高乳化特性大米蛋白酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與性能研究

楊振宇，閆家凱，段艷華，喬 鑫，孔志豪，徐興鳳,

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東萊陽 265200）

食品行業(yè)中常用的乳化劑有合成乳化劑和動(dòng)物基乳化劑。植物基乳化劑（如植物蛋白）因價(jià)格低廉，對環(huán)境友好，是食品乳化劑發(fā)展的主要趨勢，且與聯(lián)合國糧農(nóng)組織可持續(xù)發(fā)展的理念一致。大米蛋白作為優(yōu)質(zhì)植物蛋白之一，具有高生物效價(jià)、低過敏性、氨基酸配比全面合理和易消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，引起人們的廣泛關(guān)注，逐漸成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而大米蛋白分子鏈間相互交聯(lián)、高度疏水等因素致使其水溶性差，限制了其在食品乳化劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此通常對大米蛋白進(jìn)行改性，進(jìn)而改善大米蛋白的乳化性。

酶法改性具有反應(yīng)溫和、節(jié)約能源成本等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在蛋白的改性方面。蛋白酶有特定的酶切位點(diǎn)，且最適pH 不同，如酸性蛋白酶主要作用于C-端疏水性氨基酸殘基，最適pH 為2～4；木瓜蛋白酶作用于精氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸的羧基端，在pH7 下反應(yīng)；胰蛋白酶作用位點(diǎn)為精氨酸和賴氨酸的羧基，最適pH 為8 左右。根據(jù)“結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)”的理論觀點(diǎn)，蛋白酶類型和水解度均會影響酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變功能特性，如乳化性。值得注意的是，蛋白質(zhì)過度水解會降低乳化特性等功能特性，因此進(jìn)行限制性酶解至關(guān)重要。江連洲等使用多種蛋白酶酶解大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物的乳化性變化不大，其他酶解產(chǎn)物的乳化性有不同程度的提升。有研究報(bào)道用木瓜蛋白酶處理大豆分離蛋白，酶解產(chǎn)物的乳化活性隨著水解度的增加而降低。因此，酶類型和水解度對大米蛋白酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能特性的影響值得探究。酶解蛋白是混合物，包括不同分子量段的肽。有研究表明乳清蛋白的＞5 kDa 的肽組分比＜5 kDa 肽組分形成的乳液更穩(wěn)定。但是對于植物蛋白，尤其是大米蛋白酶解產(chǎn)物中乳化性較好的主要組分尚不明確。

因此，本文用不同類型的酶處理大米蛋白，研究酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特性和功能性質(zhì)，篩選乳化性較好的酶解產(chǎn)物分離出＜5 kDa，5～10 kDa 和＞10 kDa 三種不同分子量的肽組分，研究其界面特性和乳液穩(wěn)定性間的相互關(guān)系，為大米蛋白作為新型植物基乳化劑的商業(yè)化的開發(fā)與應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米蛋白（純度90%）江西金農(nóng)生物科技有限公司；酸性蛋白酶（100000 U/g）安琪酵母股份有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶（1500 U/mg）北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、Florisil 分子篩（60～100 目）、尼羅紅 上海麥克林生化科技有限公司；1-十六烷硫醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超濾膜（5 kDa、10 kDa）美國密理博有限公司；喜燕玉米胚芽油 超市購買；其它試劑均為分析純。

F2700 熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；T18 數(shù)顯高速分散機(jī) 德國IKA 儀器有限公司；Nicolet islo傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet 公司；Labscale 超濾系統(tǒng) 美國密理博有限公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞破碎儀（900 W）寧波新芝生物科技股份有限公司；DSA100S 光學(xué)接觸角測量儀 德國Krüss 公司；S3500 粒度分析儀 美國麥奇克有限公司；TCS SP5 型激光共聚焦顯微鏡 美國安捷倫公司；Q-Sense Explorer 耗散型石英晶體微天平 瑞典百歐林科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本文的研究路線圖如圖1 所示。

圖1 研究路線圖Fig.1 Research roadmap

1.2.1 大米蛋白酶解產(chǎn)物的制備 本文采用的原料為大米粉直接堿提酸沉而得，根據(jù)Xu 等的方法對大米蛋白進(jìn)行酶法水解：30 g 大米蛋白于500 mL蒸餾水中室溫?cái)嚢璺稚? h，分別置于最適溫度和pH 下進(jìn)行酶解。其中，酶與底物的質(zhì)量比為1:100。酶解條件分別為胰蛋白酶50 ℃，pH8；木瓜蛋白酶50 ℃，pH7；酸性蛋白酶37 ℃，pH3。酶解過程中，分別滴加0.1023 mol/L NaOH 或0.1051 mol/L HCl 溶液以保持pH 穩(wěn)定。酶解完成后，置于90 ℃加熱10 min 滅酶，迅速冰浴冷卻至室溫，最后調(diào)為pH7，離心（3000 r/min，15 min）后取上清液凍干，以備后用。水解度（the degree of hydrolysis，DH）通過pHstat 法測定，公式如下：

式中：B 和N分別是NaOH 消耗的體積（mL）和NaOH 的濃度（mol/L）；M是蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；是pH8 和50 ℃處理下-NH的解離度（0.885）；h是每克大米蛋白中肽鍵的理論毫摩爾數(shù)（7.40 meq/g）。

水解度為2%的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物命名為“胰2%”，水解度為6%的稱為“胰6%”，其它酶解產(chǎn)物命名同理。

1.2.2 結(jié)構(gòu)特性的測定

1.2.2.1 表面疏水性 表面疏水性采用ANS 熒光探針法，對Chen 等的步驟稍作修改。將蛋白酶解產(chǎn)物溶于磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH7）使其濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.08 和0.1 mg/mL。激發(fā)波長和發(fā)射波長參數(shù)分別設(shè)置為390 和470 nm。將20 μL 8 mmol/L 的ANS 分別加入酶解產(chǎn)物溶液中，渦漩振蕩5 s 后，避光靜置10 min，搖勻后測定熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度對不同樣品的酶解產(chǎn)物濃度作圖，表面疏水性指數(shù)用初始段斜率表示。

1.2.2.2 傅里葉紅外光譜 取適量酶解產(chǎn)物粉末與溴化鉀研磨均勻并壓片，設(shè)置分辨率參數(shù)為4 cm、掃描32 次，在4000～400 cm下測定。

1.2.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定 參考Zheng等的方法略作修改測定乳化特性。將16 mL 酶解產(chǎn)物溶液（1 g/100 mL）與4 mL 玉米油用高速分散機(jī)以12000 r/min 的速度高速分散1 min。立即準(zhǔn)確量取距離容器底部0.5 cm 處的乳狀液70 μL，與7 mL SDS 溶液（0.1 g/100 mL）渦漩10 s 混勻。在500 nm下測定溶液的吸光值A(chǔ)，10 min 后再次測定A，計(jì)算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI），公式如下：

式中：C 為酶解產(chǎn)物的濃度（g/mL），為油相的體積分?jǐn)?shù)（L/L），本實(shí)驗(yàn)中為0.20。

1.2.4 酶解產(chǎn)物的超濾分離 參考宋凱強(qiáng)等的方法稍作修改，采用Labscale 超濾系統(tǒng)對胰2%酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離。首先采用10 kDa 超濾膜進(jìn)行超濾，當(dāng)截留液體積剩余5%左右時(shí)，停止超濾，收集截留液稱為“＞10 kDa”。透過液繼續(xù)采用5 kDa 超濾膜進(jìn)行分離，收集截留液為“5～10 kDa”，透過液為“＜5 kDa”。超濾過程中，循環(huán)壓力和進(jìn)口壓力分別設(shè)置為0.2 MPa。超濾得到的分級肽液體于-80 ℃預(yù)凍后在真空冷凍干燥機(jī)中凍干備用。＜5 kDa、5～10 kDa和＞10 kDa 的得率分別為40.20%、13.88%和45.92%。

1.2.5 不同分子量肽的界面特性測定

1.2.5.1 界面張力 參考王金梅的方法，采用懸滴法測定了油-水界面上吸附蛋白質(zhì)的界面張力（）隨吸附時(shí)間的變化。因玉米油中有少量表面活性成分，先通過Florisil 分子篩進(jìn)行純化。100 g 玉米油中加3 g Florisil 分子篩，攪拌30 min 后離心，重復(fù)操作三次，直到10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液的界面張力在30 min 內(nèi)不發(fā)生明顯變化。將純化后的玉米油盛在玻璃槽中，不同濃度（0.01、0.1 g/100 mL）的分級肽溶液通過注射器在針尖形成45 μL 的液滴。在實(shí)驗(yàn)過程中，整個(gè)系統(tǒng)避免外部振動(dòng)干擾測量?；谝旱涡螤?，由Young-Laplace 方程式計(jì)算出界面張力（精確至0.01 mN/m）。

1.2.5.2 肽在疏水表面吸附行為的測定 參考Zhang等的方法，采用耗散型石英晶體微天平（quartz crystal microbalance with dissipation，QCM-D）研究肽在疏水表面上的吸附行為。潔凈的金芯片（QSX 301,4.95 MHz）浸入1-十六烷硫醇至少8 h，形成自組裝疏水層模擬油-水界面，用乙醇和超純水沖洗，除去未吸附的1-十六烷硫醇。先通10 mmol/L pH7 的磷酸鹽緩沖液獲得穩(wěn)定基線，隨后泵入1 g/100 mL樣品溶液，流速0.1 mL/min。90 min 后再次通入磷酸鹽緩沖液，以沖洗未結(jié)合或結(jié)合松散的乳化劑。最后用Q-ToolsTM 軟件分析不同倍頻下的頻率和耗散，并用Sauerbrey 模型分析吸附的厚度。本研究使用第三倍頻分析數(shù)據(jù)，因?yàn)榇吮额l下共振受機(jī)械影響最小。

1.2.6 乳液的制備 參考王霞等的方法稍作修改。將4 g 分級肽分散于100 mL 磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH7）中，攪拌1 h 并4 ℃過夜水化。第2 d 放置室溫后，取18 g 分級肽溶液與2 g 玉米油高速分散（10000 r/min，2 min）制備粗乳液，隨后在450 W 超聲功率下超聲8 min，期間用冰水浴防止過熱。乳液制備完成后，加入疊氮化鈉（0.01 g/100 mL）以抑制微生物的生長。

1.2.7 乳液的貯藏穩(wěn)定性測定

1.2.7.1 乳液液滴平均粒徑 使用粒度分析儀測量乳液在0 和7 d 表面積平均粒徑（d）。玉米油折光率設(shè)置1.45，分散相折光率1.33，攪拌速度1200 r/min。所有樣品均用10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH7）稀釋，以避免多重散射影響。

1.2.7.2 乳液的微觀結(jié)構(gòu)分析 采用激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察乳液的微觀結(jié)構(gòu)。1 mL 乳液加入20 μL 尼羅紅溶液（1 mg/mL 于乙醇中）進(jìn)行染色，取6 μL 樣品于載玻片上，蓋上蓋玻片。將香柏油滴至蓋玻片中央，使用488 nm 激光激發(fā)源，HCX PLAPO 63×油鏡觀察乳液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 20 進(jìn)行單因素分析和Tukey 分析樣品之間的顯著性差異（＜0.05），采用Origin 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對大米蛋白水解度的影響

大米蛋白在三種蛋白酶的最適條件下進(jìn)行酶法水解，結(jié)果如圖2 所示，水解度在最初10 min 均迅速增加，表明大量肽鍵被破壞，隨后水解度增加緩慢，可能是因?yàn)榘被崦附馕稽c(diǎn)的減少或者酶失去活性，這與Hanafi 等的報(bào)道一致。酶解過程中胰蛋白酶的水解度最高，其次為酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶，這可能與蛋白酶的酶活不同有關(guān)。綜合考慮酶解時(shí)間和樣品得率，本次研究選用水解度為2%、6%的酶解產(chǎn)物作后續(xù)研究。其中酸性蛋白酶酶解時(shí)間分別為1.29 和43.03 min，木瓜蛋白酶酶解時(shí)間分別為6.57和57.92 min，胰蛋白酶酶解時(shí)間分別為1.64 和25.49 min。經(jīng)不同酶處理后各樣品蛋白的得率如表1 所示，隨著水解度的增加，酶解蛋白的得率也隨之增大。不同蛋白酶酶解產(chǎn)物得率不同，這可能是由于酶的酶切位點(diǎn)不一致，酶解后肽段大小不一，進(jìn)而導(dǎo)致溶解在上清液中肽的質(zhì)量也有差異。

圖2 不同酶酶解過程中大米蛋白水解度隨時(shí)間變化Fig.2 Changes of hydrolysis degree of rice protein with time in different enzymes

表1 不同酶酶解大米蛋白產(chǎn)物的得率Table 1 The yield of rice protein hydrolysates treated with different enzymes

2.2 酶類型對酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特性的影響

2.2.1 表面疏水性分析 如圖3 所示，與大米蛋白相比，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物表面疏水性顯著降低（＜0.05）。這與Singh 等結(jié)果一致。他們發(fā)現(xiàn)采用木瓜蛋白酶處理米糠濃縮蛋白后，表面疏水性顯著降低。這可能是因?yàn)槊附夂缶哂杏H水位點(diǎn)的肽釋放而減少了ANS 探針的結(jié)合位點(diǎn)，表面疏水區(qū)域被破壞或者疏水相互作用使肽段之間發(fā)生了聚集，將疏水區(qū)域埋在聚集體內(nèi)。胰6%的表面疏水性比胰2%高，這可能是由于肽段發(fā)生解折疊，而阻礙肽的聚集，使更多疏水基團(tuán)暴露。不同酶類型的酶解產(chǎn)物表面疏水性結(jié)果存在差異，這可能是由于不同的酶作用蛋白質(zhì)的位點(diǎn)不一致，進(jìn)而導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的肽親疏水性位點(diǎn)不同。這與韓仁嬌等研究結(jié)果一致。他們采用六種蛋白酶限制性酶解乳清蛋白后，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物疏水性降低的程度不同，主要是不同的酶切割位點(diǎn)不同，疏水性氨基酸末端暴露不一致導(dǎo)致的。

圖3 大米蛋白及不同酶解產(chǎn)物的表面疏水性Fig.3 The surface hydrophobicity of the rice protein and enzymatic hydrolysis product

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析（表2）可知，大米蛋白的酶解產(chǎn)物-螺旋和-轉(zhuǎn)角含量顯著增加，而有序的-折疊含量顯著降低（＜0.05）。-折疊相較于-螺旋、-轉(zhuǎn)角更為穩(wěn)定，隨著-折疊的減少，蛋白的二級結(jié)構(gòu)更為舒展。具有更靈活結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)更易吸附到界面上并在界面上伸展，且可形成粘彈性較高的界面膜。因此與大米蛋白相比，大米蛋白酶解產(chǎn)物更易吸附到油-水界面上以穩(wěn)定乳液。

2.3 酶類型對酶解產(chǎn)物乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

蛋白質(zhì)的兩親性使其可以作為乳化劑來制備乳液。乳化活性指數(shù)（EAI）表征蛋白質(zhì)形成油水界面的能力，乳化穩(wěn)定性（ESI）表征乳液液滴的抵抗應(yīng)變的能力，與蛋白分子量、表面疏水等因素有關(guān)。如表2 所示，與大米蛋白相比，大米蛋白酶解產(chǎn)物的EAI 顯著增加（＜0.05），可能是由于酶解一定程度上降低了蛋白質(zhì)的分子量，使肽鏈伸展。胰6%的EAI比胰2%低，這可能是由于過度酶解使蛋白質(zhì)分子量進(jìn)一步降低，較小的肽可能無法在乳化液滴表面形成粘彈性膜，肽段兩親性降低，在油水界面間的相互作用受到抑制，降低了乳液的穩(wěn)定性。并且發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物的ESI 均小于原蛋白。Ghribi 等也發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆蛋白酶解后的ESI 低于原蛋白，可能是因?yàn)槊附猱a(chǎn)生的小肽在界面上相互作用的能力降低，從而降低了界面膜的粘彈性。

表2 大米蛋白及酶解產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)分布、乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）Table 2 The secondary structure compositions,emulsifying activity index (EAI) and emulsifying stability (ESI) of samples

大米蛋白經(jīng)三種蛋白酶處理后，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物和胰2%乳化特性較好，但是木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的得率小于胰2%。綜合考慮酶解時(shí)間及得率等因素，結(jié)合能源消耗，本文最終選用胰2%超濾分離得到不同尺寸的分級肽，進(jìn)行高乳化特性酶解產(chǎn)物界面特性和乳液穩(wěn)定性的研究。

2.4 分級肽界面特性的分析

2.4.1 界面張力分析 吸附動(dòng)力學(xué)在研究蛋白質(zhì)乳液形成和穩(wěn)定方面起著重要作用，蛋白質(zhì)吸附到油-水界面上一般包含蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散到界面、在界面上的滲透以及在界面上的結(jié)構(gòu)重排三個(gè)主要階段，對其乳化性質(zhì)有著重要影響。由圖4 可知，隨著時(shí)間的延長，界面張力逐漸降低，這與蛋白質(zhì)吸附在油-水界面上有關(guān)。在吸附初始階段界面張力降低較快，這可能是由于在油水界面上有許多自由吸附位點(diǎn)。而隨著時(shí)間的延長，降低速率減慢。這是因?yàn)槲轿稽c(diǎn)逐漸被肽填充，從而在界面產(chǎn)生更高的空間位阻和能量屏障。界面張力降低將減少界面的吉布斯自由能，增強(qiáng)界面層的穩(wěn)定性。本研究中界面張力最小的為＞10 kDa 組分，由此推測＞10 kDa 可能具有更好的乳化穩(wěn)定性。

圖4 分級肽在油-水界面上界面張力隨時(shí)間的變化Fig.4 The changes of interfacial tension of different graded peptides at the oil-water interface with time

2.4.2 QCM-D 分析 QCM-D 用于分析不同肽在模擬油-水界面上的吸附-解吸行為。如圖5 所示，在吸附過程中頻率迅速下降，耗散急劇增加，這是因?yàn)殡脑谑杷砻嫔系目焖傥剿鶎?dǎo)致的。隨著吸附時(shí)間的延長，頻率和耗散值均變化緩慢，這是肽分子的緩慢吸附導(dǎo)致的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)吸附位點(diǎn)被填滿，部分乳化劑繼續(xù)吸附到已經(jīng)形成的界面層上，形成多層吸附。通入磷酸鹽緩沖液沖洗之后，頻率增加，耗散減小，但并未恢復(fù)原來的值，說明一些吸附較弱的乳化劑分子從界面上被沖洗下來。表3 中樣品的吸附厚度表明，界面膜的厚度隨著肽分子量的增加而增加。界面膜的厚度對乳液的穩(wěn)定性起著重要的作用，界面膜越厚，乳液的穩(wěn)定性越好。在本研究中，＞10 kDa 組分形成了較厚的界面層，因此推測其具有較好的乳液穩(wěn)定性。

表3 沖洗前后吸附厚度和貯藏7 d 后乳液平均粒徑（d3,2）Table 3 Thickness of adsorbed layer both before and after rinsing and mean diameter (d3,2) of emulsions after storage seven days

圖5 樣品吸附和沖洗在疏水金表面過程中頻率和耗散（第三倍頻）隨時(shí)間的變化Fig.5 Frequency and dissipation（of the third overtone）due to samples adsorption and rinsing onto the hydrophobic gold surface as a function of time

2.5 分級肽乳液貯藏穩(wěn)定性的分析

通常，粒徑較小的乳液對液滴聚集和重力誘導(dǎo)的相分離具有更好的抵抗力。由表3 可知，新鮮制備的乳液表面積平均粒徑由大到小依次為＜5 kDa、＞10 kDa 和5～10 kDa，且微觀結(jié)構(gòu)（圖6）表明液滴分布較為均一。儲存7 d 后，乳液平均粒徑均發(fā)生了不同程度得增加，其中＜5 kDa 制備的乳液粒徑變化最大且發(fā)生絮凝。這可能是由于＜5 kDa 組分酶解程度較高，尺寸較小，會降低界面層的厚度和強(qiáng)度，不能有效地抑制液滴聚集，導(dǎo)致乳液失穩(wěn)。通常液滴粒徑越小的乳液，其抵抗液滴聚集和相分離的能力越強(qiáng)，乳液越穩(wěn)定。結(jié)果表明，＞10 kDa 比＜5 kDa 能更有效地形成穩(wěn)定的乳液。

圖6 不同分級肽制備乳液0 d 和7 d 的激光共聚焦圖像（63×）Fig.6 Confocal laser images of emulsion stabilized by different peptides at 0 d and 7 d (63×)

3 結(jié)論

對三種不同蛋白酶處理的大米蛋白酶解產(chǎn)物（水解度為2%和6%）的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，酶解后的蛋白表面疏水性有較大差異，乳化活性顯著增加；酶解使-螺旋和-轉(zhuǎn)角含量增加，-折疊含量降低；相比其他酶解產(chǎn)物，胰2%有較好的乳化特性及得率。對其進(jìn)行分離，得到＜5 kDa、5～10 kDa 和＞10 kDa 三種組分，并探究組分界面特性與乳液穩(wěn)定性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)＞10 kDa 組分的界面張力最低，吸附厚度最大，乳液貯藏穩(wěn)定性最好。因此＞10 kDa 能形成更穩(wěn)定的乳液，這為高乳化性植物蛋白基產(chǎn)品的設(shè)計(jì)提供新思路。