鞏麗萍, 杭寶建, 咸瑞卿, 楊明正, 張迅杰, 魏 霞

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東省仿制藥一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心, 山東 濟(jì)南 250101)

硫酸二甲酯是重要的化工原料之一[1,2],在有機(jī)合成中作為甲基化試劑廣泛用于制造二甲基亞砜、咖啡因、可待因、香草醛、安替比林、氨基比林、甲氧芐氨嘧啶等藥物以及農(nóng)藥乙酰甲胺磷等,有些藥物在生產(chǎn)過程中也會(huì)產(chǎn)生硫酸二甲酯[3]。硫酸二甲酯為劇毒品,具有遺傳毒性和致癌性,且具有強(qiáng)烈的腐蝕性,能在動(dòng)物體內(nèi)組織中緩慢水解生成甲醇和硫酸,其毒性是由未分解的分子和水解后的生成物共同作用產(chǎn)生。藥物中殘留的硫酸二甲酯在過量(《美國(guó)藥典》《歐洲藥典》規(guī)定原料藥中硫酸二甲酯的含量不得過0.000 038%)時(shí)會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生巨大的危害,因此非常有必要控制藥物中硫酸二甲酯的殘留量[4,5]。

目前對(duì)硫酸二甲酯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜法[6-15],但準(zhǔn)確測(cè)定藥物中殘留的硫酸二甲酯含量極具挑戰(zhàn)性,因?yàn)榱蛩岫柞O性很大,不具備敏感的紫外吸收基團(tuán),因此傳統(tǒng)方法在專一性、靈敏度、方法精密度和重復(fù)性等方面都存在很大缺陷,且檢測(cè)過程中對(duì)溶劑的要求很嚴(yán)格,如溶液配制不允許使用水,必須使用純度極高的乙腈,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法得到的譜圖在低分子端會(huì)出現(xiàn)大量的碎片峰,干擾檢測(cè)的精準(zhǔn)度。

本研究以氨基比林作為衍生試劑,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了氨基比林、咖啡因、替加氟等叔胺類藥物中硫酸二甲酯的檢測(cè)方法。硫酸二甲酯具有甲氧基基團(tuán),可以和氨基比林發(fā)生N-烴基化反應(yīng)生成甲基化氨基比林(季銨鹽),樣品前處理簡(jiǎn)便,生成的甲基化氨基比林穩(wěn)定性高、干擾小、質(zhì)譜離子化好、響應(yīng)高,方法快速、準(zhǔn)確、靈敏,可用于上述叔胺類藥品的質(zhì)量控制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

AB SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB公司;美國(guó)); XSE205電子天平(Metter Toledo公司,瑞士); KQ-300GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲器(昆山市超聲儀器有限公司); Vortex-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。甲醇、丙酮(色譜純,美國(guó)賽默飛公司),甲酸(色譜純,美國(guó)ACS公司),乙酸銨(色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),去離子水(18.2 MΩ·cm,由美國(guó)Merck-Millipore公司生產(chǎn)的Millipore Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng)制得)。對(duì)照品:硫酸二甲酯(山東西亞化學(xué)公司),純度99.5%。樣品:氨基比林、咖啡因、替加氟原料藥共9批。

1.2 色譜、質(zhì)譜條件

液相色譜條件:色譜柱為Waters Atlantis HILIC C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3.0 μm),以10 mmol/L乙酸銨水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液(50∶50, v/v)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫,流速0.3 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源,正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源溫度:550 ℃。定性、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表 1 甲基化氨基比林的質(zhì)譜采集離子信息Table 1 Ion information of methylated aminopyrine acquired by MS

1.3 衍生劑、空白溶液的制備

取氨基比林1.000 g,精密稱定,置于100 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為衍生劑溶液;取0.5 mL水,加衍生劑溶液0.5 mL, 40 ℃反應(yīng)2 h,作為空白溶液。

1.4 對(duì)照品溶液的制備

取硫酸二甲酯對(duì)照品適量,精密稱定,加丙酮溶解并定量稀釋,制成20 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密量取溶液0.05 mL,加水稀釋制成4 ng/mL的對(duì)照品工作溶液(臨用新制);精密量取溶液0.5 mL,精密加入衍生劑溶液0.5 mL,搖勻,40 ℃反應(yīng)2 h,作為對(duì)照品溶液。

1.5 供試品溶液的制備

氨基比林原料藥:取本品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋,制成5 mg/mL的溶液;取溶液1.0 mL,于40 ℃放置2 h,作為氨基比林供試品溶液。

替加氟等叔胺類原料藥:取本品適量,精密稱定,加水溶解并定量稀釋,制成5 mg/mL的溶液;精密量取溶液0.5 mL,精密加入衍生劑溶液0.5 mL,搖勻,40 ℃反應(yīng)2 h,作為其他叔胺類供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)產(chǎn)物的確認(rèn)及反應(yīng)溫度的考察

硫酸二甲酯是甲基化試劑,和氨基比林發(fā)生N-烴基化反應(yīng)生成季銨鹽(見圖1)。反應(yīng)過程中溫度是影響反應(yīng)效率的主要因素,因此對(duì)不同反應(yīng)溫度進(jìn)行了考察。

圖 1 硫酸二甲酯與氨基比林的反應(yīng)式Fig. 1 Reaction formula of dimethyl sulfate and aminopyrine

考察實(shí)驗(yàn)過程如下:精密稱定硫酸二甲酯(相對(duì)分子質(zhì)量為126.13)適量,加丙酮溶解并稀釋制成濃度為4.5 mmol/L的溶液。精密稱定氨基比林(相對(duì)分子質(zhì)量為231.29)適量,加水溶解并稀釋制成濃度為45.0 mmol/L的溶液。取上述硫酸二甲酯溶液和氨基比林溶液各1 mL,混勻,分別于30、40、50 ℃反應(yīng)2 h,取上述反應(yīng)液各1.0 mL,分別置于100 mL量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,作為考察樣品溶液。同法制備空白溶液。采用Thermo QE Plus高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析,計(jì)算出不同溫度下的反應(yīng)效率,并對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性確認(rèn)。

考察樣品溶液和空白溶液的一級(jí)高分辨離子色譜圖和紫外光譜圖分別見圖2a和圖2b。考察樣品溶液中因氨基比林在反應(yīng)體系中過量,故有剩余沒反應(yīng)的氨基比林,因此會(huì)采集到衍生產(chǎn)物甲基化氨基比林和剩余反應(yīng)物氨基比林的質(zhì)譜信息,同時(shí)采集了剩余反應(yīng)物氨基比林的紫外光譜;空白溶液中只有氨基比林,因此一級(jí)高分辨離子色譜圖只有氨基比林的信息。由于采用的是高分辨質(zhì)譜,精度高,可以對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性確認(rèn),由一級(jí)高分辨離子色譜圖可以看出,氨基比林與硫酸二甲酯的反應(yīng)液中檢測(cè)到反應(yīng)產(chǎn)物的精確質(zhì)量數(shù)為246.124 6,與氨基比林甲基化產(chǎn)物的理論精確質(zhì)量數(shù)246.124 6一致,確認(rèn)了反應(yīng)產(chǎn)物為甲基化氨基比林。以氨基比林在考察樣品溶液和空白溶液中233 nm測(cè)定的紫外光譜圖峰面積差值計(jì)算反應(yīng)效率。隨著溫度的升高,硫酸二甲酯和氨基比林的反應(yīng)效率增加,在40 ℃時(shí)基本上達(dá)到完全反應(yīng),因此選擇40 ℃作為衍生溫度。

圖 2 反應(yīng)物、反應(yīng)產(chǎn)物在(a)考察樣品溶液和(b)空白溶液中的提取離子色譜圖和紫外色譜圖Fig. 2 Extraction ion and UV chromatograms of reactants and reaction products in (a) test sample and (b) blank solutions The reaction products were investigated by ultra-high performance liquid chromatography-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (UHPLC-Orbitrap HRMS). The separation was performed on a Thermo Hypersil GOLD column (100 mm×2.1 mm, 3 μm) using 10 mmol/L ammonium acetate solution-0.1% formic acid methanol solution (50∶50, v/v) at a flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃, detection wavelength was 233 nm and injection volume was 1 μL.

2.2 氨基比林衍生劑的選擇

吡啶是硫酸二甲酯發(fā)生甲基化反應(yīng)的常用底物,是一個(gè)含有氮雜原子的六元雜環(huán)化合物,具有芳香性,而本研究發(fā)現(xiàn)的氨基比林為含有α,β不飽和酮結(jié)構(gòu)的脂肪胺,吡啶環(huán)上的N原子相比氨基比林上的N原子因電子云軌道雜化、空間位置不同而活性較低,且硫酸二甲酯與胺的反應(yīng)屬于雙分子親核取代(SN2)反應(yīng),在SN2反應(yīng)中,氨基比林表現(xiàn)出更強(qiáng)的親核性,反應(yīng)能夠快速進(jìn)行。與吡啶相比,氨基比林與硫酸二甲酯反應(yīng)不需要高溫,較低溫度有利于硫酸二甲酯的穩(wěn)定。吡啶與硫酸二甲酯反應(yīng)后產(chǎn)物具有季銨鹽的特性,但生成的季銨鹽不利于其芳香性的保持,不夠穩(wěn)定,但是氨基比林生成的脂肪胺季銨鹽穩(wěn)定性好,因此本研究選取的氨基比林更適合作為甲基化試劑用于硫酸二甲酯的檢測(cè)。

2.3 專屬性

精密量取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液各1 μL,分別進(jìn)樣測(cè)定。空白溶液與供試品溶液中其他雜質(zhì)峰均不干擾硫酸二甲酯衍生后的甲基化氨基比林的檢測(cè),空白溶液中甲基化氨基比林保留時(shí)間處有峰值很小的本底色譜峰(見圖2)。連續(xù)將空白溶液進(jìn)樣7次,計(jì)算該色譜峰峰面積的RSD值為6.17%,表明該色譜峰的穩(wěn)定性良好,不影響硫酸二甲酯的檢測(cè)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(20 μg/mL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL,分別置于100 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。分別精密量取上述溶液0.5 mL,再分別精密加入0.5 mL衍生劑溶液,混勻,40 ℃反應(yīng)2 h,進(jìn)樣測(cè)定。以甲基化氨基比林的峰面積為縱坐標(biāo)(y),各溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, ng/mL),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明在0.993 5～7.984 0 ng/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,回歸方程為y=17 901x-3 146,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 7。

2.5 檢出限和定量限

基于空白溶液中存在本底峰,檢出限和定量限采用《中國(guó)藥典》2020年版四部通則9101中“基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法”測(cè)定。取空白溶液連續(xù)進(jìn)樣7次,計(jì)算檢出限為0.50 ng/mL(0.05 ppm),定量限為1.15 ng/mL(0.115 ppm)。

2.6 精密度

取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,甲基化氨基比林峰面積的RSD值為2.80%,表明該方法的儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性

取對(duì)照品反應(yīng)溶液分別在0、2、4、6、20 h進(jìn)樣測(cè)定,甲基化氨基比林峰面積的RSD值為4.32%,表明反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性良好。

表 2 三個(gè)水平下硫酸二甲酯的加標(biāo)回收率(n=3)Table 2 Spiked recoveries of dimethyl sulfate at three levels (n=3)

2.8 回收率

本方法通過向陰性氨基比林、替加氟樣品中分別添加低、中、高3個(gè)水平的硫酸二甲酯對(duì)照品溶液,每個(gè)水平進(jìn)行3次平行試驗(yàn),計(jì)算方法回收率,結(jié)果見表2。硫酸二甲酯的平均回收率為94.9%～106.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.44%～5.51%,滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。

2.9 樣品測(cè)定

取氨基比林、咖啡因、替加氟共9批原料藥按1.5節(jié)制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定。按外標(biāo)法計(jì)算硫酸二甲酯的含量,9批樣品中均未檢出該雜質(zhì),表明氨基比林、咖啡因、替加氟原料藥生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)工藝對(duì)硫酸二甲酯基因毒雜質(zhì)控制良好。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定氨基比林等叔胺類藥品中硫酸二甲酯基因毒雜質(zhì)含量的檢測(cè)方法,該方法將氨基比林作為衍生劑,與藥品中殘留的硫酸二甲酯發(fā)生反應(yīng)生成甲基化氨基比林,通過檢測(cè)甲基化氨基比林間接測(cè)得藥品中硫酸二甲酯的含量,進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,并將方法用于實(shí)際樣品的測(cè)定。與現(xiàn)有技術(shù)相比,該方法離子峰峰形好,無其他碎片雜峰干擾,方法靈敏度高、精密度和重復(fù)性好,結(jié)果可靠,可用于氨基比林等藥品中硫酸二甲酯基因毒雜質(zhì)的測(cè)定。本研究有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)生產(chǎn)工藝中基因毒雜質(zhì)的控制,同時(shí)為藥品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。