活體顱骨光透明方法及應用（特邀）

李東宇，俞婷婷，朱京譚，朱?

（1 華中科技大學武漢光電國家研究中心，Britton Chance 生物醫(yī)學光子學研究中心&生物醫(yī)學光子學教育部重點實驗室，武漢430074）

（2 華中科技大學 高端生物醫(yī)學成像設施，武漢430074）

（3 湖北光谷實驗室，武漢430074）

0 引言

在體觀測大腦的結構和活動，對了解大腦以及腦疾病相關的神經血管功能障礙具有重要意義［1-3］。現代光學成像技術侵入性低、分辨率高，因而能夠用于活體觀測生物結構和功能［4-10］，在腦科學領域發(fā)揮著重要作用［11-13］。例如，激光散斑對比成像可以實現對皮層血流變化的動態(tài)監(jiān)測［14-15］，高光譜成像［16-17］可以用于監(jiān)測血管中的血氧飽和度［18-19］，光學相干斷層掃描可以在微米級別的分辨率下對組織進行三維成像［20-21］。非線性光學顯微鏡（雙光子熒光成像、三光子熒光成像、二倍頻成像、三倍頻成像等）可以觀測大腦皮層的深層神經細胞和血管結構功能［22-26］，并被用于相關疾病的研究［27-28］。

但是，在活體狀態(tài)下，大腦上面有顱骨覆蓋，而顱骨對光的強散射嚴重限制了光的穿透深度，進而影響了皮層成像的質量和深度［29-30］。為了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術顱窗，主要包括開顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體［31-32］。開顱玻璃窗可以保持一個月以上，因此適用于長期重復成像［33］。但是，開顱手術容易導致炎癥反應，且往往會持續(xù)約2 周［32，34］，因此開顱玻璃窗不適合對急性模型的觀測。磨薄顱骨窗的建立通過將部分顱骨磨薄至約25 μm 左右，在這種情況下，顱骨不會過多地限制光的穿透，因而可以實現對皮層的活體高分辨觀測。但磨薄顱骨窗不適用于大視場觀測皮層，因為將大面積的顱骨均勻地磨薄至25 μm 的難度非常大［35-37］。另外，顱骨被磨薄后會重新生長，并且新生的顱骨質地會發(fā)生變化、且易碎，成像質量會隨著反復磨薄越來越差、且難以實現多次的重復打磨［32］。所以，磨薄顱骨窗不適用于長期跟蹤觀測。

近年興起的組織光透明技術可以降低生物組織的散射，增強光在組織中的穿透能力，已被廣泛應用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像［38-44］。不僅如此，組織光透明技術在活體水平也得到了很好的應用。研究人員發(fā)展的活體顱骨光透明技術，以及基于此建立的光透明顱窗，可以在不進行開顱手術的情況下，結合多種現代光學成像手段，實現大腦皮層的神經血管結構和功能的觀測。研究人員針對不同的應用場景，開發(fā)了不同的光透明顱窗，可以分別滿足高分辨、大視場、長時程觀測等要求。相比于開顱玻璃窗，光透明顱窗可以避免手術帶來的炎癥反應，從而適用于急性觀測；相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可以通過反復建立而觀測數月，從而實現長期跟蹤監(jiān)測。本文將從活體顱骨光透明技術與應用的角度進行介紹。

1 活體顱骨光透明技術

活體組織光透明技術最早用于皮膚的透明化成像，能夠提高小鼠、大鼠等實驗動物皮膚對光的穿透能力［45］，甚至可以提升對人體皮膚的成像深度［46-47］。經典的活體皮膚光透明試劑包括甘油、丙二醇、聚乙二醇-400 等［47］，它們的作用是使組織脫水并解離膠原蛋白，配合物理或者化學促滲方法，可以大大提升皮膚的透明度。但是，顱骨（硬組織）和皮膚（軟組織）的結構完全不同，它在失水的狀態(tài)下反而會更加渾濁，因而顱骨透明化的思路必須與皮膚不同?？蒲腥藛T經過不斷探索，終于在2012年用多種試劑的混合溶液首次實現了活體小鼠的顱骨透明化并用于光學成像［48］。而后，研究人員進一步從中篩選有效試劑并優(yōu)化配比，以及加入新的試劑，不斷完善方法，開發(fā)了一系列光透明顱窗。

顱骨的主要成分包括羥基磷灰石（鈣質）、膠原蛋白（16%）、脂質（54%）和水（14%）［49］。因此，活體顱骨光透明的基本原理就是（部分）去除顱骨中的鈣質、脂質和蛋白質，并用折射率匹配液進一步提高透明效果（如圖1）。

圖1 活體顱骨光透明的基本原理［50-51］Fig.1 Basic principle of in vivo skull optical clearing［50-51］

1.1 SOCS：實現活體顱骨光透明

為了去除顱骨中的散射子，WANG Jing 等［48］發(fā)明了一種顱骨光透明液（Skull Optical Clearing Solution，SOCS），它是一種包含乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），二甲亞砜、山梨醇、月桂醇、乙醇、葡萄糖的弱堿性溶液。在實驗過程中，首先將小鼠的頭皮剪開，暴露顱骨，然后將顱骨用SOCS孵育25 min即可讓混濁的顱骨變得透明，皮層微血管也逐漸從不可見變得清晰，能夠分辨的最小血管直徑為（14.4±0.8）μm，而在開顱狀態(tài)下可分辨的最小血管直徑為（12.8±0.9）μm，證明顱骨透明化的成像效果接近于開顱狀態(tài)。

SOCS 可以提高激光散斑成像的質量，實現皮層血流分布可視化［48］，YANG Xiaoquan 等［52］在體研究了SOCS 處理前后皮層血管光聲成像的差異，發(fā)現透明后相同血管的光聲信號顯著增強，原本無法觀測的深皮層血管也可以清楚地觀察到。定量分析結果表明，顱骨光透明處理后，光聲信號增加到原始的2.59 倍，且不會改變皮層血管的直徑。SOCS 首次為皮層血管成像提供了一個無需手術的顱窗，證明了活體顱骨光透明的可行性。但其安全性、有效性及可重復性有待進一步評估。

1.2 SOCW：實現穿顱神經樹突棘成像

2018年，ZHAO Yanjie 等［53］提出了一種優(yōu)化的顱骨光透明窗（Skull Optical Clearing Window，SOCW），結合雙光子熒光顯微鏡可以獲得達到突觸級別的成像分辨率。顱骨中的無機基質和有機基質的主要成分分別是羥基磷灰石鈣和膠原蛋白，隨著小鼠年齡的增長，無機基質和有機基質的比例也會發(fā)生變化。因此，對于幼年小鼠（出生20 天之內）和非幼年小鼠（出生大于20 天），采用不同的光透明流程。

SOCW 的建立步驟分為兩步：對于出生15～20 天的小鼠，用10%的膠原酶溶液孵育5～10 min；對于出生21～30 天的小鼠，將膠原酶溶液置換為10%的EDTA 二鈉溶液，同樣孵育5～10 min；對于出生超過30 天的小鼠，顱骨生長得更厚，因此需要先將顱骨磨薄至約100 μm，然后用10%的EDTA 二鈉溶液孵育5～10 min。進一步，將80%的甘油滴加在顱骨上，進行折射率匹配，即完成了光透明顱窗的建立。SOCW 建立的顱窗可以通過用磷酸緩沖液擦洗顱骨來“關閉”，即使得顱骨恢復到渾濁狀態(tài)。但是，如果需要在第二天進行重復開窗觀測，光透明處理的時間需要比前一天略長一些。

利用雙光子熒光顯微鏡，可以透過SOCW 實現對皮層20～80 μm 深處的神經元樹突棘的觀測，說明其分辨率可以達到亞微米尺度，這是活體顱骨光透明技術的一個突破；與此同時，該方法在安全性方面得到了有效驗證。但是，該方法用于4 周齡以上的小鼠時需要對顱骨進行打磨，不僅增加了實驗難度，還會遇到與磨薄顱骨窗同樣的問題，即難以實現大視場的觀測以及長期重復觀測。

1.3 USOCA：可開合的大視場顱窗

2018年，ZHANG Chao 等［54］發(fā)展了一種基于尿素的光透明方法（Urea-based Skull Optical Clearing Agent，USOCA），成功解決SOCW 未能解決的兩大難題，即視場較小和無法實現長期跟蹤。

USOCA 包含兩種混和試劑，其一是75%乙醇溶解的飽和尿素溶液，乙醇溶液與尿素的體積-質量比約為10∶3 mL/g。其二是高濃度的十二烷基苯磺酸鈉（Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate，SDBS）溶液，它是由0.7 mol/L 的氫氧化鈉溶液與十二烷基苯磺酸配置而成的，前者與后者的體積-質量比約為24∶5 mL/g，且pH 值保持在7.2～8 的范圍內。乙醇分子上的羥基可以促使膠原解離，尿素不僅因其有水合作用而被廣泛用于組織透明化，還可以起到促滲的作用；十二烷基苯磺酸鈉是一種離子型去垢劑，有去脂作用，可以使得顱骨成分更加均一。

剪開小鼠頭皮、暴露顱骨后，用第一種試劑滴加在顱骨，其間用鑷子夾住小棉球不斷在顱骨上按摩，進行物理促滲，顱骨會慢慢變透明。10 min 后，擦除第一種試劑，將第二種試劑滴加在顱骨上，并孵育5 min，在這段時間內，顱骨會很快變得更為透明。由于完全不需要對顱骨進行磨薄處理，可以根據實驗需要調整光透明顱窗的尺寸，實驗人員利用USOCA 對缺血性腦卒中及再灌注過程進行了雙側大腦皮層的血流成像。待成像完成后，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）將光透明試劑清洗干凈，顱骨即可恢復至原有狀態(tài)，即“關閉”光透明顱窗。若需要進行重復成像，只需再進行透明操作即可再次“打開”光透明顱窗。

值得一提的是，USOCA 可以適用于2～8月齡的小鼠，這一特性與大視場和可長期重復“開合”的特性，極大地拓展了活體顱骨光透明技術的應用范圍。但是，USOCA 結合雙光子熒光顯微術，也僅能獲得皮層300 μm 的成像深度，這遠遠不到小鼠皮層的厚度（＞1 mm）。因此光透明顱窗的透明度還有待進一步提升，來滿足深皮層成像的需求。

1.4 SOCW 結合USOCA：進一步提高透明度

為了進一步提高光透明顱窗的透明度，CHEN Yage 等［55］將SOCW 和USOCA 兩種顱骨光透明方法進行結合，并從理論和實驗兩個方面驗證了這種結合的可行性。在研究中，他們利用非標記的高光譜受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）顯微術對兩種顱骨光透明方法的分子機制進行了闡釋。SRS 可以將光透明劑對顱骨不同成分的影響進行可視化。

SOCW 的主要成分是膠原酶和EDTA。研究發(fā)現，10%的膠原酶孵育5～10 min 后，顱骨表面的膠原纖維能得到有效解聚。然而，膠原酶不能降解羥基磷灰石和羥基磷灰石內部的膠原。相反，EDTA 孵育5～10 min后，骨陷窩周圍形成大量空腔，顱骨內羥基磷灰石的厚度明顯降低。這意味著EDTA 不僅能分解羥基磷灰石，還能使蛋白質均質化。USOCA 的主要有效成分是尿素的75%乙醇溶液（S1）和十二烷基苯磺酸鈉溶液（S2）。研究表明，USOCA 孵育15 min 后，顱骨表面和深層區(qū)域的蛋白均被解聚并重新均勻分布。結果還表明，與膠原酶相比，USOCA 具有更強的溶解蛋白質的能力。

由于SOCW 和USOCA 的透明機理有所不同，CHEN Yage 等結合兩種方法，并開展了活體實驗?？蒲腥藛T依次用USOCA（25 min）、10%的EDTA（25 min）對顱骨進行孵育，去除后滴加80%的甘油并進行成像，可以得到非常顯著的透明效果。結合三光子熒光顯微鏡，可以對皮層850 μm 深的血管進行成像觀測。

將SOCW 和USOCA 進行結合，進一步拓展了光透明顱窗下的成像深度。但是，結合兩種方法，使得光透明顱窗的建立時間接近一個小時，降低了便捷性。另一方面，同時去除了顱骨中的膠原蛋白和羥基磷灰石，可能使得顱骨的剛性結構、以及它對大腦的保護作用受到影響，不利于長期跟蹤觀測。

1.5 VNSOCA：可見-近紅外兼容的光透明顱窗

顱骨光透明技術主要著眼于減低顱骨的散射，這對于利用可見光和近紅外Ⅰ區(qū)（700～900 nm）波段的成像非常重要。但是，在近紅外Ⅱ區(qū)（900/1 000～1 700 nm），生物組織的散射減少［56-60］，吸收就是另一個需要考慮的重要因素。

LI Dongyu 等［51］測量了USOCA 方法所用的兩種混和試劑的透過率，發(fā)現在近紅外Ⅱ區(qū)、尤其在1 300 nm以上的波段有著非常大的吸收，這對于近紅外Ⅱ區(qū)成像顯然非常不利。研究發(fā)現，該吸收主要是光透明試劑中的重要成分——水（H2O）帶來的。為了克服這一問題，研究人員將水替換成在可見光到近紅外Ⅱ區(qū)均有較高透過率的重水（D2O），并將以此配置的顱骨光透明試劑命名為適用于可見-近紅外Ⅱ區(qū)的顱骨光透明試劑（Visible-Near infrared Ⅱ-compatible Skull Optical Clearing Agent，VNSOCA）。

研究人員首先用體外成像實驗比較了USOCA 和VNSOCA 對近紅外二區(qū)激發(fā)的非線性光學成像的適用性。研究人員將一種三倍頻探針的溶液放置在毛細玻璃管中，將其放置在1 560 nm 飛秒激光激發(fā)的三倍頻顯微鏡下，分別將USOCA 和VNSOCA 作為成像介質進行成像。結果表明，由于USOCA 對激發(fā)光有較大的吸收，限制了整套成像方案的效率，因而探測到的三倍頻信號非常有限。相對的，VNSOCA 作為成像介質時，測得的信號強度提升了3 倍以上。進而，研究人員進行了活體實驗。結果表明，即使基于利用近紅外二區(qū)（1 560 nm）激發(fā)的三倍頻成像技術，也只能在渾濁顱骨下獲取皮層200 μm 深的毛細血管結構，而VNSOCA 建立的光透明顱窗，可以將穿顱血管成像深度提升3 倍以上。VNSCOA 的發(fā)明，為顱骨光透明顱技術在近紅外Ⅱ區(qū)成像領域的應用提供了方法，拓展了光透明顱窗適用的波段范圍。幾種顱骨光透明技術的比較見表1。

表1 幾種顱骨光透明技術的比較Table 1 Comparisons of skull optical clearing techniques

續(xù)表

2 活體顱骨光透明用于神經/血管成像

活體顱骨光透明技術與多種光學成像方法技術的結合，已被證明可廣泛用于小鼠腦皮層神經細胞（神經元、膠質細胞）和血管的觀測。比如，利用激光散斑襯比成像技術和高光譜成像技術，可以對皮層表面血管的血流和血氧分布進行無標記成像；利用雙光子熒光成像、三倍頻成像等非線性光學成像技術，可以對皮層深層神經血管結構實施三維觀測。

2.1 突觸可塑性觀測

神經元樹突棘的生長和消融與記憶和認知功能有著緊密的聯系，其異常往往與許多腦神經疾病相關［66-67］，因而觀測其變化具有重要的生物學意義［68-70］。但是，樹突棘的尺寸在亞微米級，這就對成像方法提出了很高的要求。一般來說，在體觀測神經元樹突棘需要使用雙光子熒光顯微鏡，同時配合開顱玻璃窗或磨薄顱骨窗。光透明顱窗技術為該應用提供了一種新型的低侵入式的觀測思路。

ZHAO Yanjie 等［53］率先驗證了光透明顱窗用于觀測神經元突觸可塑性的可行性。利用SOCW，研究人員對神經元自發(fā)表達黃色熒光蛋白（Yellow Fluorescent Protein，YFP）的小鼠進行了活體成像。結果表明，SOCW 的建立使得圖像質量得到顯著改善，足以對樹突棘進行清晰地成像。進一步地，對幼鼠（P19）的神經元樹突棘進行了為期1 小時的持續(xù)觀測，觀察到樹突棘的出現和消失、以及形狀的變化。并且，相較于樹突棘，神經元的絲狀偽足具有更高的運動性，它甚至可以轉化為樹突棘，說明絲狀偽足在發(fā)育過程中可能是樹突棘的前體。這些結果表明，小鼠神經元突觸的可塑性在第三周是非常強的（如圖2）。

圖2 透過SOCW 對出生19 天的未成年小鼠的突觸可塑性的動態(tài)觀測［53］Fig.2 Dynamical monitoring of the plasticity of dendritic protrusions in infantile mice（P19）through the SOCW［53］

2.2 皮層血流血氧跟蹤監(jiān)測

血流和血氧變化是反應血管功能的重要指標，監(jiān)測皮層血流、血氧信息對于研究多種腦疾病有著重要的意義［71-73］。激光散斑襯比成像是一種非標記的、高時空分辨的血流分布成像技術［74-76］；高光譜成像技術是一種非標記的血氧分布成像技術［76-78］。顱骨光透明技術的出現使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流血氧信息。

ZHANG Chao 等［54］發(fā)展的USOCA 技術極大地拓展了光透明顱窗在皮層跟蹤監(jiān)測方面的應用。利用搭建的激光散斑襯比成像/高光譜成像雙模態(tài)系統，結合USOCA，科研人員對大腦中動脈阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）后的雙側皮層血流血氧分布進行了30 min 的持續(xù)觀測。結果表明，隨著時間的推移，手術側血流和血氧值都急劇下降。MCAO 術后10 min，手術側動脈血流的下降值約為初始值的60%，并在術后30 min 完全停止流動。，術側靜脈血流在術后10 min 時下降約40%，30 min 時，下降約60%。血氧飽和度的變化與血流的變化規(guī)律基本一致。在MCAO 對側，血流顯著增加，動脈血流增加到初始值的近3 倍，靜脈增加約50%。然而，研究人員發(fā)現手術對側的動靜脈血氧飽和度只是略有增加。

不僅如此，利用USOCA，可以持續(xù)一周地每天對小鼠進行顱骨透明化操作并獲取血流血氧信息。不僅如此，研究人員對2月齡的小鼠進行了每月一次、為期5 個月的持續(xù)成像，并成功觀察到皮層血管網的動態(tài)變化，即部分血管的消失和新生（圖3）。

圖3 基于USOCA 的重復光透明成像用于皮層血流和血氧監(jiān)測［54］Fig.3 Repeatability of USOCA-based optical clearing imaging of cortical blood flow and blood oxygen［54］

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，因此有監(jiān)測糖尿病不同發(fā)展階段體內腦血管功能障礙的變化具有與重要意義。FENG Wei 等［61］透過基于USOCA 建立的顱骨光透明窗，對一型糖尿病發(fā)展過程中，小鼠皮層血流和血氧對擴血管藥物硝普化鈉的響應變化進行了可視化研究。結果表明，對于健康小鼠，靜脈注射硝普化鈉后，皮層血流值會快速下降，然后快速上升并超過基線值，最終恢復至靜息狀態(tài)的數值；皮層血氧飽和度對硝普化鈉的響應也與血流響應類似。但是，隨著糖尿病病程的發(fā)展，皮層血流響應會顯著下降，而血氧響應則會顯著上升，這表示長期的高血糖環(huán)境使得皮層血管功能發(fā)生異常。

2.3 深皮層血管可視化

在體皮層成像深度可以從側面反應光透明顱窗的透明度，因此研究人員經常會設計相關實驗，探索發(fā)展的顱骨光透明方法對于深組織血管和神經細胞的成像能力。ZHANG Chao 等［54］探究了USOCA 的深組織成像能力，發(fā)現顱骨光透明之前，雙光子熒光顯微鏡僅能獲取深度在120 μm 之內的大血管（直徑67.5 μm）的結構信息，而顱骨透明后則可以對300 μm 深的毛細血管（直徑4.5 μm）進行觀測。

CHEN Yage 等［55］探究了SOCW 與USOCA 相結合獲取深皮層血管信息的能力，他們對顱骨依次進行膠原解離、脫脂、脫鈣和和折射率匹配后，利用三光子熒光顯微鏡達到了850 μm 的成像深度。

LI Dongyu 等［51］探究了VNSOCA 用于近紅外二區(qū)激發(fā)的皮層深組織非線性成像的能力。利用1 560 nm激發(fā)的三倍頻信號，可以獲取650 μm 的深層毛細血管信息，該深度是不進行顱骨光透明時的3 倍，接近與開顱狀態(tài)下的結果（800 μm）。圖4 展示了光透明顱窗用于三光子成像和三倍頻成像的結果。

圖4 光透明顱窗用于深皮層血管非線性成像［51，55］Fig.4 Skull optical clearing window for nonlinear optical imaging of deep cortical vasculature［51，55］

3 活體顱骨光透明用于皮層光操控

現代光學技術不僅可以獲得高分辨率的神經血管圖像，而且可以對大腦皮層進行操控或建立特定的模型?；陲B骨光透明技術的窗口，也可替代開顱窗和磨薄窗，用于皮層光操控。比如，結合光透明顱窗和光動力效應，既可以打開血腦屏障，也可以建立靶向缺血性腦卒中模型；此外，透過光透明顱窗，將飛秒激光聚焦在血管上，可以實現對單根血管的燒蝕，從而建立局部靶向的出血性腦卒中模型。

3.1 光動力效應打開血腦屏障

血腦屏障在中樞神經系統中起著重要作用［79-80］。它能阻止血液中的有害物質進入腦實質，從而維持大腦的正常功能［81］，同樣也會屏蔽許多神經藥物［82］而影響治療。為了特定的藥物遞送，需要暫時打開血腦屏障［83-90］，而利用光動力效應打開血腦屏障的方法得到了廣泛關注［91-92］。

光動力效應是指光敏劑在特定波長的光的照射下會產生單線態(tài)氧、進而產生毒理性的化學反應的過程。顯然，利用光動力效應產生的單線態(tài)氧能夠影響血管內皮細胞功能，使得光照部位周圍的血腦屏障被打開［92］。靶向打開血腦屏障，要求光能夠在不被顱骨散射的情況下到達皮層的目標區(qū)域。即使是非靶向地利用光動力效應打開血腦屏障，如果不對顱骨進行開窗處理，就需要提高光功率，而這往往會造成嚴重的血管性水腫。

ZHANG Chao 等［62］利用光透明顱窗，在不開顱的情況下實現了光動力效應打開血腦屏障。離體實驗結果表明，光透明顱窗建立后，靜脈注射光敏劑和熒光小分子伊文思藍（961 Da），激光照射皮層會引起血管伊文思藍的外滲，而同等劑量下不對顱骨進行透明化處理并未在組織中觀察到伊文思藍。FENG Wei 等［63］同樣在光透明顱窗下利用光動力效應打開血腦屏障，并在活體水平跟蹤了伊文思藍的滲漏過程。除了小分子，他們還證明光透明顱窗結合光動力效應也可以向腦實質中運送右旋糖酐（Rhodamine-dextran-70 kDa，圖5）和脂質體（粒徑100 nm）等大分子。

圖5 光透明顱窗結合光動力效應打開血腦屏障后利用雙光子顯微鏡觀察血管中Rhodamine-dextran 的滲漏情況［62］Fig.5 Skull optical clearing window combined with photodynamic effect for blood brain barrier opening and two-photon fluorescence observing of the leakage of Rhodamine-Dextran in blood vessels［62］

進一步地，ZHANG Chao 等［93］研究了光動力效應不同年齡小鼠（2/4/6/8 周齡）血腦屏障功能影響的差異性。結果表明，年輕小鼠的血腦屏障更易受光動力效應的調控，從而能允許大分子透過。

3.2 建立靶向腦卒中模型

少量的單線態(tài)氧可以影響血管內皮細胞功能，從而打開血腦屏障，而大劑量的單線態(tài)氧可以損傷內皮細胞，造成血小板聚集，形成血栓。因此，利用光動力效應可以建立缺血性腦卒中模型，也稱為光栓模型，被廣泛應用于對缺血性腦卒中的研究當中。傳統的靶向光栓模型需要在開顱的情況下建立，但開顱引發(fā)的顱內壓變化和炎癥，使得大腦在卒中建立之前就處在非正常的環(huán)境當中，從而對觀測結果產生影響。

HU Zhengwu 等［64］將USOCA 與光栓技術相結合，在非開顱的情況下，實現了對大腦皮層血管的靶向栓塞。改變激光照射位置和照射劑量，方便地對栓塞程度和栓塞區(qū)域進行調節(jié)。

在傳統的光栓模型中，栓子的主要成分是血小板［94-95］，但是臨床上栓子的主要成分包括血小板和纖維蛋白［96-97］，并且纖維蛋白才是大部分溶栓藥物的有效靶點。因此，傳統的光栓不適合用于對溶栓藥物的研究。2020年，SUN Yuyo 等［98］提出了一種改進的光栓模型，通過將凝血酶與光敏劑同時注射到小鼠的循環(huán)系統，激光照射后會在血管中形成同時包含血小板和纖維蛋白的栓子，更接近于臨床的情況。

LI Dongyu 等［65］將光透明顱窗與改進的光栓模型相結合，分別對大腦中動脈、大腦中動脈二級分支和大腦中動脈遠端小血管建立了靶向缺血性腦卒中模型，用于研究臨床藥物尿激酶對不同尺寸血管的溶栓治療效果。結果表明，對于小尺寸的遠端小血管，尿激酶溶栓時間最短，但容易形成二次堵塞；對于大尺寸的大腦中動脈，尿激酶溶栓時間長，且溶栓不完全；對于大腦中動脈二級分支，尿激酶能比較好的實現血管再通，并且在一天后仍未出現二次堵塞現象（圖6）。

圖6 光透明顱窗用于建立靶向光栓模型及尿激酶對不同尺寸血管溶栓效果評估［65］Fig.6 Skull optical clearing window for establishment of targeted photothrombosis and evaluation of thrombolytic effect of urokinase for vessels with different sizes［65］

激光損傷模型因其損傷范圍和部位易于控制而被廣泛應用［99-100］。LI Dongyu 等［51］透過光透明顱窗，將近紅外Ⅱ區(qū)的飛秒激光聚焦，實施了對皮層血管的靶向燒蝕，成功地建立了單血管出血性腦卒中模型。實驗表明，在直徑較小和直徑較大的血管上都可以建立該模型。并且，實驗人員利用光透明顱窗和三倍頻顯微鏡，能夠觀測到血管損傷出血、血液擴散到血管損傷位點凝血的全過程。

4 總結與展望

近年發(fā)展的顱骨光透明技術為活體皮層觀測提供了一個無需開顱的光學窗口。十年來，隨著技術的不斷發(fā)展，至今已有多種光透明顱窗可供選擇，它們各有特點。SOCW 的作用機理是，對幼年小鼠顱骨進行膠原解離，對成年小鼠顱骨進行脫鈣，并用甘油進行折射率匹配。它能對皮層淺層區(qū)域實現突觸分辨。但是，由于沒有引入促滲劑，用于成年小鼠時需要預先將顱骨打磨至100 μm 厚。USOCA 通過乙醇和尿素來解離膠原并促進滲透，并用十二烷基苯磺酸鈉進行去脂。它不需要對顱骨進行打磨，可以適用于最老8月齡的小鼠，并能實現5 個月的長期重復透明觀測。將SOCW 和USOCA 結合，同時去除顱骨的羥基磷灰石、膠原蛋白和脂質，可以進一步提高顱骨的透明度，從而實現三光子深皮層血管成像。VNSOCA 將USOCA 中的水替換為重水，大大提高了其對近紅外Ⅱ區(qū)的透過率，同樣能借助三倍頻顯微鏡實現深皮層血管成像。近期，LI Dongyu 等［101］在bioRxiv 公開了一種長效光透明顱窗，能使得小鼠顱骨在數周之內保持透明，以供重復成像。同時，發(fā)表的新型光透明顱窗可以用于清醒動物神經元響應以及光遺傳學研究，進一步拓展了光透明顱窗的適用范圍。

隨著新型光透明顱窗的出現，光聲成像、激光散斑成像、高光譜成像和非線性顯微成像等多種光學成像技術被應用于活體觀察皮層神經元、小膠質細胞、血管結構和功能。借助光透明顱窗，可以動態(tài)觀測神經突觸可塑性、神經元自發(fā)發(fā)放或對刺激的響應、長時程監(jiān)測血管的修剪與新生、表層與深層的血液流速變化等。光學相干層析成像技術是一種非標記的層析成像技術，可以在活體水平觀測組織或血管的三維結構［102］，借助手術顱窗，該技術在腦科學研究中已得到廣泛應用［103］。研究表明，活體皮膚光透明技術可以顯著增強光學相干層析成像在皮膚中的成像質量，有助于獲取皮膚深組織信息。因此，將光透明顱窗技術與光學相干層析成像技術相結合，有潛力在無需標記的情況下獲取皮層深組織的血管結構與功能信息。不僅如此，顱骨光透明技術也為皮層靶向光操控提供了非侵入性的窗口。利用飛秒激光，可以實現神經血管的靶向損傷，結合光動力效應，可以實現血腦屏障的開放或建立光栓模型。

不同的腦科學研究對顱窗提出了不同的要求。比如，神經突觸成像需要高分辨觀測，許多疾病的研究需要長時程跟蹤［66-67］，急性病理模型需要建窗口立即觀測［104-106］，神經功能成像需要在清醒動物上開展［107-108］，跨腦區(qū)研究需要較大的觀測視場［109］。開顱玻璃窗無法實現急性觀測，磨薄顱骨窗無法實現大視場觀測。而光透明顱窗發(fā)展至今，已同時具備了高分辨、大視場、長時程、適用于急性觀測的優(yōu)勢，因而有望在某些傳統顱窗無法勝任的場合（比如急性創(chuàng)傷性腦損傷［110-111］的跨腦區(qū)觀測）提供重要的技術支撐，從而在未來的腦科學研究中大放異彩。

誠然，目前顱骨光透明技術依然有所限制。比如，目前尚未有適用于更大動物（比如大鼠、獼猴等）的活體顱骨光透明方法，這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。一方面，可以篩選折射率更高的試劑用于折射率匹配；另一方面，需要發(fā)展更有效的物理或化學促滲方法，幫助光透明試劑充分作用于更厚的顱骨。另外，相較于開顱玻璃窗和磨薄顱骨窗的平面結構，光透明顱窗維持了顱骨的曲面結構，雖然這使得大腦在被觀測時更接近于生產生理狀態(tài)，但是，曲面的顱窗給成像帶來更多像差，并且會限制小景深成像系統的應用。在未來，可以通過自適應光學技術［112-113］，為基于顱骨光透明的成像進行波前矯正，同時期待大視場、高分辨且同時擁有大焦深的成像技術（比如光場顯微鏡［114］）與光透明顱窗的結合。