木姜葉柯種質(zhì)資源評價及其黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控研究進展

邱小燕, 肖深根, 李自強, 王依清, 陳陽峰, 向助文

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院, 湖南長沙 410128；2.湖南瑤茶工程技術研究中心, 湖南溆浦 419300；3.湖南翱康生物科技有限公司, 湖南溆浦 419300；4.懷化學院生物與食品工程學院, 湖南懷化 418000）

木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）俗稱“甜茶”, 長江以南各省區(qū)均有分布, 其中湖南、江西等省資源尤為豐富[1]。《全國中草藥匯編》記載“木姜葉柯可用于防治癰疽惡瘡、皮膚瘙癢和溫熱痢疾等癥狀”[2]。民間以木姜葉柯嫩葉作為甜茶飲用已有悠久的歷史, 其味甘甜持久、香氣濃郁?，F(xiàn)代藥理學研究表明, 木姜葉柯中的主要有效成分為黃酮物質(zhì), 具有降三高、抗氧化等作用[3-6]。木姜葉柯既是我國民族珍貴藥材, 又被批準為色素添加劑和新食品原料資源, 兼具藥、茶、糖的功能, 極具開發(fā)價值。近年來, 隨著木姜葉柯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展, 由于野生木姜葉柯是高大的喬木, 很多地方都以砍伐野生木姜葉柯來獲取嫩葉。因此, 木姜葉柯野生分布面積逐年降低, 造成木姜葉柯種群和個體數(shù)減少, 其種內(nèi)遺傳多樣性丟失, 最終不利于植物的生存；同時, 黃酮物質(zhì)又是木姜葉柯葉片提取物的主要活性成分, 因此建立木姜葉柯種質(zhì)資源圃, 篩選優(yōu)異種質(zhì), 探明木姜葉柯黃酮物質(zhì)的生物合成調(diào)控機制極為重要。綜述了木姜葉柯種質(zhì)資源及其黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控的研究進展, 展望了木姜葉柯未來研究的方向。

1 木姜葉柯種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀

1.1 2種“甜茶”的基源比較

木姜葉柯和廣西甜茶都俗稱“甜茶”, 民間飲用歷史悠久, 都是高甜、低熱、無毒的天然甜味劑, 具有解渴生津、防治糖尿病和降血壓等功效, 容易混淆, 雖然都俗稱“甜茶”, 但是它們的區(qū)別非常大。木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）是殼斗科柯屬的常綠喬木, 葉片為革制、互生, 幼芽紫褐色、披短絨毛, 成熟葉皮為灰褐色、葉片呈卵狀、基部楔形、先端漸尖, 主要含黃酮類、三萜類及其他化合物, 其總黃酮含量高達10%, 主要集中在葉部, 其甜味成分主要是二氫查耳酮類[7-8]。廣西甜茶（Rubus Suavissimuss S.Lee）是薔薇科懸鉤子屬多年生落葉灌木, 葉片和枝條稍軟, 幼苗紫紅色, 成熟葉為綠色, 先端彎垂[9], 主要含甜茶素、黃酮、茶多酚等活性成分, 其主要甜味成分是甜茶素, 含量達1.5%, 嫩葉中總黃酮為0.35%, 老葉中總黃酮為0.022%, 其黃酮物質(zhì)主要是槲皮素和山奈酚[10]。

1.2 不同采收期木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量變化規(guī)律

木姜葉柯在不同采收期的黃酮物質(zhì)含量差異較大。劉燦明等人[11]研究了湖南漣源野生木姜葉柯總黃酮含量在3月份為11.46%, 4月份為14.60%, 5月份為9.60%, 4月份的總黃酮含量最高。廖曉峰等人[12]測定了江西武夷山的木姜葉柯總黃酮含量在4月份高達22.2%。李勝華等人[13]對湖南芷江的木姜葉柯嫩葉中的總黃酮研究表明, 從4—12月呈先上升后下降的趨勢, 夏末初秋即（6-9）月的總黃酮含量最高達9.87%, 10月份開始降低, 12月份最低。徐蘭芳[14]研究了江西吉安木姜葉柯老葉中總黃酮含量的變化規(guī)律, 在8和9月份達到峰值25.51%和23.45%, 在2月和4月分別有2個小峰值, 為16.08%和14.82%。游曉瑩[15]研究木姜葉柯嫩葉中的根皮苷和三葉苷在不同采收期的變化規(guī)律, 根皮苷含量在7月份達到最高峰（5.7%）, 而后下降至9月達到最低谷（2.27%）, 然后又在11月達到一個次高峰（5.6%）, 然后呈下降的趨勢, 三葉苷則在7月含量最高達4.5%, 5, 6, 7月均檢測不到三葉苷, 其他月份的含量均在1%以下。徐蘭芳[14]對江西吉安的木姜葉柯老葉中的根皮苷和三葉苷在不同采收期的變化規(guī)律, 根皮苷在2, 4, 7, 10月出現(xiàn)峰值, 分別為7.33%, 8.07%, 7.52%和8.17%。三葉苷則在3, 6, 10月達到峰值分別為0.82%, 0.98%和1.19%。綜上所述, 若以總黃酮含量作為采收質(zhì)量評價指標, 嫩葉宜在4月和6—9月采收, 老葉宜在2月和6—10月采收；若以根皮苷含量作為采收質(zhì)量評價指標, 嫩葉宜在7月采收, 老葉宜在2, 4, 7, 10月采收；若以三葉苷含量作為采收質(zhì)量評價指標, 嫩葉宜在7月采收, 老葉宜在3, 6, 10月采收。前期研究表明, 不同采收期黃酮物質(zhì)含量差異較大；然而, 木姜葉柯不同采收期黃酮物質(zhì)合成累積差異的機制尚未探明, 需要進一步研究。

1.3 不同種源木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量比較

不同種源對木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量的影響也較大。徐蘭芳[14]在5月份比較廣東廣州和廣東惠州2個不同種源的根皮苷和三葉苷含量, 結果表明惠州的根皮苷含量較低, 三葉苷則高達6.06%, 廣州的三葉苷含量較低, 根皮苷含量則高達4.27%。何平等人[16]對江西分宜、四川米易、湖南溆浦、重慶北碚和廣西田林5個種源木姜葉柯葉片的黃酮物質(zhì)進行了比較, 存在極顯著差異, 其中總黃酮含量最高的資源為江西分宜（8.16%）, 根皮苷含量最高的資源為重慶北碚（6.44%）, 三葉苷含量最高的資源為四川米易（2.99%）。王坤等人[17]對6個省份的30個木姜葉柯種源進行了老葉根皮苷和嫩葉三葉苷含量的測定, 其中根皮苷含量最高的資源為廣西, 老葉中高達16.29%, 三葉苷含量最高的資源為重慶, 嫩葉中高達31.41%。上述結果表明, 不同種源的木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量具有極大的差異, 但是上述研究中的材料均取自種源地, 并沒有將資源移至同一個資源圃, 黃酮物質(zhì)的含量受到環(huán)境因素的影響較大。因此, 建立木姜葉柯種質(zhì)資源圃, 消除環(huán)境因素的影響, 在當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境下, 根據(jù)不同需求篩選優(yōu)異種質(zhì)顯得尤為重要。

1.4 不同種源木姜葉柯遺傳多樣性分析

木姜葉柯遺傳基因的種源變異是影響木姜葉柯黃酮物質(zhì)含量的關鍵因素。Cheng J等人[18]利用11個SSR分子標記研究了浙江、重慶、廣西、江西、湖南和福建6個省份共11個種群的遺傳變異和種群結構, 結果表明大部分變異發(fā)生在種群內(nèi), 木姜葉柯種群間沒有發(fā)生較大的遺傳變異, 遺傳距離可能與地形相關, 與地理距離之間沒有相關性。綜上所述, 前期的研究還缺乏云貴高原、陜西和福建等典型高原地形、高緯度、低海拔山地等具有代表性的種質(zhì)資源, 且沒有進行木姜葉柯的有效成分與遺傳多樣性的關聯(lián)分析, 同時也沒有研究木姜葉柯的系統(tǒng)進化, 這些在后續(xù)的科研工作中都值得研究。

2 木姜葉柯黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控研究進展

2.1 木姜葉柯植物中黃酮物質(zhì)生物合成途徑及關鍵酶

基因是影響木姜葉柯生理機制的內(nèi)在遺傳因素, 黃酮類化合物的生物合成是一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡, 涉及到多個關鍵基因和關鍵酶。有研究表明, 植物體內(nèi)黃酮類化合物的生物合成基本途徑（見圖1[19]）, 首先由乙酰CoA合成丙二酰CoA, 再由莽草酸途徑獲得對-香豆酰CoA, 對-二氫香豆酰CoA由對-香豆酰CoA在還原酶催化作用下得到, 根皮素由對-二氫香豆酰CoA與丙二酰CoA在查爾酮合成酶的催化作用下得到, 根皮苷由根皮素在糖基轉移酶的催化作用得到[20]。宋菊等人[21]對木姜葉柯進行了轉錄組測序并挖掘到黃酮合成相關基因28條, 除了查爾酮異構酶和合成酶等關鍵酶基因, 還有苯丙氧酸解氨酶、乙酰輔酶A羧化酶、花青素合成酶等重要酶基因。尹峰等人[22]克隆了木姜葉柯黃酮3-羥化酶基因, qRT-PCR驗證表明, 木姜葉柯黃酮3-羧化酶基因在根、莖、葉柄和葉片中的表達量差異顯著, 其中葉片表達量最高, 是最低表達根部的6.7573倍。林麗梅等人[23]克隆了木姜葉柯的查爾酮異構酶基因, 該基因在木姜葉柯的葉片、葉柄、莖和根中的表達量差異顯著, 其中葉片相對表達量最高, 是最低表達部根的9.75倍。邢朝斌等人[24]克隆了木姜葉柯4-香豆酸輔酶A-連接酶基因木姜葉柯4-香豆酸輔酶A-連接酶基因在除根以外的各個器官中均表達, 且根皮苷含量與該酶的表達量呈顯著正相關, 在葉片中表達最高。朱金麗等人[25]克隆了木姜葉柯的無色花青素還原酶基因, 該基因的表達量與木姜葉柯根皮苷含量呈顯著正相關, 無色花青素還原酶基因的表達可以促進根皮苷的積累。綜上, 木姜葉柯黃酮類化合物的生物合成受到多種基因的共同調(diào)控。因此, 更加深入地研究木姜葉柯黃酮生物合成基因調(diào)控網(wǎng)絡, 構建出完整的木姜葉柯黃酮代謝調(diào)控網(wǎng)絡對提高木姜葉柯品質(zhì)及實現(xiàn)木姜葉柯黃酮的大量合成具有重要意義。

植物黃酮物質(zhì)生物合成基本途徑[18]見圖1。

圖1 植物黃酮物質(zhì)生物合成基本途徑

2.2 光照對木姜葉柯黃酮物質(zhì)生物合成調(diào)控的影響

黃酮物質(zhì)是木姜葉柯是適應環(huán)境因子的產(chǎn)物, 在一定的環(huán)境脅迫下被誘導表達黃酮合成的相關酶基因, 關鍵酶催化黃酮物質(zhì)的合成[26]。光照會影響光合作用和信號轉導, 也會影響黃酮物質(zhì)的合成[27]。伍賢進[28]研究表明, 遮光40%的葉片中黃酮含量最高, 遮光80%的葉片中黃酮含量最低, 說明適當?shù)恼诠庥欣谀窘~柯葉中總黃酮的積累, 但遮光太多, 總黃酮的積累又受到一定的抑制。隨著遮光時間的持續(xù), 葉片中黃酮的含量由逐漸升高而轉變?yōu)橹鸩较陆? 在遮光60 d時各處理中葉中總黃酮的含量均達到最高。光質(zhì)對植物的各項生命活動至關重要, 不同光質(zhì)可觸發(fā)植物體內(nèi)不同的光受體來感知, 以此來調(diào)控黃酮物質(zhì)的合成與積累。張妍彤[29]研究表明, 在紅光和藍光培養(yǎng)條件下, 木姜葉柯根皮苷含量均降低, 給與綠光刺激可促進根皮苷的積累, 在低強度（1000 lx）處理時, 根皮苷含量增加, 在高強度（2000 lx和3000 lx）處理時降低, 日光照8 h和11 h培養(yǎng)時根皮苷含量降低, 而日光照14 h培養(yǎng)時根皮苷含量增加, 可以提高3.49%, 表明適當延長綠光光照時間有提高根皮苷含量的可能。因此, 可以考慮采用綠光對木姜葉柯進行低光強長時間的微脅迫處理, 來誘導黃酮物質(zhì)的積累。一般短時間內(nèi)微脅迫處理難以達到顯著效果, 是否可以通過采用短期的強綠光脅迫處理來模擬放大前期微脅迫, 值得研究。

3 結語

木姜葉柯作為新資源食品原料, 有著廣闊的市場前景。在木姜葉柯種質(zhì)資源及黃酮物質(zhì)生物合成方面仍然需要深入研究, 主要有：①木姜葉柯黃酮物質(zhì)種源遺傳變異研究需要更加全面；②木姜葉柯黃酮物質(zhì)合成關鍵酶基因需要進一步挖掘；③栽培措施對木姜葉柯黃酮物質(zhì)合成的影響需進一步研究。總之, 需要多角度對木姜葉柯進行綜合和可持續(xù)發(fā)展的研究, 推動木姜葉柯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。