多色單分子定位顯微技術(shù)研究進展（特邀）

趙悅晗，郝翔

（浙江大學(xué) 光電科學(xué)與工程學(xué)院現(xiàn)代光學(xué)儀器國家重點實驗室，杭州310027）

0 引言

光學(xué)顯微鏡因具有非接觸、高特異性等技術(shù)優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域。然而，由于衍射的存在，標準光學(xué)顯微鏡技術(shù)的空間分辨率被限制在大約一半的光波長，橫向尺寸約為200～300 nm，軸向尺寸約為500～700 nm。這限制了光學(xué)顯微鏡技術(shù)解析單個分子或分子復(fù)合物的亞細胞組織的能力，例如，由數(shù)百種單獨的蛋白質(zhì)組成的核孔復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，直徑僅為約120 nm，無法由常規(guī)的光學(xué)顯微鏡觀察。為了克服衍射極限帶來的光學(xué)顯微鏡的分辨率屏障，在過去15年中誕生了一系列以受激發(fā)射損耗顯微成像術(shù)（Stimulated Emission Depletion，STED）［1-2］、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）［3-4］和單分子定位成像技術(shù)（Single-Molecule Localization Microscopy，SMLM）［5-7］為基礎(chǔ)的超分辨熒光顯微成像技術(shù)。熒光顯微鏡的分辨率也從幾百納米提高至幾納米［8-9］，其中，單分子定位顯微鏡也因為其天然的分子級別的定位方式，較高的分辨率，可較為便捷地對細胞結(jié)構(gòu)進行定量分析，成為科研人員研究細胞在分子水平功能的重要工具。自1995年被BETZIG E 等提出后［10］，就一直迅速地發(fā)展，2017年，BALZAROTTI F 等將SMLM 與STED 結(jié)合，提出了MINFLUX 概念［11］，實現(xiàn)了約1 nm 的定位精度和6 nm 的成像空間分辨率。

在SMLM 技術(shù)的一系列應(yīng)用中，標記不同的蛋白質(zhì)以探測其空間關(guān)系和相互作用的多色SMLM 成像可以大大增加從樣品中提取的信息含量，幫助我們更好地研究和理解不同細胞結(jié)構(gòu)間的相互作用。2013年，XU Ke 等［12］使用多色SMLM 首次揭示了神經(jīng)細胞軸突部分的周期性結(jié)構(gòu)，這一發(fā)現(xiàn)證實了多色單分子定位顯微鏡在研究亞細胞尺度生命結(jié)構(gòu)與相互作用方面的競爭力。目前已發(fā)展出的一系列多色SMLM 技術(shù)在可視化真核細胞中的細胞結(jié)構(gòu)［12］，研究復(fù)雜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成［13］，研究病原體與宿主細胞的相互作用［14-15］等方面已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。2017年，潘雷霆等［16］詳盡地總結(jié)歸納了當時主流的六種多色SMLM，并從分色能力、光譜竄擾、數(shù)據(jù)采集方式等角度分析了各方法的優(yōu)缺點。5年來，多色單分子技術(shù)發(fā)展迅速，本文在前文的基礎(chǔ)上，從生物樣品制備和光學(xué)系統(tǒng)改進兩個角度分析歸納這六類多色SMLM 在5年來的發(fā)展現(xiàn)狀與生物應(yīng)用，以便研究人員根據(jù)自身需求選擇合適的多色SMLM 開展相應(yīng)的研究。

1 單分子定位技術(shù)的分辨率

若單個熒光分子的點擴散函數(shù)（Point-Spread-Function，PSF）不與其它分子重疊，則可以高精度地確定其空間坐標。基于這一條件，SMLM 通過使用一系列可在亮暗態(tài)之間切換的染料或熒光蛋白，將衍射極限內(nèi)的兩個相鄰分子發(fā)出的熒光從時間上分離，從而可以分別定位單個分子，通過計算多個成像周期的數(shù)據(jù)并疊加重建，最終得到超分辨圖像。

單分子定位顯微鏡圖像的分辨率主要有幾種評估方式，一種常用的方法是利用定位精度估算圖像的分辨率，2002年，THOMPSON R E 等［17］利用最小二乘法對單個艾里斑進行高斯擬合，推導(dǎo)了單個熒光分子的橫向定位精度公式為

式中，σloc為定位的精度；a為像素大??；b為背景噪聲，N為分子發(fā)出的光子數(shù)，s是點擴散函數(shù)的標準差。

另一種計算定位精度σloc的方法是計算CRLB，CRLB 為任何無偏算法的方差提供了下限，如果點擴散函數(shù)為標準差為σ0的高斯函數(shù)，忽略了背景噪聲和讀出噪聲，在這種理想情況下，定位精度可以表述［18］為

可以看出，不論使用哪一種方法計算，當單個分子的光子數(shù)降低時，定位精度都會相應(yīng)下降。

目前另外一種常見的計算方法是對連續(xù)的生物樣品（例如微管）成像，并計算其半高全寬。傅立葉環(huán)相關(guān)分析［19］也可以用于度量圖像的空間分辨率但這種方法需要依賴用戶定義的閾值。目前最令人信服的表明圖像具有分辨率R或更高的分辨率的證據(jù)是在距離≤R時清楚區(qū)分不同的結(jié)構(gòu)。如在生物樣品中，可以區(qū)分已知距離的復(fù)合物（例如核孔）上的分子，則表明系統(tǒng)具有相應(yīng)的分辨率。

2 基于樣品制備的多色單分子定位技術(shù)

根據(jù)樣品制備時選取的熒光探針種類及其添加順序，可以將一些多色SMLM 歸納為基于多種合成染料的多色SMLM 技術(shù)，基于激活子和報告子組合的熒光探針對的多色SMLM 技術(shù)，基于反復(fù)淬滅-標記的多色SMLM 技術(shù)三大類。

2.1 基于多種合成染料的多色SMLM 技術(shù)

最常用的多色單分子樣品制備方法是選用多種不同發(fā)光譜段的熒光染料對生物結(jié)構(gòu)分別進行標記，在實驗過程中依次使用不同波長的激發(fā)光進行特異性激發(fā)，從而分別探測各顏色通道的熒光來實現(xiàn)多色成像。使用這種方法，2012年，L?SCHBERGER A 等［20］使用Atto 520 和AF647 的染料組合，實現(xiàn)了核孔復(fù)合物（Nuclear Pore Complex，NPC）及其中央通道的雙色圖像，觀測到了高度對稱的NPC 結(jié)構(gòu)。

這種方法原理簡單，各顏色通道分時成像，竄擾較小，但需要進行通道間的漂移校正，但為了保證染料分子的特異性激發(fā)，無法全部選用紅外波段的閃爍性能較好的染料，同時不同的熒光染料需要不同的化學(xué)緩沖液條件來保持其閃爍性能最優(yōu)，將多種熒光染料放在同一樣品的化學(xué)環(huán)境中，限制了熒光團的發(fā)光效率，導(dǎo)致部分通道探測到的光子數(shù)降低，所獲得的多色圖像的空間分辨率受到較大影響。

使用光活化熒光蛋白的多色SMLM 受到熒光蛋白在不同光譜區(qū)域的亮度和光穩(wěn)定性的影響。2011年，ENDESFELDER U 等［21］發(fā)現(xiàn)mEos2 熒光蛋白在各種成像緩沖條件下均有較好的成像表現(xiàn)，得益于這些耐受成像緩沖液的熒光蛋白的發(fā)光特性，將不同發(fā)射光譜的熒光蛋白和熒光探針結(jié)合使用，可以同時解決成像緩沖液對熒光染料性能的影響及熒光蛋白的選擇的問題。通過將mEos2［12］和AF647 結(jié)合，實現(xiàn)了細胞中肌動蛋白和微管的雙色成像，同年，LEHMANN M［22］將Dronpa 和AF647 相結(jié)合，實現(xiàn)了HIV 病毒與宿主之間的定量分析，研究了二者之間的相互作用。2015年，SPAHN C 等［23］以相同的原理，實現(xiàn)了細菌中蛋白質(zhì)、膜和染色體結(jié)構(gòu)的多色相關(guān)成像。

基于多種合成染料的多色SMLM 方法需要多個與熒光染料波段相匹配的激光器作為激發(fā)光，同時不同的顏色通道間需要分時依次成像，這導(dǎo)致系統(tǒng)的復(fù)雜度增高，同時實驗時間長，各通道之間需要進行漂移校正［24］。

2.2 基于熒光探針對的多色SMLM 技術(shù)

使用激活子和報告子相結(jié)合的熒光分子對的標記方式克服了上一方法的劣勢。這項技術(shù)的關(guān)鍵在于合成一對由激活子和報告子組成的探針對，其中報告子可在亮態(tài)和暗態(tài)之間進行多次切換，激活子則可對報告子實現(xiàn)光譜選擇性激活，通過選擇具有不同激活波長的激活子和報告子進行組合配對可合成具有不同激活光譜的熒光探針。在實驗過程中依次切換不同波段的激活光，再由相同的激發(fā)光探測同一個報告子發(fā)出的熒光，從而實現(xiàn)多色成像。

基于不同熒光探針對的多色SMLM 方法的關(guān)鍵優(yōu)勢在于檢測的為相同報告子發(fā)出的同波段的熒光，可以將不同顏色通道間的色差最小化，且一次成像就可獲得所有顏色通道的數(shù)據(jù)，不需要專門校正通道間的位移。同時，可以選擇Cy5、AF647 等亮度高，閃爍性能更好的報告子，保證單分子系統(tǒng)的空間分辨率。

這種方法在2007年由BATES M 等［25］提出，使用AF405-Cy5，Cy2-Cy5 和Cy3-Cy5 三種熒光探針對，結(jié)合了三個不同的激活波長對DNA 模型樣品進行三色成像，同時使用Cy2-AF647 和Cy3-AF647 探針對實現(xiàn)了20～30 nm 分辨率的哺乳動物細胞雙色成像。2010年，DANI A 等［26］使用相同的激活子搭配AF647 作為報告子實現(xiàn)了對突觸蛋白分布的納米精度測量。2012年，LUBECK E 等［27］使用AF405，AF488 和Cy3 用作激活子，Cy5，AF680 和AF750 作報告子的熒光探針對標記了酵母細胞中的mRNA，測量了32 個基因的mRNA 水平，同時實現(xiàn)了7 色成像。

但在這個方法中，激發(fā)光本身也會導(dǎo)致報告子的非特異性激活，這致使不同顏色通道之間的竄擾較高（約30%）［25］，導(dǎo)致在處理數(shù)據(jù)時需要舍棄一些定位數(shù)據(jù)，不利于其在定量多色單分子顯微鏡中的進一步應(yīng)用。

2.3 基于反復(fù)淬滅-標記的多色SMLM 技術(shù)

為在簡化光學(xué)系統(tǒng)的同時降低通道間的竄擾，2014年，TAM J 等［28］從樣品制備的角度出發(fā)，提出了基于熒光淬滅技術(shù)的多色SMLM，通過在不同目標蛋白標記上不同的一抗，并分批次對其進行二抗標記成像及淬滅，實現(xiàn)了五色單分子成像。這種方法僅需一個激發(fā)光源和一個激活光源即可實現(xiàn)多色成像，克服了不同熒光團的成像緩沖液的不兼容以及各顏色通道間的色差影響空間分辨率的問題，同時顏色通道數(shù)僅與一抗種類有關(guān)，可較簡單地實現(xiàn)4 色以上的多色成像。但由于需要在成像的同時對生物樣品進行操作，實驗過程復(fù)雜，且成像時間過長，需要對各通道間的顏色通道進行漂移校正，限制了這種方法的適用范圍。

基于與上述方法相似的原理，同年，JUNGMANN R 等［29］開發(fā)了一種基于DNA-PAINT 的順序多路復(fù)用方法Exchange-PAINT，其原理如圖1 所示，該方法利用具有同種顏色但不同核苷酸鏈序列的成像鏈與不同對接鏈結(jié)合進行多色成像。在具體的實驗過程中先使用具有不同核苷酸序列的對接鏈標記靶蛋白，再加入成像鏈P1*，該成像鏈與對接鏈P1 互補，可僅獲得用P1 標記的靶蛋白的DNA-PAINT 圖像，采集完成后洗滌去取成像鏈P1*，并引入成像鏈P2*，獲得另一組DNA-PAINT 圖像，重復(fù)洗滌和成像步驟，將采集到的圖像對齊并組合從而實現(xiàn)多色成像。使用這種方法，在細胞樣品中實現(xiàn)了對微管、線粒體、高爾基體和過氧化物酶的四色成像及DNA 折紙結(jié)構(gòu)上獲得了第一個十色的體外超分辨率圖像。與TAM J 等［27］的方法相比，Exchange-PAINT 同樣具有僅需單個激光源，使用單個染料各通道間無色差影響的優(yōu)勢。同時利用DNA-PAINT 成像鏈與對接鏈僅短時間結(jié)合的特點，Exchange-PAINT 在洗滌時不涉及標記和擦除的步驟，因此，各成像周期之間僅間隔1～2 min，這種實驗流程的簡化帶來了更快的圖像采集速度，這使得其擁有更大的應(yīng)用范圍。這種方法的多色能力取決于對接鏈DNA 序列的數(shù)量，這也使得其可以研究更為復(fù)雜的生物分子系統(tǒng)，2019年，WADE O K 等［30］結(jié)合此方法中順序發(fā)光的各顏色通道的閃爍頻率，實現(xiàn)了DNA 折紙結(jié)構(gòu)上的124 色成像。

圖1 Exchange-PAINT 的成像原理示意圖［29］Fig.1 Schematic diagram of the imaging principle of Exchange-PAINT［29］

3 基于光譜信息處理的多色單分子定位技術(shù)

除了上述在樣品方面實施的方法外，還可以通過在光學(xué)系統(tǒng)中添加一系列光學(xué)元件，根據(jù)熒光團的光譜信息針對性的對不同波長的顏色通道進行處理，并通過后期數(shù)據(jù)計算實現(xiàn)多色成像?；诠鈱W(xué)方法實現(xiàn)的多色SMLM 主要分為基于分光技術(shù)的比例成像方法、基于色散的光譜分析方法和基于點擴散函數(shù)工程技術(shù)的方法三大類。

3.1 基于分光技術(shù)的比例成像方法

比例成像的具體原理是具有相近發(fā)射光譜的熒光染料在經(jīng)過同一個激發(fā)光照射后，所發(fā)出的熒光被后續(xù)光路中的二向色鏡分為透射光和反射光兩路，這兩路光再分別被透鏡聚焦到同一個像面的不同位置成像。依據(jù)每個分子在兩個數(shù)據(jù)通道間的光強比對每個熒光點進行顏色識別，從而獲得多色圖像。

由于比例成像方法可以使用光譜相近的熒光染料，避免了不同熒光團對成像緩沖液的需求沖突，同時可以自主選擇閃爍能力最好的紅外波段的熒光染料，僅使用一個激發(fā)光源就可以同時獲得多個顏色通道的數(shù)據(jù)。但這也導(dǎo)致所選用的熒光探針間的發(fā)射譜發(fā)生交疊，由于染料受激發(fā)射熒光時會引入一定的泊松噪聲，從而導(dǎo)致一些單分子熒光點的兩通道間光強比處于無法被識別的中間區(qū)域，這導(dǎo)致在后期數(shù)據(jù)處理時丟掉一些數(shù)據(jù)點，并且造成了各顏色通道間的竄擾。除此之外，由于二色鏡分光導(dǎo)致不同通道間的光譜組成存在差異，這使得各通道間存在隨橫向位置變化的倍率色差，無法將兩路通道的數(shù)據(jù)進行疊加用于定位，這導(dǎo)致每種熒光染料都僅能選擇一個通道的光子用于定位，而光子數(shù)直接影響了單分子系統(tǒng)的定位精度［17］，這是基于比例成像的多色SMLM 方法的一大缺陷。

基于比例成像的多色SMLM 方法于2008年由BOSSI M 等［32］提出，使用SRA552 和SRA577 兩種染料，對哺乳動物的PtK2 細胞中的微管和角蛋白網(wǎng)絡(luò)進行成像，實現(xiàn)了定位精度為15 nm 的多色成像。2010年，TESTA I 等［33］使用比例成像的方法首次在固定的PtK2 細胞中實現(xiàn)了四色成像，并在活細胞中實現(xiàn)了雙色單分子成像。2012年，LAMPE A 等［34］基于相同的原理，使用AF647 和AF700 兩種近紅外波段的熒光染料實現(xiàn)了雙色成像，克服了以往使用的熒光染料所需的最佳緩沖液條件不同的影響。2015年，WINTERFLOOD C. M 等［35］將比例成像的方法與雙平面的3D 成像方法相結(jié)合，對海馬神經(jīng)元的軸突結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了3D 雙色成像，觀測到了其周期性結(jié)構(gòu)。

在這一研究的基礎(chǔ)上，ZHANG Yongdeng 等［36］在2020年對4pi-SMLM 系統(tǒng)進行了改進，提出了一種“拯救熒光”的4π 單點切換超分辨率顯微鏡，通過在4π 系統(tǒng)的一路探測光路中額外添加一片二向色鏡并使用另一臺相機收集此二色鏡反射的熒光，通過將此通道的熒光光強與原本4π 探測路中的相機接收到的光強做比，可以確定單分子熒光團的顏色。這種方法通道間的竄擾較低，同時通過二向色鏡反射收集的通道光強較低，分光對光子數(shù)的影響較小，降低了分光對定位精度的影響，通過這種方法實現(xiàn)了對高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等生物樣品的5～10 nm 精度的多色成像。

2020年，VISSA A 等［37］用可調(diào)節(jié)角度的薄膜濾光片代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中的二向色鏡在光譜上分離遠紅外波段的熒光團，在不同角度下，薄膜濾光片具有不同波長的通帶，由于這種調(diào)整具有連續(xù)的梯度，可以實現(xiàn)精細的調(diào)節(jié)，可以針對當前實驗所使用的熒光染料選擇最佳窗口，使通道間具有最低的竄擾。通過對線粒體蛋白TOM20 和過氧化物酶體蛋白PMP70 之間相互作用的雙色超分辨成像證明了這種方法的實用性。

2021年，WANG Yujie 等［38］將分色這一思路擴展到了CCD 像面上，通過在CCD 前添加按特定規(guī)則排列的濾光片陣列，一次成像得到成像不同發(fā)射光譜的像素，再通過不同濾光片下像素的光強占比確定分子顏色，從而得到多色圖像。這一方法簡化了實驗系統(tǒng)，在現(xiàn)有的單色單分子定位顯微系統(tǒng)中將相機替換為上述特制的CCD，即可實現(xiàn)多色成像。但同時由于只有未經(jīng)過濾的像素所采集到的數(shù)據(jù)被用來定位，即僅有一半的光子用于定位成像，所以這一方法的定位精度也會相應(yīng)下降。

2022年，CHEN Jianwei等［39］將4π 系統(tǒng)原本的四個探測光路分為具有π 相位差的兩組通道，并插入濾光片在兩個通道間創(chuàng)造光強差，通過熒光團在兩個通道的光子數(shù)的強度差來確定其顏色信息。這種方法利用了4π系統(tǒng)原本的光路設(shè)置，不添加額外的檢測通道，具有較高的光子收集效率，因此可實現(xiàn)更高的定位精度。

LI Yiming 等于2022年提出了globLoc 算法［40］，解決了比例成像應(yīng)用于單分子定位顯微鏡時，由于分光致使的定位精度降低的問題，通過計算確定多通道間的映射關(guān)系，進一步生成多通道的PSF 模型，并對多通道的單分子數(shù)據(jù)進行處理。使用AF647、DY634、CF660C 和CF680 四種染料，對單個NPC 中的NUP96，NUP62，ELYS 和WGA 進行標記并成像，同時對突觸復(fù)合物進行了三色成像，見圖2，可以在很低竄擾的情況下清晰分辨，三個組件的空間布置與先前的研究非常吻合，證實了該方法的應(yīng)用前景。

圖2 應(yīng)用globLoc 算法在比例成像中對NPC 進行成像，使用AF647、DY634、CF660C 和CF680 分別對NUP96，NUP62，ELYS 和WGA 進行標記［40］Fig.2 Performance of globLoc on ratiometric multi-color data. 4 color 3D imaging of Nup62-DY634，Nup96-AF647，ELYS-CF660C and WGA-CF680 in the NPC［40］

3.2 基于色散的光譜分析方法

基于光譜技術(shù)的多色隨機光學(xué)重建顯微技術(shù)（Spectrally Resolved STORM，SR-STORM）主要是通過在探測通道中添加三棱鏡［41］、光柵［42］等色散元件，將熒光分為兩路，其中聚焦的一路光強較強，用于分子三維位置的計算，另一路熒光信號則由色散元件進行空間光譜展開，用于獲取熒光分子的光譜信息，進行顏色識別，兩路熒光信息相結(jié)合實現(xiàn)多色超分辨成像，這種單分子多色成像方法同時也廣泛應(yīng)用于單分子動力學(xué)和單分子極性研究領(lǐng)域［43］。

基于光譜技術(shù)的多色SMLM 因為選用的熒光染料之間的光譜較為接近，可使用同一套激發(fā)光源與激活光源，通過一次成像就可同時獲得多色超分辨圖像。同時由于可獲得熒光分子的光譜信息，對熒光分子的種類進行精確識別，不同顏色通道間的竄擾很低。但同樣由于分光減少了用于定位的熒光光子數(shù)，一定程度上影響了該方法的空間分辨率。除此之外，單個分子的PSF 在光譜展開后，在像面上會占據(jù)更大的面積，在成像過程中更容易在單幀圖像中發(fā)生重疊，限制了其在高密度生物樣品中的應(yīng)用。

根據(jù)使用的色散元件的不同，基于光譜的SMLM 方法可大致分為使用棱鏡進行分光和使用光柵進行分光兩大類。

使用棱鏡分光的多色SMLM 方法在2015年由ZHANG Zhengyang 等［41］首次提出，該系統(tǒng)通過在雙物鏡系統(tǒng)的一路中添加三棱鏡進行分光，選用Dy634，DL650，CF660C 和CF680 共4種熒光染料，對PtK2 細胞中過氧化物酶體，波形蛋白絲，微管和線粒體外膜進行成像，實現(xiàn)了10 nm 光譜分辨率的低竄擾3D 四色成像。2017年，同組研究人員［44］通過分束鏡將收集到的熒光信號拆分為兩個光路，證明了這一原理在單物鏡系統(tǒng)中實現(xiàn)活細胞實時成像的可行性。MLODZIANOSKI M J 等［45］將棱鏡應(yīng)用于PALM 中，同時測量單個熒光蛋白分子的空間位置和發(fā)射光譜，量化了單個熒光蛋白分子的發(fā)射光譜隨時間的波動變化，見圖3。2018年，HUANG Tao 等［46］將這種方法應(yīng)用在單分子追蹤中，使用單個激光激發(fā)，實現(xiàn)了實時低竄擾的三色單分子追蹤，在獲得10～15 nm 的光譜分辨率的同時，實現(xiàn)了20～40 nm 的空間分辨率。

圖3 使用光柵進行色散對微管和線粒體進行雙色成像［42］Fig.3 Dual-color imaging of microtubules and mitochondria using grating［42］

使用衍射光柵代替棱鏡對探測熒光的PSF 進行色散的光譜光子定位顯微鏡（spectroscopic photon localization microscopy，SPLM）在2016年由DONG Biqin 等［42］首先實現(xiàn)，如圖4（a）所示，該系統(tǒng)利用反射光柵進行分光，區(qū)分出了光譜上相距15 nm 的兩種熒光分子，在Cos7 細胞中實現(xiàn)了對微管和線粒體進行了雙色同步成像。隨后，ZHANG Yang 等［47］利用透射光柵將探測熒光分成零級和一級光，使用AF647、CF660C和CF680 共三種染料分別對COS-7 細胞中的ATPB、微管蛋白和TOM20 蛋白進行標記，實現(xiàn)了低誤差識別率（5%）的三色單分子成像。在隨后的研究中，同一研究小組于2021年［48］使用基于衍射光柵的SRSTROM 系統(tǒng)，實現(xiàn)了角膜內(nèi)皮細胞中的β-微管蛋白和組蛋白-H4 的雙色成像，空間分辨率為20 nm，和基于棱鏡的SR-STROM 相當。

在對分子進行3D 定位時，對于使用光柵分光的SR-STORM 系統(tǒng)，引入像散會使熒光分子的PSF 形狀同時受到光譜信息和分子軸向位置的影響，所以無法像使用棱鏡的SR-STROM 一樣通過在定位光路中簡單添加柱透鏡的方式來實現(xiàn)3D 成像。為解決這一問題，SONG K H 等［49］使用雙平面的方法從已經(jīng)建立的空間和光譜成像通道中獲得了軸向位置信息，使用AF647 和CF660C 對COS-7 細胞中的線粒體和微管進行標記，實現(xiàn)了三維雙色單分子成像。

2021年，KIM G 等［50］將基于光柵的SR-STROM 與基于棱鏡的SR-STROM 進行了比較。基于棱鏡的SR-STROM 由于需要兩路光進行嚴格的光學(xué)對準，在裝置上更為復(fù)雜，同時使用棱鏡會使熒光需要通過多個光學(xué)元件，導(dǎo)致熒光信號的衰減，從而導(dǎo)致系統(tǒng)空間分辨率的下降。KIM G 等還研究了這種光學(xué)損耗及光柵本身相對較高的傳輸損耗對定位精度的影響，發(fā)現(xiàn)光柵（26 nm）可提供稍高于棱鏡（30 nm）的空間分辨能力。針對上述光柵的高傳輸損耗以及對光學(xué)對準的嚴格要求帶來的限制，2022年，SONG K H 等［51］通過設(shè)計特殊的雙楔棱鏡制作了單片成像光譜儀，如圖4（b）所示，并將其應(yīng)用于光譜展開的單分子定位顯微系統(tǒng)中，實現(xiàn)了對微管和線粒體的3D 雙色成像。

除此之外，在基于光柵的SR-STROM 和基于棱鏡的單目標的SR-STROM 方法中，空間和光譜分析都僅使用總光子的一部分，從而導(dǎo)致兩個通道中的精度降低。研究人員通過開發(fā)更明亮的熒光團或者提高系統(tǒng)的光子檢測效率的方法來解決這一問題。DANYLCHUK D I 等［52］提出了一種基于尼羅紅分子的新型探針，通過引入低親和力的膜粘合劑來提高亮度和改善其特異性。CHUNG J 等［53］通過優(yōu)化成像緩沖液來增加熒光團的光子數(shù)。根據(jù)其最新研究，可以通過改變成像緩沖液的組成如硫醇試劑的類型和濃度，折射率和pH 值等來改變熒光團的光子數(shù)量，實現(xiàn)增加探測到的光子數(shù)的目的。

為了提高光子檢測效率，SONG K H 等［54］提出了一種對稱色散的SR-STROM 方法（Symmetrically Dispersed sSMLM，SDsSMLM），其原理圖如圖4（c）所示，同時收集熒光在通過衍射光柵后的-1 級和+1 級衍射光，用這兩個對稱分散的光譜通道代替?zhèn)鹘y(tǒng)的一個空間通道和一個光譜通道的分光方案，從而完全利用來自單個分子的所有光子，實現(xiàn)了對固定細胞的多色成像，將空間和光譜精度提高了42%和10%，在1 000個光子預(yù)算的條件下實現(xiàn)了10 nm 的空間分辨率和0.8 nm 的光譜精度。

圖4 SR-STROM 的光學(xué)裝置示意圖Fi g.4 The optical set-up of SR-STROMs

3.3 基于點擴散函數(shù)工程技術(shù)的方法

點擴散函數(shù)工程［55］（Point-Spread-Function Engineering ，PSFE）是指使用柱透鏡、空間光調(diào)制器等器件對探測熒光進行編碼的方法，將PSFE 與SMLM 相結(jié)合可以使得PSF 形狀隨分子的軸向位置變化，從而攜帶深度信息。通過PSF 的形狀，可以得到熒光分子的三維位置信息。

這種方法適合于低密度的熒光分子的跟蹤，同時通道間的竄擾較低，但受限于單分子定位顯微鏡的成像原理，要精確定位熒光分子的位置，需要每幀圖像中的熒光分子保持稀疏性，而在熒光分子密度較高時，編碼后形狀較大的PSF 會在成像面發(fā)生交疊，因此在生物樣品的成像方面應(yīng)用受限。

2016年，SHECHTMAN Y 等［56］提出利用一種特殊設(shè)計的相位板，在對深度信息進行編碼的同時直接對光譜信息進行編碼，同時為不同的波長產(chǎn)生不同的PSF，從而在不分光的條件下實現(xiàn)了同時對雙色熒光微球進行單分子追蹤及對生物細胞的雙色超分辨成像。2017年，利用上述的超分辨顯微系統(tǒng)，實現(xiàn)了對釀酒酵母的三維雙色活細胞單分子追蹤［57］，分析了圍繞GAL 位點的兩個熒光標記的DNA 位點的動力學(xué)原理，證明了此方法在研究生物學(xué)環(huán)境中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象和動態(tài)方面的潛力。為進一步提高基于點擴展函數(shù)工程技術(shù)的多色SMLM 的成像效果，SIEMONS M 等［58］使用空間光調(diào)制器對光學(xué)系統(tǒng)的像差進行了校正，實現(xiàn)了遠低于衍射極限的高精度波前控制，為更好地應(yīng)用復(fù)雜的PSFE 創(chuàng)造了條件。

近年來，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)已被廣泛應(yīng)用于超分辨顯微鏡領(lǐng)域［59］，而單分子定位顯微鏡因為具有發(fā)射器相對稀疏的特性，降低了機器學(xué)習(xí)通常需要的大量訓(xùn)練數(shù)據(jù)的要求，得到了迅速發(fā)展，目前已經(jīng)提出了多種機器學(xué)習(xí)與PSFE 相結(jié)合的多色單分子成像方法。2019年，KIM T 等［60］利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)從單個分子的PSF 圖像中提取了單分子顏色，在常規(guī)定位顯微鏡的同一通道中對微管和線粒體實現(xiàn)了同時雙色成像，這種方法不必修改PSF 形狀，降低了對生物樣品的要求。同年，HERSHKO E 等［61］將深度學(xué)習(xí)應(yīng)用于單分子定位顯微鏡，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將PSF 的調(diào)制過程與單分子圖像的顏色識別相結(jié)合，可同時區(qū)分單分子圖像中的四個顏色通道。NEHME E 等通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為高密度發(fā)射器的情況優(yōu)化了最佳的編碼PSF［62］及對雙通道光學(xué)系統(tǒng)的多個PSF 進行了端到端學(xué)習(xí)的方法［63］，分別實現(xiàn)了4 μm 深度的單分子成像和活細胞內(nèi)的快速單分子追蹤，這兩種方法都在一定程度上降低了PSF 編碼導(dǎo)致的擴大的PSF 在熒光分子密度較高時發(fā)生交疊所帶來的影響。2021年，OPATOVSKI N 等［64］利用二色鏡將熒光分為三個光譜通道，分別在瞳面上放置相位板，從而產(chǎn)生通道特異性的PSF，再將它們重新組合到攝像機的同一區(qū)域中，實現(xiàn)了在110×70×4 μm3的大視場情況下熒光納米顆粒的五色單分子追蹤及活細胞中熒光標記DNA 的3D 追蹤，見圖5。

圖5 基于PSFE 的三色SMLM 的光學(xué)系統(tǒng)和瞳孔平面上的相位掩模［64］Fig.5 The optical system and Representation of the phase masks placed at the pupil plane［64］

以上介紹了目前流行的幾種多色SMLM 技術(shù)，這幾種多色SMLM 的實現(xiàn)原理各異，在空間分辨率、光譜分辨率、成像時間、通道間竄擾和適用的樣品范圍等方面各有優(yōu)缺點，都在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有所應(yīng)用，對目前已發(fā)展出的多色單分子定位技術(shù)的優(yōu)勢做總結(jié)，并將其進行了比較，如圖6 所示。

圖6 多色單分子定位技術(shù)的對比Fig.6 Comparison of different Multicolor SMLM

這些方法尤其是基于光學(xué)改進的方法，所使用的染料對多為常用的幾種性能較好的近紅外染料，表1 列舉了每種多色SMLM 方法中具有代表性的染料組合及其相關(guān)使用場景。

表1 不同多色SMLM 方法所使用的染料組合Table 1 Dye combinations used in different multicolor SMLM

4 結(jié)論

本文從生物樣品制備和光學(xué)系統(tǒng)改進兩個角度，追蹤了近5年來提升多色單分子定位顯微技術(shù)性能的各類方法的最新進展，比較了其適用的生物場景。多色單分子定位顯微鏡是研究細胞間相互作用的重要工具，其未來的發(fā)展可以聚焦于以下幾方面：1）進一步提高染料分子的抗漂白特性，能否通過對熒光探針和緩沖液的研究，如改變氧氣或硫醇的濃度等緩沖液的配比來獲得更長的狀態(tài)壽命和更高的光子產(chǎn)量，進而在不增加成像時長的同時提高定位精度。2）快速成像，多色SMLM 的基本原理是通過時間換取空間的策略分離PSF，這也導(dǎo)致了SMLM 需要較長的成像時間，在配合高幀率的sCMOS 相機和高激發(fā)光光強（＞50 kW·cm-2）的情況下對超過10 000 個的哺乳動物細胞進行雙色三維成像需要26 h［65］，提高成像速度的一個方法是提高激活概率，但這同時也會帶來PSF 重疊進而影響定位結(jié)果的問題。目前已經(jīng)開發(fā)了一系列針對這一問題的算法［66］，通過連續(xù)圖像之間的計算差異或者計算熒光波動的時間和空間相關(guān)性［67］來產(chǎn)生超分辨率圖像，但無論數(shù)據(jù)分析的改進如何，PSF 重疊導(dǎo)致的分辨率下降仍普遍存在，進一步開發(fā)適用于重疊PSF 定位的算法，提高成像速度，對擴展多色SMLM 的生物應(yīng)用范圍十分重要。3）活細胞成像，在研究活細胞中結(jié)構(gòu)動力學(xué)方面，多色SMLM 收到較大的限制，快速成像所需的高激光功率帶來的光漂白和光毒性使目前的研究主要局限于相對緩慢移動的結(jié)構(gòu)，而選取合適的透膜染料或熒光蛋白又進一步的限制了多色SMLM 成像對生物樣品的空間關(guān)系和相互作用的研究。