周 娜，譚梅英

（1.廣州市司法局戒毒醫(yī)院，廣東廣州 510435；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東廣州 510095）

枳殼性微寒，味酸、苦，具有理氣寬中、行滯消脹之功效，常用于胸脅氣滯、脹滿(mǎn)疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂；該藥味常見(jiàn)于消積化食、健胃除痞類(lèi)方劑或中藥制劑，也可單用水、醇提取物[1-4]。研究表明，枳殼上述功效來(lái)自其所含增進(jìn)胃腸動(dòng)力、抗炎、助消化和加強(qiáng)血流再灌注等藥理活性的成分，其中以柚皮苷最為顯著。該成分在蕓香科植物的果實(shí)中含量較大，且水溶性較好，因此可作為枳殼水提物質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分[5-6]。

為優(yōu)化中藥提取工藝，常采用單因素考察、星點(diǎn)設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)等方法進(jìn)行優(yōu)化，中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面法是一種效率較高、考察較為全面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究表明該方法能夠在使用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)的情況下得到最優(yōu)工藝參數(shù)[7]。因此，本文擬采用該方法對(duì)枳殼水提物制備的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與材料

2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），BJH300P全自動(dòng)煎藥?kù)遥ㄌ祀H生活電器有限公司），Mettler-Toledo電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201815，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；枳殼飲片（廣州至信藥業(yè)股份有限公司）；色譜純乙腈、乙醇（德國(guó)Merck公司）；超純水（Watsons公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 中心組合設(shè)計(jì)及效應(yīng)面建立 工藝參數(shù)選擇提取時(shí)間、提取循環(huán)、水量三個(gè)，極值范圍分別為15～90min、1～3次、10～40倍；考察指標(biāo)為柚皮苷含量。上述參數(shù)輸入Design Expert軟件中，選擇中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面法，由軟件給出20組試驗(yàn)參數(shù)（含6組中心點(diǎn)參數(shù)，見(jiàn)表1），記錄上述工藝參數(shù)并制備樣品、測(cè)定。

表1 中心組合設(shè)計(jì)參數(shù)和結(jié)果表（n=20）

2.2 樣品制備 根據(jù)“2.1”所給出各組工藝參數(shù)，根據(jù)BJH300P全自動(dòng)煎藥?kù)覍?shí)際情況進(jìn)行設(shè)定。取枳殼飲片20g，精密稱(chēng)定，按前述工藝參數(shù)制備水提液，合并煎液，紗布濾過(guò)后濃縮至≤200mL，所得濃縮液轉(zhuǎn)移至250mL量瓶中，加純水至刻度。搖勻后精密吸取所得溶液1mL，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備 取柚皮苷對(duì)照品粉末，精密稱(chēng)定，取約5mg，置于10mL量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（濃度0.5mg/mL）。

2.4 含量測(cè)定方法 含量測(cè)定使用高效液相色譜法，色譜條件為：Waters Xbridge C18色譜柱（柱長(zhǎng)25cm，直徑0.46mm，粒徑5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（20:80），流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)283nm，柱溫30℃。所得供試品和對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 供試品和對(duì)照品（50μg/mL）色譜圖

2.5 含量測(cè)定方法驗(yàn)證

2.5.1 線性和范圍 取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，加乙醇逐級(jí)稀釋?zhuān)频脻舛葹?00、100、50、10、5mg/mL的對(duì)照品溶液，吸取上述溶液，連同對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，由低濃度至高濃度依次注入HPLC中分析，記錄每次分析所得色譜圖中柚皮苷的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)y，濃度為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得回歸方程為y=17247x-57540（r2=0.9993）。上述結(jié)果表明，含量測(cè)定方法在測(cè)定濃度為5～500μg/mL的柚皮苷時(shí)結(jié)果呈線性關(guān)系，滿(mǎn)足準(zhǔn)確測(cè)定的要求。

2.5.2 精密度 取供試品溶液（最優(yōu)工藝參數(shù)批次，下同），使用“2.4”項(xiàng)下方法重復(fù)測(cè)定6次，記錄每次分析所得色譜圖中柚皮苷的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果得RSD為1.31%，表明方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性 取供試品溶液，放置于HPLC的自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別在放入后0、2、4、6、8、12h使用“2.4”項(xiàng)下方法重復(fù)測(cè)定6次，記錄每次分析所得色譜圖中柚皮苷的峰面積，計(jì)算含量和含量的RSD。結(jié)果顯示RSD為1.08%，表明方法所制樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性 使用“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，使用“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄每次分析所得色譜圖中柚皮苷的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果得RSD為1.04%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率 取濃縮定容后所得柚皮苷水提液，精密吸取0.5mL，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，按表2濃度加入柚皮苷對(duì)照品溶液，再加乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份。吸取上述溶液，使用“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄每次分析所得色譜圖中柚皮苷的峰面積，計(jì)算含量、回收率和回收率的RSD。結(jié)果得平均回收率為100.09%、RSD為2.77%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收率測(cè)定

2.5.6 樣品測(cè)定和數(shù)據(jù)分析 取“2.2”項(xiàng)下按照“2.1”工藝參數(shù)所制得的樣品溶液，用“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄每次分析所得色譜圖中柚皮苷的峰面積，計(jì)算含量，所得柚皮苷含量代入Design Expert軟件中進(jìn)行分析。根據(jù)20批樣品測(cè)定結(jié)果可知（見(jiàn)圖2），當(dāng)提取時(shí)間為45min、提取循環(huán)為2次、水量為枳殼飲片體積30倍時(shí)，水提物中柚皮苷含量為1.6768mg/mL（平均），為最優(yōu)值。最高值為提取時(shí)間90min（其余與最優(yōu)值同），但綜合考慮能耗、效率等因素，并未被軟件推薦為最優(yōu)參數(shù)。上述結(jié)果軟件預(yù)測(cè)值相符，表明中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面法能夠高效、準(zhǔn)確地篩選出枳殼水提液的最優(yōu)提取工藝。

圖2 中心組合設(shè)計(jì)效應(yīng)面圖（n=20）

3 討論

根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)所得樣品實(shí)測(cè)結(jié)果可知，當(dāng)本研究所涉及的三個(gè)參數(shù)均為最大時(shí)，所得水提物中柚皮苷的含量最高。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因主要是柚皮苷較為穩(wěn)定，不易受熱分解或因與水長(zhǎng)期接觸而發(fā)生明顯的水解反應(yīng)；同時(shí)，枳殼中柚皮苷含量較大，因此增加提取時(shí)間、提取溶劑和提取次數(shù)均能夠增加得率。上述結(jié)果表明，本研究選擇柚皮苷作為工藝參數(shù)優(yōu)化的指標(biāo)成分，具有較好的科學(xué)性和適宜性，且柚皮苷所具有的藥理活性，也能夠較為恰當(dāng)?shù)胤从宠讱さ墓πе髦巍?/p>

但與此同時(shí)，選擇各考察參數(shù)時(shí)，不能單純考慮柚皮苷的產(chǎn)率。這是由于當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)45min后，提取液中柚皮苷的含量增加并不明顯，同樣的情況也發(fā)生在提取循環(huán)從2次增加到3次時(shí)，以及提取溶劑從30倍增加至40倍時(shí)。即增加的產(chǎn)物與所消耗的時(shí)間、能源、溶劑等成本不成比例，反映此時(shí)效費(fèi)比顯著下降，繼續(xù)增加相關(guān)參數(shù)并無(wú)意義。