閆建英，張 智，馮麗榮，湯華京，楊可心，魏 罡，張曉彤

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江國宏節(jié)能環(huán)保有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040）

纖維素是自然界含量最豐富，分類最廣的可再生資源[1]。它雖具有很大的利用價值，卻由于結(jié)構穩(wěn)定很難降解無法直接利用。而纖維素酶可以水解纖維素，作用于纖維素β-1,4 糖苷鍵，最終生成纖維二糖和葡萄糖[2]。纖維素酶是一組具有協(xié)同作用的酶系[3]，應用前景很廣泛[4]，而內(nèi)切葡聚糖酶作為纖維素酶的核心成分，參與自然界的碳循環(huán)，打破纖維素鏈，水解糖苷鍵，在纖維素降解中意義非凡。

目前國內(nèi)外對內(nèi)切葡聚糖酶基因克隆及表達研究較多，而絲狀真菌是常用的產(chǎn)酶菌株，近年來絲狀真菌內(nèi)切葡聚糖酶在不同受體中成功表達，Tao[5]等人將里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因在畢赤酵母中成功表達，生產(chǎn)低聚糖。董自星[6]等人將黑曲霉中3 個內(nèi)切葡聚糖酶的基因在畢赤酵母中進行了克隆與表達。韓學易[7]等克隆米曲霉giF-10內(nèi)切葡聚糖酶基因并在大腸桿菌中成功表達。

由于纖維素酶只有分泌到胞外才可對底物進行降解，所以選擇胞外分泌性能良好的菌株尤為重要，枯草芽孢桿菌作為表達系統(tǒng)，具有高效的蛋白分泌能力，可以直接在培養(yǎng)基中分泌蛋白，表達的產(chǎn)物也不容易形成包涵體[8-9]，構建得到的工程菌兼具產(chǎn)酶效率高、易培養(yǎng)、生長快的優(yōu)點，在食品工業(yè)生產(chǎn)中有廣泛的應用[10-11]。Nobuyuki[12]將嗜堿芽孢桿菌KSM-64的堿性內(nèi)切葡聚糖酶基因構建的新載體pHSP64 在枯草芽孢桿菌中進行表達，得到了高產(chǎn)的內(nèi)切葡聚糖酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Cho[13]構建了兩個編碼纖維素梭菌EngB內(nèi)切葡聚糖酶和mini-CbpA1支架蛋白的基因，并在枯草芽孢桿菌WB800 中進行了共表達，得到了微纖維素小體。王遠[2]等人將來源于熱纖梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因celA與來源于多粘芽孢桿菌的β-葡萄糖苷酶基因bglA和bglB在枯草芽孢桿菌WB800 中進行了分泌型的單獨表達及共表達，實現(xiàn)了分泌表達及分泌型共表達。

本研究將高產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的內(nèi)切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ在胞外分泌性能良好的枯草芽孢桿菌WB600 中進行表達，克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ并進行生物信息學分析，構建重組表達載體pMA5-Eg Ⅶ，轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600 中，獲取枯草芽孢桿菌重組菌株，并對其表達量及分泌的重組酶酶學特性進行研究。為構建高產(chǎn)纖維素酶菌株及纖維素的高效利用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）top10 實驗室保存；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B.subtilis）WB600、pMA5 質(zhì)粒，北京天恩澤生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、DNA Marker、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、膠回收試劑盒TaKaRa 公司（大連）；氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）和氯霉素（Chloramphenicol，Cm）均購于上海源葉有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

ABI 2720 PCR 擴增儀，美國ABI 公司；UV-1780 紫外分光光度計，日本島津公司；DYCZ-20B DNA 分析電泳儀，北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；UV-1780 紫外分光光度計，日本島津公司；THZ-98A 振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒公司；EBA 280/280S 多功能離心機，德國Hettich 公司；STIK高壓滅菌器，美國STIK 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EgⅦ 基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息分析

利用NCBI 在線網(wǎng)站中BLAST 功能對Eg Ⅶ基因進行同源性進行比對分析[14]；采用ExPASy在線軟件分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及二級結(jié)構和三級結(jié)構[15-16]；運用TMHMM 軟件預測分析蛋白質(zhì)的初級結(jié)構[17]；利用SignalP 軟件預測信號肽[18]。

1.2.2 綠色木霉纖維素酶基因EgⅦ 的克隆

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中綠色木霉纖維素酶基因Eg Ⅶ（GenBank 登錄號：EU518927）的序列設計引物，F(xiàn)：5′-CCGGAAAGAGCGAAAAT GCC-3′（NdeI），R：5′-CCGGGAGCTGCATGTGTC AGAGG-3′（BamHI）。以mRNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，引物的引導下合成互補的cDNA，再按照PCR 的方法用兩條引物以cDNA 為模板進行擴增。反應條件是：94℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環(huán)26 次，72℃10 min。反應結(jié)束后，取5 μLPCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中檢測擴增結(jié)果，用回收試劑盒回收目的基因片段。

1.2.3 重組表達載體的構建

利用NdeI 和BamH I 限制性內(nèi)切酶分別對基因目的片段和表達載體pMA5 進行雙酶切，回收目的條帶后用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細胞top10，涂布含有氨芐青霉素抗性的LB固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～16 h。隨機挑取生長出的單克隆菌落進行菌液PCR 驗證，并將陽性轉(zhuǎn)化子送吉林庫美生物有限公司測序。同時，利用小型質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒進行酶切驗證，進一步驗證重組表達載體構建是否成功。

1.2.4 枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化

參照Spizizen 制作感受態(tài)細胞的方法[19]，制作枯草芽孢桿菌WB600 感受態(tài)細胞。利用熱激轉(zhuǎn)化法，將pMA5-EgⅦ的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入WB600 感受態(tài)細胞中，為了促進轉(zhuǎn)化效率，在轉(zhuǎn)化過程中添加10 μg/mL 的溶菌酶來促進轉(zhuǎn)化[20]，將重組菌涂布在含有氯霉素抗性的LB 固體平板上，隨機挑取生長出的單克隆菌落進行菌液PCR 驗證。為了進一步驗證轉(zhuǎn)化是否成功，對正確的菌株提取質(zhì)粒，進行PCR 鑒定，并將構建成功的重組質(zhì)粒作為陽性對照，觀察是否出現(xiàn)相同大小的目的條帶。

1.2.5 重組枯草芽孢桿菌工程菌的表達及酶活測定

由于pMA5 載體是分泌性表達載體，且枯草芽孢桿菌可以直接將蛋白分泌到胞外。利用剛果紅染色法觀察分析水解圈來驗證內(nèi)切葡聚糖酶在枯草芽孢桿菌中是否分泌表達，即：在含有氯霉素抗性的LB 液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)重組菌株，37℃搖床內(nèi)培養(yǎng)12 h。將活化后的菌液涂布到含有纖維素的平板上過夜培養(yǎng)48 h。利用剛果紅染色，觀察是否出現(xiàn)透明水解圈，原菌株WB600 作為對照，觀察并測量透明水解圈的大?。灰訡MC 為底物，采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖(DNS)法測定胞外酶活[21-22]，以U/mL 作為酶活力單位，即在特定條件下，1 分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1 微摩爾底物所需的酶量為一個活力單位(U)。將重組枯草芽孢桿菌株接種到5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、200 r/min，當重組枯草芽孢桿菌達到對數(shù)生長期OD600值為0.7～0.8 時，將菌株接種到50 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、200 r/min培養(yǎng)，測量周期為12 h，將培養(yǎng)好的菌液4℃，10 000 g，離心10 min，收集上清液，即胞外酶液進行測定。

1.3 重組酶酶學性質(zhì)的測定

1.3.1 最適反應溫度及最適pH 值

取上清粗酶液與底物CMC 反應1 h，反應分別在20～90℃不同溫度梯度下進行，以最高酶活為100%參照值，測定內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力。取上清粗酶液在最適反應溫度條件下與底物CMC 反應1 h，控制檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的pH 值分別為3.2、4.0、4.8、5.6、6.4、7.2、8.0，以最高酶活作為100%參照值，測定重組酶的內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力[23]。

1.3.2 溫度穩(wěn)定性及pH 值穩(wěn)定性

在20～90℃不同溫度梯度下將粗酶液降保溫30 min，然后在50℃條件下反應1 h 來測定剩余酶活力分析其熱穩(wěn)定性。取上清粗酶液，在不同的pH 值環(huán)境條件下保溫30 min 后測定殘留酶活性，由此確定酶的pH 值穩(wěn)定性[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)切葡聚糖酶基因生物信息學分析

經(jīng)BLAST 對Eg Ⅶ基因同源對比發(fā)現(xiàn)，與Eg Ⅶ基因序列同源性最高（相似度大于99%）的是瑞士木霉QM6a 的Cel61b基因（XM_006963817.1）。利用Protparam 在線分析Eg Ⅶ蛋白質(zhì)理化性質(zhì)結(jié)果表明：Eg Ⅶ基因編碼249 個氨基酸，其蛋白質(zhì)的分子量為26.800 2 kD，分子式為C1210H1822N322O354S8，理論等電點7.62，原子總數(shù)為3 716，不穩(wěn)定指數(shù)為31.12，可以認定為是穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）77.63，屬于脂溶性蛋白，體外網(wǎng)狀蛋白中半衰期為30 h。其氨基酸組成如表1所示，其中帶正電荷氨基酸（Arg+Lys）所占百分比為4.8%，共12個，帶負電荷氨基酸（Asp+Glu）所占百分比4.4%，共11 個。

表1 內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ氨基酸的組成Table 1 Amino acid composition of the endoglucanase EgⅦ

利用TMHMM 在線軟件預測內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ蛋白質(zhì)初級結(jié)構，內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ跨膜區(qū)預測結(jié)果（圖1A）顯示該蛋白不含跨膜區(qū)，是胞外蛋白，適合分泌型表達；利用SignalP 在線分析軟件對基因進行信號肽的預測，結(jié)果（圖1B）顯示該基因信號肽的剪切位點在19～20 號氨基酸之間；利用ExPaSy 中SOPMA 在線軟件預測Eg Ⅶ蛋白質(zhì)的二級結(jié)構結(jié)果，表明內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ蛋白中α-螺旋占到10.84%，延伸鏈占到26.51%，β-轉(zhuǎn)角占到6.83%，無規(guī)則卷曲占到55.82%（圖2A）；利用ExPaSy 中Swiss model 預測Eg Ⅶ蛋白質(zhì)的三級結(jié)構，內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ蛋白空間構象由a-螺旋、延伸鏈區(qū)、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構成（圖2B），與二級結(jié)構一致。

圖1 內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ跨膜段預測（A）、信號肽預測（B）Fig.1 Prediction of the transmembrane region (A) and signal peptide (B) of Eg Ⅶ

圖2 內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ蛋白二級結(jié)構預測（A）、三級結(jié)構預測（B）Fig.2 Prediction of secondary structures (A),and tertiary structures (B) of Eg Ⅶ

2.2 內(nèi)切葡聚糖酶基因克隆與重組載體構建

按照PCR 的方法克隆內(nèi)切葡聚糖酶基因EgⅦ，通過電泳驗證得到大小約750 bp 的條帶（圖3A）；重組表達載體Eg Ⅶ-pMA5 構建圖譜見圖3B，其條帶大小為7 913 bp，符合目的基因與載體條帶大小相加之和。挑取抗性平板生長出的單克隆菌落進行菌液PCR鑒定，得到約1 156 bp條帶（圖4A），與預期片段大小相符。提取質(zhì)粒利用NdeI和BamHI 酶對重組質(zhì)粒EgⅦ-pMA5 進行雙酶切，獲得約750 bp 的目的基因條帶（圖4A，泳道2、3、4 下）和空載體（圖4A，泳道2、3、4 上），還有約大于7 kb 的條帶，長度為空載體和目的基因之和（圖4B，泳道1），符合預期結(jié)果，證明成功地構建了重組載體Eg Ⅶ-pMA5；

圖3 基因Eg Ⅶ的PCR 擴增產(chǎn)物（A）、重組質(zhì)粒Eg Ⅶ-pMA5 圖譜（B）Fig.3 PCR product of Eg Ⅶ (A) and the map pf pMA5-Eg Ⅶ (B)

圖4 大腸桿菌菌落PCR 鑒定電泳結(jié)果（A）、重組質(zhì)粒Eg Ⅶ-pMA5 的酶切驗證（B）Fig.4 Electrophoresis results of E.coli colonies PCR (A) and enzyme digestion of Eg Ⅶ-pMA5 plasmids (B)

2.3 內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化

隨機挑取抗性平板上轉(zhuǎn)化后的單菌落進行菌液PCR 的驗證是否出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果如圖5A所示。在與目的基因片段大小符合處出現(xiàn)條帶，且對PCR 產(chǎn)物進行測序驗證，結(jié)果表明重組質(zhì)粒Eg Ⅶ-pMA5 成功轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB600 中。然后對驗證條帶正確的菌株，使用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，進行PCR 鑒定，電泳結(jié)果如圖5B，與構建成功的重組質(zhì)粒Eg Ⅶ-pMA5 條帶位置相同，證明已成功將重組質(zhì)粒Eg Ⅶ-pMA5 轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB600 菌株中得到重組菌。

圖5 重組枯草芽孢桿菌菌落PCR 鑒定電泳結(jié)果（A）、質(zhì)粒PCR 鑒定電泳結(jié)果（B）Fig.5 Electrophoresis results of PCR identification of transformed B.subtilis colonies (A),PCR identification of plasmid (B)

2.4 重組內(nèi)切葡聚糖酶表達

采用剛果紅染色法對重組菌染色后的得到透明圈，如圖6所示。經(jīng)過染色后重組菌株WB600-EgⅦ-pMA5 產(chǎn)生了直徑較大透明水解圈（圖6），且對原菌株WB600 染色并未出現(xiàn)透明水解圈，說明枯草芽孢桿菌成功表達了目的基因，且分泌表達的纖維素酶具有活性。每隔12 h 對重組菌株WB600-Eg Ⅶ-pMA5 的上清粗酶液進行酶活力測定，結(jié)果見圖7，重組菌株WB600-Eg Ⅶ-pMA5在0～48 h，酶活呈現(xiàn)增長趨勢，到48 h 時，WB600-Eg Ⅶ-pMA5 的酶活力達到最大值為22.71 U/mL；48h 之后酶活力逐漸下降，因此可以確定重組菌株的纖維素酶活最高的培養(yǎng)時間為培養(yǎng)48 h左右，也更進一步表明重組菌株可以將纖維素酶分泌到胞外培養(yǎng)基中。

圖6 重組菌在CMC 培養(yǎng)基上的水解圈Fig.6 Hydrolysis circle of recombinant bacteria on CMC medium

圖7 重組菌酶活力Fig.7 Enzyme activity of recombinant B.subtilis

2.5 重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學性質(zhì)分析

溫度及pH 值對重組內(nèi)切葡聚糖酶的影響見圖8A，結(jié)果表明，此重組酶在20～60℃的條件下，其酶活力隨著溫度的升高而提高，在60℃的條件下培養(yǎng)時，酶活力達到最大值，但在60℃以上的溫度下酶活力有下降的趨勢，因為重組酶是由蛋白質(zhì)構成，而太高的溫度則會讓蛋白質(zhì)發(fā)生變性，所以重組酶的酶活在過高溫度下會發(fā)生下降甚至失活的現(xiàn)象。由圖8B 可知，當pH 值在5.0～7.0的條件下，酶活力呈現(xiàn)上升的趨勢，在pH 值為6.4的條件下，此時是酶活最高的狀態(tài)。說明重組酶是一種偏酸性的酶，在中性和堿性的條件下酶活會受到大的影響，呈現(xiàn)下降趨勢，甚至在強堿的條件下可能會失活，當然在pH 值太小的情況下酶活也會相應地降低。

圖8 溫度對酶活性的影響 (A)、pH 值對酶穩(wěn)定性的影響 (B)Fig.8 Influences of temperature (A) and pH (B) on enzyme activity

2.6 重組內(nèi)切葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性及pH 值穩(wěn)定性

重組酶的熱穩(wěn)定性及pH 穩(wěn)定性見圖9A。以未保溫的在4℃下保存的酶樣為100%酶活力，重組內(nèi)切葡聚糖酶在20～50℃時表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，重組酶的相對酶活均保持在80%以上，但在50℃之后重組酶的酶活呈現(xiàn)下降的趨勢，在90℃下保溫30 min 則完全喪失酶活力，表明高溫會使重組酶的酶活產(chǎn)生較大的影響；圖9B 表示重組酶在pH 值5～8 時酶活比較穩(wěn)定，pH 值在6 左右時，重組酶的穩(wěn)定性最好，但在強酸或者強堿條件下，酶活的穩(wěn)定性則會受到較大影響。

圖9 重組酶的熱穩(wěn)定性(A)、重組酶的pH 值穩(wěn)定性(B)Fig.9 Thermal stability of recombinant enzyme (A) and pH stability of recombinant enzyme (B)

3 結(jié)論與討論

3.1 討 論

纖維素酶是目前研究發(fā)現(xiàn)的糖苷酸類數(shù)量巨大且具有利用潛力的酶，纖維素酶中的內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素降解的主要成分，而綠色木霉作為常用分泌纖維素酶系最多的真菌，有重要的應用價值，綠色木霉的基因克隆已有一定的進展[25-27]，基于前人研究方法，本試驗克隆綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ，并對其生物信息進行分析預測可知與Eg Ⅶ基因序列同源性最高的是瑞士木霉QM6a 的Cel61b基因，相似度大于99%；內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ屬于穩(wěn)定蛋白，說明其蛋白穩(wěn)定性不易受到環(huán)境中因素的影響，預測可能與其蛋白質(zhì)構象有關。對于基因表達系統(tǒng)，本試驗選擇了pMA5 載體和枯草芽孢桿菌作為受體。pMA5 作為雙抗載體，更利于篩選，且由于其存在強啟動子，所以無需誘導即可進行蛋白表達，陳毅鵬[28]以pMA5 作為載體在枯草芽孢桿菌中成功表達了鏈絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶的基因sat；目前用于內(nèi)切葡聚糖酶表達的受體大多數(shù)為大腸桿菌[29]和酵母菌[30]，選用枯草芽孢桿菌作為受體，克服了大腸桿菌只在胞內(nèi)分泌表達蛋白的缺點，可在培養(yǎng)基中直接分泌蛋白，且安全無致病性，有助于纖維素酶的分離與提取，隨著基因工程的不斷完善，為了防止枯草芽孢桿菌體內(nèi)的胞外蛋白酶降解外源蛋白，枯草芽孢桿菌WB600 菌株敲除了6 個胞外蛋白酶基因[31]，為外源基因的高效表達奠定了基礎。本試驗已經(jīng)完成內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ克隆及表達，還應在重組酶酶活的提高及重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化方面進一步研究，為日后纖維素酶的應用提供參考。

3.2 結(jié) 論

通過RT-PCR 技術成功克隆了綠色木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ，通過生物信息分析可知其編碼了249 個氨基酸，預測了其蛋白質(zhì)二級結(jié)構及三級結(jié)構，結(jié)果表明內(nèi)切葡聚糖酶Eg Ⅶ蛋白中α-螺旋占到10.84%，延伸鏈占到26.51%，β-轉(zhuǎn)角占到6.83%，無規(guī)則卷曲占到55.82%；構建了重組載體Eg Ⅶ-pMA5，利用熱激法成功轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600 菌株中，篩選出重組菌株進行剛果紅染色及DNS 酶活測定，得到較大直徑透明圈且DNS 酶活達到22.71U/mL，表明內(nèi)切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ在枯草芽孢桿菌中成功表達；對重組酶酶學性質(zhì)研究表明，重組內(nèi)切葡聚糖酶最適的反應溫度是60℃、最適的反應pH 值是6.4；且在20～50℃溫度范圍內(nèi)，在5.0～8.0pH 值范圍內(nèi)，重組酶酶活有良好的穩(wěn)定性。