，其他霉菌毒素的每日攝入量(PDI)均未高于推薦值。本試驗研究結(jié)果也表明，各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于JECFA設(shè)定值。因此，廣西地區(qū)水牛奶是安全的，不會對消費(fèi)者健康產(chǎn)生顯著影響。水牛奶中多種霉菌毒素共存現(xiàn)象可能與本研究采用的檢測方法的檢出限較低有關(guān)，還與中國飼料中存在多種霉菌毒素共污染嚴(yán)重有關(guān)[38]。

3.2 不同季節(jié)水牛奶中霉菌毒素的污染狀況分析

不同季節(jié)奶牛飼喂的飼料種類及飼糧配制不同均容易引起牛奶中霉菌毒素的含量出現(xiàn)顯著季節(jié)動態(tài)變化[39]。Roma等[30]開展意大利南部水牛奶和牛奶中AFM1污染水平及季節(jié)變化調(diào)查結(jié)果表明，水牛奶及牛奶中AFM1污染的發(fā)生率在秋季明顯高于溫暖季節(jié)(主要是春季)。Miocino-vic等[40]對塞爾維亞牛奶進(jìn)行了為期3年(2013-2015年)的檢測結(jié)果表明，秋季奶樣中AFM1含量平均值在四季中最高。Marnissi等[41]采集摩洛哥4個行政管理區(qū)域傳統(tǒng)奶牛場的四季牛奶樣品48個，13個(27.08%)樣品檢出AFM1，其中有4個樣品(3個為秋季樣品)AFM1含量超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)，秋季奶樣AFM1平均含量和檢出率均高于其他季節(jié)。謝文沛[29]研究表明，甘肅地區(qū)牛奶中AFM1的發(fā)生率和含量均在秋季呈現(xiàn)最大值，而夏季呈現(xiàn)最小值，且春季散戶牛奶中AFM1的檢出率高于規(guī)模場。本試驗結(jié)果也表明，秋季AFM1平均含量高于春季，且AFM1含量超過歐盟標(biāo)準(zhǔn)的2個樣品均來自秋季，但春季AFM1的檢出率高于秋季，可能由于廣西春季回南天空氣濕度大飼料普遍易受霉菌毒素的污染，而秋季AFM1平均含量高于春季，也可能是由于春季飼喂青綠飼料較秋季多，秋季大部分奶水牛養(yǎng)殖場飼喂青貯飼料偏多。研究表明青貯飼料較其他種類飼料AFB1污染程度較高[29]。本試驗結(jié)果散養(yǎng)春秋兩季樣品中AFM1檢出率均最低，可能是由于奶水牛散養(yǎng)飼喂品牌精料霉菌毒素污染少，且較規(guī)模化養(yǎng)殖飼喂青綠飼料較多，青貯飼料較少。Frey等[37]研究表明，巴西牛奶樣品中秋季OTA、FB1、FB2、α-ZEL和β-ZEL的PDI低于春季。本試驗結(jié)果顯示，秋季各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中OTA和DON的平均含量均高于春季，該試驗結(jié)果與Frey等[37]結(jié)果基本一致。綜上，廣西地區(qū)的原料水牛奶霉菌毒素污染程度秋季高于春季，但春季原料水牛奶中AFM1的檢出率高于秋季。

4 結(jié) 論

廣西地區(qū)各飼養(yǎng)模式生產(chǎn)的原料水牛奶中AFM1含量均低于中國限量標(biāo)準(zhǔn)，HT-2、T-2、α-ZEL、ZEN和DON的成人PMTDI和OTA的成人PTWI均低于JECFA設(shè)定值。原料水牛奶霉菌毒素污染程度秋季高于春季，但春季原料水牛奶中AFM1的檢出率高于秋季，散養(yǎng)春秋兩季樣品中AFM1檢出率均最低。因此，就霉菌毒素而言，當(dāng)前廣西地區(qū)原料水牛奶是安全的。