劉 萍，柏亞軍，蔣曉虹，夏水利，馬 俊，孫 志，袁世山，姚火春

（1.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095；2.勃林格殷格翰動物保?。ㄖ袊┯邢薰旧虾７止?，上海 201203）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是對全球養(yǎng)豬業(yè)具有嚴重影響的重要豬傳染病。該病于80年代末先后在美國和歐洲出現(xiàn)，隨后在世界范圍內(nèi)迅速傳播，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。PRRS于1995年首次在中國出現(xiàn)并被報道。2006年，我國暴發(fā)了一場由高致病性毒株引起的以高熱、高死亡率為特征的高熱病[2]。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）是引起PRRS的病原體，它的基因組長約為15 kb的單股正鏈RNA。PRRSV基因組有11個開放閱讀框（open reading frames, ORFs）編碼至少14個非結構蛋白和8個結構蛋白。病毒基因組從5'端到3'端，依次為5'UTR、非結構蛋白編碼區(qū)ORF1a和ORF1b、結構蛋白編碼區(qū)ORF2-7、3'UTR及PolyA尾巴。ORF1a和ORF1b約占基因組的三分之二，通過程序性-1核糖體移碼機制翻譯出2個多聚蛋白。經(jīng)過一系列蛋白酶水解，這兩個多聚蛋白可以切割成14個非結構蛋白（nonstructural protein, NSP）。ORF1b下游的基因組區(qū)域編碼病毒結構蛋白，包括ORF2a、ORF2b、ORF3～7以及ORF5a。ORF2～4分別編碼囊膜蛋白GP2、E蛋白、GP3和GP4，ORF5～7分別編碼GP5、ORF5a、M蛋白和N蛋白[3]。PRRSV蛋白往往都具有多種功能，并且病毒的免疫保護相關位點和毒力決定位點都分散在基因組各個蛋白編碼區(qū)中[4]。PRRSV特別容易發(fā)生變異，其基因組的突變率可以達到4.7～9.8×10-2/位點/年，比普遍的RNA病毒突變率高[5]。

減毒活疫苗免疫接種作為防控PRRS最有效的手段被得到廣泛應用，在活疫苗的研制和生產(chǎn)過程中，保持疫苗毒株安全性和免疫原性間的平衡，避免過度致弱是獲得一款合格疫苗的先決條件[6-7]。本研究以HP-PRRSV毒株JX143經(jīng)細胞傳代的三個代次病毒（JXM105、JXM125和JXM135）為研究對象，通過3株傳代毒株對其親本毒株JX143免疫保護效力評價和全基因組序列分析，解析病毒體外傳代與毒株免疫原性間的關聯(lián)。本研究首先用4周齡仔豬的免疫接種試驗和攻毒保護試驗初步評價了3株傳代毒株的安全性和免疫效力，為PRRSV傳代致弱毒株的科學評價提供參考。隨后在對這3個毒株進行全長基因組測序的基礎上，結合動物試驗結果，探討了JX143毒株在細胞傳代過程中獲得的基因突變與病毒免疫原性變化的相關性。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 試驗用豬購自北京某SPF豬場，所有動物于試驗前7 d進場隔離觀察，并進行PRRSV抗原、抗體及其他病原篩查，隨后由統(tǒng)計師完成隨機分組。所有試驗豬均為PRRSV抗原、抗體陰性；主要豬病病原如豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circoviru,PCV2）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、流感病毒（Swine influenza virus, SIV）、副豬嗜血桿菌和豬肺炎支原體等抗原陰性。動物試驗在ABSL2級別的實驗動物設施內(nèi)進行，并在公司IACUC小組審核、批準和監(jiān)督下完成。

1.2 細胞和病毒 用于病毒分離的細胞為非洲綠猴腎傳代細胞MA104。細胞生長液為含10%胎牛血清（FBS，Invitrogen）的MEM（Sigma），維持液為含2%血清的MEM。攻毒毒株為JX143（GenBank登錄號：EF488048），2006年從江西發(fā)生高熱病豬場的發(fā)病豬肺臟分離的HP-PRRSV毒株[8]。3株傳代毒株JXM105、JXM125和JXM135為JX143在細胞上分別傳代105代、125代和135代的病毒，病毒體外傳代過程可參考文獻[10]。

1.3 動物試驗設計 本動物試驗的試驗周期為49 d，包括兩個階段：第一階段為0 d到14 d，為安全性評價試驗；第二階段為28 d（攻毒當天）到49 d，為保護效力評價試驗。如表1所示，65頭4周齡±2 d的仔豬被隨機分為5組。組1、2和3為傳代毒株接種組，試驗開始當天分別肌肉注射接種2 mL病毒上清原液；組4為攻毒對照組；組5為陰性對照組。首先觀察14 d進行安全性評價，組1、2、3、5中分別各有5頭豬在試驗14 d測體重后安樂死進行剖檢和肺臟病變打分。隨后第1～4組中所有剩余豬在試驗28 d進行攻毒，滴鼻接種105.0TCID50/mL的JX143。試驗期間每天測量動物的體溫；觀察動物行為及精神狀態(tài)進行臨床打分。每周采血分離血清一次用于病毒分離和PRRSV抗體檢測。試驗期間如發(fā)生動物死亡，需對其進行病理剖檢，確定死亡原因并進行肺臟病變評分，統(tǒng)計試驗過程中的死亡率。試驗結束時稱量體重后安樂死并剖檢剩余動物，取肺臟觀察進行病變評分。分析攻毒后動物的臨床表現(xiàn)、死亡率、體溫變化、日增重、肺臟病變以及病毒血癥情況，評價傳代毒株對仔豬的保護效果。試驗成立標準：攻毒對照組動物死亡率至少達到40%；陰性對照組動物無由PRRSV導致的發(fā)病或死亡，且在整個試驗期間PRRSV抗原和抗體陰性。PRRS發(fā)病判定標準：體溫≥41℃至少3 d；攻毒后臨床總評分=1且連續(xù)2 d或≥2 d；肺損傷總評分＞5%。符合以上任意兩條，即可判為PRRS發(fā)病。

表1 試驗分組Table1 Groups of animal study

1.4 臨床評分 每天觀察動物的臨床表現(xiàn)包括行為（如斜臥、顫抖、嗜睡等）、呼吸狀態(tài)（如不同程度的咳嗽、打噴嚏、腹式呼吸等）、消化（如嘔吐、腹瀉、食欲改變等）以及其他相關臨床癥狀（如跛足、疝氣、水腫等）。記錄異常臨床癥狀，并對行為、呼吸狀態(tài)和咳嗽三個方面進行評分（參照表2臨床癥狀評分系統(tǒng)）。若試驗期間發(fā)生動物死亡，則進行動物剖檢，記錄剖檢結果，分析可能死亡原因。

表2 臨床癥狀評分系統(tǒng)Table 2 Scoring system of clinical observation

1.5 平均日增重（average daily weight gain, ADWG）計算 試驗前一天對每組動物進行稱重，攻毒當天或者試驗結束時對每組動物稱重，試驗結束時（49 d）或者攻毒當天（28 d）動物體重減去試驗前一天的動物體重除以總觀察天數(shù)則為該動物在觀察期間平均日增重。對于試驗過程中的死亡動物，死亡后立即稱重，計算其ADWG。

1.6 肺臟大體病變觀察及損傷評價 對死亡動物或者觀察期結束的動物進行剖檢，小心取出肺臟，對肺臟各葉進行觀察，記錄各肺葉病變（主要為肺肉變）程度百分比，參照如下計算公式進行肺損傷總評分（肺評分）[11]：肺損傷總評分=右尖葉%×（0.11）+右心葉%×（0.10）+右隔葉%×（0.34）+左尖葉%×（0.05）+ 左心葉%×（0.06）+左隔葉%×（0.29）+附葉%×（0.05）；肺評分≤5%為正常，5%＜肺評分≤20%為輕度病變，20%＜肺評分≤50%為中度病變，＞50%為重度病變。

1.7 病毒分離 通過測定血清中是否存在PRRSV活病毒，記錄試驗過程中動物病毒血癥的動態(tài)變化。具體操作如下：將200 μL血清加入已長滿MA104細胞單層的24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，隨后加入1.0 mL/孔MEM+2% FBS+100 U青鏈霉素雙抗的維持液混合物。放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察細胞病變（cytopathic effect, CPE）情況。出現(xiàn)CPE表明血清樣品為PRRSV陽性，最后統(tǒng)計出每組每個時間點采集的血清樣品中PRRSV分離陽性率。

1.8 PRRSV抗體檢測 用HerdCheck* PRRS X3抗體檢測ELISA試劑盒檢測血清中PRRSV抗體水平。具體操作參照試劑盒說明書，S/P（樣品與陽性對照比值）≥0.4判為PRRSV抗體陽性，S/P值＜0.4判為PRRSV抗體陰性。

1.9 PRRSV全長基因組測序 對JXM105、JXM125和JXM135以及親本毒JX143-P4進行全長測序，序列比對分析細胞傳代過程中出現(xiàn)的基因組序列變化。QIAgen Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，隨后將基因組分成六段經(jīng)一步法RT-PCR（SuperScript?ⅢOne-Step RT-PCR Platinum?TaqHiFi）進行擴增（引物見表3，擴增反應體系和條件參照試劑盒說明書）。純化PCR擴增產(chǎn)物并克隆送測序。用Vector NTI軟件拼接測序結果獲得全長病毒基因組，進行序列比對。

表3 PRRSV全長基因組測序引物Table 3 Primers for PRRSV full-length amplification

2 結果

2.1 攻毒前JXM105、JXM125和JXM135免疫動物的各項指標結果 0～14 d所有傳代毒株接種組的豬體溫都在正常范圍內(nèi)，和陰性對照組比無顯著差異（圖1A）。并且所有傳代毒株接種組的豬均無異常臨床表現(xiàn)，各項評分均為0分。如圖1B所示，免疫后14 d內(nèi)，3組傳代毒株接種動物的體重增長正常，與陰性對照組比無顯著差異（P＞0.05）。試驗第14 d，從3組免疫接種組和陰性對照組中各隨機挑選5頭豬只進行剖檢，取肺臟觀察并評分。如圖1C所示，3組傳代毒株接種組均分別有1頭豬肺臟出現(xiàn)輕度病變（5%＜肺評分≤20%），這3頭動物在整個試驗期間并未表現(xiàn)出任何異常臨床癥狀，各免疫組的平均肺評分均＜5%。綜合上述，攻毒前體溫變化、臨床評分、平均日增重和肺臟評分結果表明，JX143在細胞上傳代105代后已經(jīng)致弱，所有傳代病毒在4周齡小豬上安全無致病性。

圖1 免疫后0～14 d各項指標結果Fig.1 Results of different indicators during 0-14 d post vaccination

2.2 JXM105、JXM125和JXM135免疫保護效力評價結果 免疫后第28 d，3個免疫組（每組各剩余10頭動物）和攻毒對照組各滴鼻接種2 mL 105.0TCID50/mL含量的JX143，隨后按照試驗方案觀察動物體溫變化、臨床評分、死亡率等，并在攻毒后第21 d，安樂死所有剩余動物并剖檢，進行肺臟病變評分。

2.2.1 體溫變化 攻毒前所有豬的體溫都在正常范圍內(nèi)，攻毒對照組從攻毒后第6 d出現(xiàn)高熱，平均體溫開始超過41℃，隨后兩天體溫略微下降，攻毒后第9 d又出現(xiàn)高熱并持續(xù)3 d。JXM105組攻毒后第3 d平均體溫略有升高，之后很快回落至正常水平且在正常范圍內(nèi)波動，與陰性對照組無顯著差異。JXM125組攻毒后第3 d平均體溫開始升高，攻毒后第5 d平均體溫超過40℃，且持續(xù)至試驗結束。該組有6頭動物體溫出現(xiàn)超過41℃，其中3頭豬體溫高于41℃超過3 d。JXM135組與JXM125組趨勢基本一致，攻毒后第3 d開始平均體溫超過40℃，9頭動物都出現(xiàn)體溫超過41℃，其中有2頭動物體溫高于41℃超過3 d，陰性對照組在整個試驗期間，平均體溫都在正常范圍（圖2）。因此，對比各組動物攻毒后體溫變化，JXM105保護效力要好于JXM125和JXM135。

圖2 攻毒后體溫變化Fig.2 Rectal temperature curve post challenge

2.2.2 臨床評分和死亡率 攻毒后，JXM105組有兩頭豬攻毒后出現(xiàn)輕度行為異常，主要表現(xiàn)為輕度精神沉郁，其余動物臨床表現(xiàn)無異常。未表現(xiàn)出PRRS臨床癥狀，呼吸和咳嗽評分均為0分。JXM125和JXM135組部分動物表現(xiàn)出呼吸困難及嚴重的斜臥。攻毒對照組攻毒后所有動物均表現(xiàn)出不同程度的PRRS典型臨床癥狀。攻毒后各組動物存活率結果如圖3所示，攻毒對照組從攻毒后第13 d開始陸續(xù)共有4頭豬死亡，死亡率40%；而3組傳代毒株組和陰性對照組無動物死亡（圖3）。

圖3 攻毒后各組臨床評分和存活率Fig.3 Clinical scores and survival rate of groups post challenge

2.2.3 攻毒后平均日增重結果 攻毒后，除了攻毒對照組出現(xiàn)負增長，其他免疫組均有體重增長（圖4A）。JXM105的平均日增重略高于其他兩組免疫組，但3組免疫組和空白對照組間無顯著差異。所有免疫組的ADWG均極顯著高于攻毒對照組（P≤0.01）。

2.2.4 肺損傷評價 JXM105組在攻毒后平均肺臟病變評分為3.63%，其中有3頭豬的評分超過5%，表現(xiàn)輕度病變；JXM125組平均肺臟病變評分為6.88%，其中有3頭豬的評分超過5%，1頭豬的評分超過20%；JXM135組攻毒后平均肺臟病變評分為3.35%，其中有2頭豬的評分超過5%。而攻毒對照組的平均肺臟病變評分為56.28%，該組所有動物都出現(xiàn)不同程度的肺臟病變。陰性對照組所有豬剖檢后都未發(fā)現(xiàn)肺臟病變（圖4B）。

圖4 攻毒后平均日增重和肺臟病變評分Fig.4 ADWG and lung lesion score of groups post challenge

綜合上述結果和PRRS發(fā)病判定標準，可以得出JXM105組攻毒后無動物發(fā)病和死亡；JXM125和JXM135組攻毒后均無動物死亡，但是表現(xiàn)出顯著的PRRS臨床癥狀，發(fā)病率均為20%（JXM125組發(fā)病動物編號為#911、#916；JXM135組發(fā)病動物編號為#979、#984）。由此可見，JXM105可以對JX143攻毒提供完全保護，免疫豬攻毒后無PRRS發(fā)??；而JXM125和JXM135只能提供部分保護，攻毒后仍有部分豬發(fā)病。

2.3 病毒血癥變化 所有組在免疫當天PRRSV抗原均為陰性，且陰性對照組整個試驗期間病毒分離均為陰性。JXM105組免疫后第7 d所有豬血清病毒分離陽性直至第21 d，且攻毒當天仍有90%動物為病毒分離陽性。攻毒后該組動物病毒分離陽性率開始下降，且在試驗最后一天病毒血癥消失。JXM125組攻毒后第7 d 90%動物血清病毒分離陽性，隨后陽性率緩慢下降，攻毒當天70%動物病毒分離為陽性。攻毒后趨勢與JXM105組類似。JXM135組免疫后第7 d所有動物血清病毒分離陽性，隨后病毒分離陽性率下降，攻毒當天陽性率為60%。攻毒后該組血清分離陽性率略有升高（70%），一周后下降至10%。攻毒對照組在攻毒前所有動物為病毒分離陰性，攻毒后一周所有動物出現(xiàn)病毒血癥，隨后病毒血癥逐漸消退，至試驗結束仍有33.3%（2/6）動物有病毒血癥（圖5）?？偟膩碚f，三個傳代病毒都可以在豬體有效復制，免疫后都可以降低攻毒后病毒血癥水平和持續(xù)時間。JXM105在體內(nèi)復制效率略高于另外兩個病毒。

圖5 免疫及攻毒后病毒分離陽性率變化Fig.5 Viremia dynamic post vaccination and challenge

2.4 抗體水平變化 所有動物在免疫當天PRRSV抗體均為陰性，且陰性對照組整個試驗期間PRRSV抗體均為陰性。3組免疫組在免疫后第14 d開始出現(xiàn)抗體轉陽，隨后抗體水平緩慢升高，攻毒后各組抗體水平基本維持穩(wěn)定不變。3組免疫組的抗體動態(tài)變化趨勢基本一致，各組總體抗體水平表現(xiàn)為JXM105組＞JXM125組＞JXM135組。通過觀察個體表現(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，JXM125組和JXM135組中攻毒后表現(xiàn)出明顯PRRS發(fā)病的動物抗體轉陽都出現(xiàn)較晚（21 d轉陽），該現(xiàn)象也提示病毒的免疫原性降低導致其不能在攻毒后對這些動物提供完全保護。攻毒對照組攻毒前所有動物均為PRRSV抗體陰性，攻毒后一周所有動物抗體轉陽，隨后抗體水平顯著升高，在試驗最后一天又出現(xiàn)下降（圖6）。由此可見，3個傳代毒株接種后，均可刺激機體產(chǎn)生高水平的抗PRRSV N蛋白抗體。與抗原檢測結果一致，JXM105在動物體內(nèi)復制效率比另兩個高代次病毒更高，免疫原性更強可以刺激豬體產(chǎn)生更高水平的抗體。

圖6 免疫及攻毒后抗體動態(tài)變化Fig.6 Antibody dynamic post vaccination and challenge

2.5 病毒基因組序列與病毒蛋白序列比對分析 對JX143-P4、JXM105、JXM125和JXM135進行全長基因組序列測定，比較病毒的全基因組中各個非結構蛋白和結構蛋白的核苷酸和氨基酸差異，旨在追蹤病毒在細胞傳代過程中基因組序列的變化規(guī)律，為研究PRRSV細胞傳代弱化的相關分子機制提供參考。與野毒相比，JXM105共含有47處突變，其中有23處導致氨基酸突變（表4），分別位于nsp1、nsp2、nsp4、nsp5、nsp7、nsp9、nsp10、ORF3、ORF4、ORF5a和ORF6，1處位于nsp2的88個連續(xù)氨基酸缺失，以及位于GP2-246位色氨酸突變?yōu)榻K止密碼子導致GP2截斷11個氨基酸。而繼續(xù)傳代至JXM125，增加了5處核苷酸突變，其中僅1處氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺位于GP3-133（S133N）。從JXM125繼續(xù)傳代至JXM135，增加了3處核苷酸突變，其中僅有1處為位于nsp7β的氨基酸突變由纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

表4 JX143傳代病毒與野毒P4代病毒全長序列差異分析Table 4 Sequence analysis of JX143 passaged viruses and parental strain JX143-P4

3 討論

本文通過安全性和免疫保護試驗證明細胞傳代病毒JXM105對仔豬無致病力，且對同源攻毒提供完全保護，但是更高代次的毒株JXM125和JXM135只能提供部分保護。表明隨著體外傳代次數(shù)增多，JXM在豬體上有過度致弱趨勢，導致其免疫保護效

力降低。對HP-PRRSV毒株JXA1的研究也有類似結果，JXA1傳代至80代致弱，而至110～170代時出現(xiàn)過度致弱，不能對同源攻毒提供完全保護[12]。

為了探尋JX143傳代致弱與免疫原性變化的分子機制，本研究對傳代病毒的全基因組序列進行分析。與此前報道的JXM100（JX143傳代100次的病毒）基因組序列相比，JXM105的基因組序列存在幾處差異[13]。本研究中的JXM105為此前報道中JXM80（MARC-145細胞傳代）在MA104細胞上繼續(xù)傳代后獲得，雖然MA104和MARC-145同為非洲綠猴腎細胞，但來源于不同細胞克隆，傳代細胞的改變可能是導致兩個相近代次病毒全基因序列差異的主要原因。有研究表明，JXM105在nsp2中連續(xù)88個氨基酸缺失與病毒在MARC145和PAM細胞上的復制效率相關[14]。對JXwn06的最新研究也表明，nsp2高變區(qū)與病毒在PAM上的細胞嗜性相關[15]。在這88個氨基酸缺失區(qū)域中存在一處早期研究鑒定出的B細胞表位（D385ELKDQMEED394）[16]，該表位的缺失對JXM的免疫保護效力無影響，這可以為未來開發(fā)標記疫苗提供一處靶點。重新傳代后JXM毒株的GP2出現(xiàn)了11個氨基酸截短，表明GP2碳端的11個氨基酸與病毒復制無關。兩株2013年從流產(chǎn)母豬分離的PRRSV毒株Henan-A10和Henan-A11也在GP2的胞內(nèi)區(qū)有10個氨基酸缺失，隨后在HuN4-F112感染性克隆的研究也證實了這10個氨基酸與病毒復制無關[17]。由此也可推測，JX143上GP2截短與PRRSV的傳代致弱無關。

與其他HP-PRRSV毒株（如JXA1和HunN4）傳代致弱的演變分析比較，JX143致弱的演變軌跡大多數(shù)都不一致，僅有幾處位于GP3的突變位點一致（GP3-79、224、225）。但這些毒株傳代后大部分突變均位于非結構蛋白編碼區(qū)，這表明PRRSV的非結構蛋白在毒力變化中具有重要作用，且PRRSV傳代致弱具有毒株特異性[18-19]。JX143傳代125代后出現(xiàn)過度致弱，序列分析結果顯示JXM125與JXM105相較僅存在1處氨基酸突變位于GP3（S133N），JXM135與JXM105相較除了GP3處的氨基酸突變外，還有一處位于nsp7β的氨基酸突變V27I，推測GP3處的S133N突變與過度致弱相關性更強。GP3是一個重要的PRRSV糖蛋白，已有研究證明GP3與GP2a和GP4形成多聚蛋白與CD163結合協(xié)助病毒進入細胞[20]。GP3上還存在很多重要的N-糖基化位點與病毒的免疫原性相關[21]。GP3第133位氨基酸在PRRSV毒株中非常保守，JXM125和JXM135基因組上該位點的絲氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺，該突變可能可以形成一個新的N-糖基化位點從而引起高代次病毒的免疫保護效力下降。JXM125傳代后獲得的突變位點（除GP3-79）與JXA1研究中鑒定出的過度致弱相關點完全不一致：JXA1中有8處氨基酸突變與過度致弱相關，分別位于nsp1β、nsp2、nsp3、GP2、E、GP4、GP5和ORF5a；另有10處氨基酸突變可能與過度致弱相關，分別位于nsp2、GP3、GP4和N蛋白[12]。這也再次表明PRRSV病毒的進化具有毒株特異性。除了上述氨基酸突變外，JXM105繼續(xù)傳代至免疫保護效力降低的JXM125后，JXM125的基因組還存在幾處同義突變。有研究表明大量的同義突變也會影響病毒的生物學特征[22]。PRRSV在復制轉錄過程中有特定二級結構的轉錄調控序列存在，無意義突變還可以通過影響RNA二級結構調節(jié)病毒轉錄而影響病毒復[23]。但以上鑒定出的同義突變是否與過度致弱相關還有待驗證。

JX143傳代致弱后全基因組序列和免疫原性變化的數(shù)據(jù)顯示：該毒株傳代至80代以后全基因組序列突變趨于穩(wěn)定，JXM87的動物試驗結果顯示其在仔豬上具有良好的免疫效力（未發(fā)表數(shù)據(jù)）；JXM87與JXM105之間存在8處位于非結構蛋白編碼區(qū)的核苷酸突變（其中4處導致氨基酸突變，未發(fā)表數(shù)據(jù)），但二者均表現(xiàn)出良好的免疫效力；JXM105與JXM125之間也僅存在5處核苷酸突變（1處導致氨基酸突變），但二者的免疫效力卻存在顯著差異。這表明隨著病毒體外傳代，病毒適應細胞生長的突變會逐漸累積增加，如果這些突變數(shù)量控制在一定范圍內(nèi)，則對病毒在宿主上的免疫原性無顯著影響；當這些突變增加到一定程度時則會影響病毒在宿主上的免疫原性。

綜上所述，JX143傳代105次后的病毒對仔豬無致病力，繼續(xù)傳代至P125則出現(xiàn)免疫原性降低導致過度致弱。通過對在仔豬上有不同免疫保護效力毒株JXM105、JXM125、JXM135的序列比對鑒定出一些與病毒致弱和過度致弱相關的位點，這些位點的生物學功能還需要通過反向遺傳學手段進一步驗證和解讀。關于不同PRRSV毒株的體外傳代致弱的研究可以為闡明PRRSV致病機制研究奠定基礎。