獼猴桃和青菜病原真菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性

李佩琪，江 山，戴 群，衛(wèi) 蔚，林 潔,

（1.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省生物功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210013；2.南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇南京 210094）

果蔬因其富含糖類、維生素及蛋白質(zhì)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但常常會(huì)被病原菌侵染。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由病原菌造成的折損占果蔬生產(chǎn)總折損的50%以上。果蔬中的病原菌包括細(xì)菌、真菌、病毒，它們都能引發(fā)果蔬病害。其中，真菌占病原菌中的70%～80%。目前，植物病原菌的防治方法主要有：使用抗病品種、化學(xué)防治和生物防治。使用果蔬抗病品種可以進(jìn)行有效的防治，但研究周期長(zhǎng)、難度大且抗性易丟失；化學(xué)防治是目前主要手段，但高效低毒的殺菌劑品種少、易造成環(huán)境污染；而生物防治具有良好的防治效果和前景，是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。了解植物病原菌是生物防治的前提。因此，研究植物病原菌的種類及性質(zhì)對(duì)果蔬防腐具有重要意義。

獼猴桃（Planch.）是獼猴桃科獼猴桃屬植物，因其口味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富而受到人們的青睞。然而，獼猴桃果實(shí)貯藏期間易于腐爛，采后腐爛率高達(dá)約35%。一直以來(lái)，有許多學(xué)者致力于獼猴桃病原菌的分離與鑒定，如Romanazzi發(fā)現(xiàn)可以引起的獼猴桃果實(shí)灰霉病，王忠肅等首次發(fā)現(xiàn)pv.是引起獼猴桃潰瘍病的病原菌。Li 等認(rèn)為葡萄座腔菌為獼猴桃軟腐病優(yōu)勢(shì)致病菌。以上研究結(jié)果均表明，獼猴桃腐爛是由多種病原菌引起的，不同地域之間的優(yōu)勢(shì)菌株不盡相同，而大多數(shù)的研究對(duì)于獼猴頭病原菌缺少致病性鑒定方面的實(shí)驗(yàn)。

青菜（var.）隸屬十字花科蕓苔屬（L.），培植歷史悠久，在我國(guó)各地均有栽培，而在江浙滬種植較多。蕓苔屬約含40 多個(gè)種，屬內(nèi)包含許多重要的蔬菜、油料及飼料作物。目前對(duì)該屬中大白菜病害的研究較多，包括霜霉菌引起白菜霜霉病，鏈格孢屬（）真菌引起白菜黑斑病，希金斯刺盤孢菌引起白菜炭疽病，假單胞菌屬細(xì)菌sp.引起白菜角斑病，野油菜黃單胞屬細(xì)菌引起白菜黑腐病，胡蘿卜軟腐果膠桿菌引起白菜軟腐病等。但目前關(guān)于同屬于蕓苔屬的青菜，研究工作主要集中在抗病性品種選育和品性分析方面，對(duì)于其病原菌，尤其是病原真菌的研究很少。

因此，本研究擬對(duì)獼猴桃和青菜這兩種成分不同，但經(jīng)濟(jì)價(jià)值均高的果蔬進(jìn)行病原真菌鑒定，并且對(duì)其病原真菌進(jìn)行致病性及生物學(xué)特性進(jìn)行研究，來(lái)探索不同品種的果蔬之間是否具有共性病原真菌，為果蔬的存儲(chǔ)及病害的防治提供理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 2020 年3 月網(wǎng)購(gòu)自陜西省西安市周至縣的完整且無(wú)病害的獼猴桃，經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)李熠教授鑒定為翠香獼猴桃品種（原代號(hào)西獼9 號(hào)）；青菜2020 年3 月網(wǎng)購(gòu)自安徽省黃山市的完整且無(wú)病害的青菜，經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)李熠教授鑒定為上海青品種；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司；乳酸石碳酸棉藍(lán)染液 南京森貝伽生物科技有限公司；Lysis Buffe、DNA Marker（DL 2000）、Premix Taq

美谷生物科技有限公司；50×TAE 電泳緩沖液、Loading Buffer Solarbio；瓊脂糖 西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；引物ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′）和ITS5（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）南京金斯瑞生物科技有限公司；核酸染料生工生物工程股份有限公司。

SW-CJ-2F 雙人超凈工作臺(tái)、GZX-9240MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DNP61 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；YXQ-LS-70A 立式壓力蒸汽滅菌器 南京博惠科學(xué)儀器有限公司；ESE6539TA 冰柜 海爾有限公司；BSA24S 分析天平 昆山艾思博格電子科技有限公司；DYY-6C 三恒多用電泳儀 北京市六一儀器廠；S1000 PCR 擴(kuò)增儀 Biorad；TGL-16C 臺(tái)式高速離心機(jī) 常州邁科諾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獼猴桃及青菜病原真菌的分離純化 將購(gòu)買的獼猴桃、青菜室溫存放，等待其發(fā)病并觀察發(fā)病情況；取樣：在肉眼可見(jiàn)發(fā)生病害的獼猴桃果皮和青菜葉片的病健交界處切取大小為3 mm×3 mm 的組織塊；消毒：用清水沖洗組織塊，然后在超凈工作臺(tái)下進(jìn)行組織塊消毒（用75%的酒精中消毒30 s；用2%消毒水浸泡消毒30 s；用無(wú)菌水沖洗3～6 次；置于無(wú)菌濾紙上晾干）；分離培養(yǎng)：將消毒處理后的組織塊置于PDA 固體培養(yǎng)基上（添加抗生素），此步驟要確保平板倒置后的組織塊不會(huì)掉落，同時(shí)將最后一次漂洗的無(wú)菌水作對(duì)照，檢驗(yàn)是否消毒合格；純化培養(yǎng)：將培養(yǎng)基置于28 ℃智能生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，待長(zhǎng)出菌落后挑取菌落邊緣少量菌絲，置于PDA 固體培養(yǎng)基中劃線純化，重復(fù)上述步驟，直至獲得單一菌落；保種：將純化后的菌株保存于PDA 斜面培養(yǎng)基上，同上培養(yǎng)直至菌落長(zhǎng)出，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 致病性鑒定 實(shí)驗(yàn)材料為完整且無(wú)病害的獼猴桃和青菜，并且用75%酒精擦拭。用滅菌的針蘸取分離得到的菌株分別刺傷完整且無(wú)病害的獼猴桃和青菜上，每株菌三個(gè)平行。將接種好的獼猴桃和青菜置于滅菌的自封袋中，再放入28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察獼猴桃和青菜的發(fā)病情況。用滅菌的針蘸取0.85%的無(wú)菌生理鹽水刺傷同樣完整且無(wú)病害的獼猴桃和青菜作為空白對(duì)照。

1.2.3 獼猴桃及青菜病原真菌種屬鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：用滴管吸取適量染液（乳酸石碳酸棉藍(lán)）于載玻片上，用解剖針挑取少量菌絲置于染液滴上，隨后將菌絲分散，蓋上蓋玻片，等待2～3 min。再將制作的玻片置于數(shù)碼顯微鏡下40 倍觀察。最后根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》工具書進(jìn)行初步鑒定。

ITS 鑒定：在超凈臺(tái)中用滅菌牙簽挑取肉眼可見(jiàn)的菌體加入到裝有50 μL 的Lysis Buffer 的5 mL離心管中，充分混勻后在80 ℃水浴中孵育15 min，放冰上冷卻。最后將1.5 mL 離心管在12000 r/min條件下離心30 s，取上清液用作菌落PCR 的模板。按照比例加入模板、引物、雙蒸水和Taq 酶，再進(jìn)行菌落PCR。使用1×TAE 緩沖液配制1.0%瓊脂糖，倒入制膠槽內(nèi)，冷卻拔去梳子。點(diǎn)樣孔每孔加入5 μL 的DNA 樣品（含1 μL 的6×DNA Loading Buffer），對(duì)照孔加入5 μL Marker（DL 2000）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。穩(wěn)壓電泳（120 V，100 mA）約30 min。將跑完電泳的瓊脂糖凝膠利用紫外線分析儀觀察、照相。最后將PCR 產(chǎn)物送去南京思普金生物科技有限公司測(cè)序。利用MAGA 6.06 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析并與真菌的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果相互驗(yàn)證。

1.2.4 獼猴桃及青菜病原真菌的生物學(xué)特性研究

1.2.4.1 溫度對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響 將7 株菌分別接種于PDA 培養(yǎng)基的圓心，分別放置于4、10、15、20、25、28 和30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)溫度重復(fù)三次。培養(yǎng)5 d 后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.4.2 pH 對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響 用HCl 和NaOH 將PDA 培養(yǎng)基的pH 調(diào)成4、5、6、7、8、9和10。將7 株菌分別接種于不同pH 的PDA 培養(yǎng)基的圓心。每個(gè)pH 重復(fù)三次。培養(yǎng)5 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著差異性分析用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行，并采用GraphPad Prism 9.0.0 軟件做圖。采用MEGA 6.06 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃和青菜病原真菌的分離和純化

從發(fā)病獼猴桃和發(fā)病青菜分離得到的菌落，純化后得到7 株真菌，分別編號(hào)為M-1、M-2、M-3、M-4、Q-1、Q-2 和Q-3（圖1），其中M-1、M-2、M-3和M-4 從發(fā)病獼猴桃中分離得到，Q-1、Q-2 和Q-3從發(fā)病青菜中分離得到。

圖1 7 株真菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of seven strains of fungi

2.2 致病性鑒定結(jié)果

將從獼猴桃中分離出的病原菌M-1、M-2、M-3 和M-4 用針刺法分別接種于完整且無(wú)病害的獼猴桃上。5 d 后，獼猴桃產(chǎn)生發(fā)病癥狀（圖2A～2D），而對(duì)照組無(wú)發(fā)病情況（圖2E）。將從青菜中分離出的病原菌Q-1、Q-2 和Q-3 用針刺法分別接種于完整且無(wú)病害的青菜上，5 d 后青菜產(chǎn)生發(fā)病癥狀（圖2F～2H），而對(duì)照組無(wú)發(fā)病情況（圖2I）。研究發(fā)現(xiàn)7 株病原菌均能相應(yīng)的引起這兩種果蔬腐爛：接種M-2、M-3 和M-4 菌株的獼猴桃的發(fā)病部位出現(xiàn)黑色水浸狀病斑，果皮著生大量白色絨毛狀菌絲，與原始的發(fā)病癥狀近一致，而接種M-1 菌株的獼猴桃發(fā)病部位呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，果皮消失，并出現(xiàn)少量白色絨毛狀菌絲，與原始的發(fā)病癥狀存在差異；接種Q-1、Q-2 和Q-3 菌株的青菜的發(fā)病部位出現(xiàn)黑色病斑，腐爛部位呈現(xiàn)半透明狀態(tài)。

圖2 7 株病原菌分別接種后獼猴桃和青菜的發(fā)病癥狀Fig.2 The symptoms of kiwifruit and vegetable after inoculation with 7 strains of pathogenic bacteria respectively

2.3 獼猴桃及青菜病原真菌的種屬鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 對(duì)7 株病原菌進(jìn)行顯微觀察（圖3）后發(fā)現(xiàn)，Q-3 和M-3 的顯微特征相似，為同一屬的菌株。其他5 種菌株的顯微特征各異。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》（表1～表2）發(fā)現(xiàn)，這7 株菌為6 種，隸屬2 門、5 目、6 科、6 屬。菌Q-1 和Q-2 都為半知菌亞門，菌Q-3、M-1、M-2、M-3 和M-4 都為盤菌亞門（其中菌M-1 和M-4 同為糞殼菌綱）。

表1 獼猴桃及青菜病原真菌顯微特征Table 1 Microscopic characteristics of pathogenic fungi of kiwifruit and pakchoi

表2 獼猴桃及青菜病原真菌鑒定結(jié)果Table 2 Identification of pathogenic fungi in kiwifruit and pakchoi

圖3 7 株病原真菌的形態(tài)特征Fig.3 Microscopic observation characteristics of seven pathogenic fungi

2.3.2 分子鑒定結(jié)果 病原真菌ITS 片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果：以獲得的7 株病原真菌的基因組DNA 為模板，以ITS4 和ITS5 為通用引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。可以看出PCR 擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度大小為500～750 bp且無(wú)雜帶（圖4），符合測(cè)序要求。

圖4 PCR 擴(kuò)增序列電泳圖Fig.4 Electrophoretic image of PCR amplification sequence

測(cè)序結(jié)果：將經(jīng)公司測(cè)序得到的病原真菌的序列錄入NCBI 進(jìn)行Blast 序列比對(duì)，并將病原真菌的序列與對(duì)比得出的同源性序列在MEGA 6.06 軟件上用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。（圖5）。M-1 位于殼囊孢屬（sp.）分支，M-2 位于波蘭青霉（）分支，M-3 與Q-3 同位于加州灰霉菌（）分支，M-4 位于蓋姆斯木霉（）分支，Q-1 位于圓形鐮刀菌（）分支，Q-2 位于枝孢梭菌（）分支，對(duì)比序列的同源性均達(dá)97%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可判定此次分離得到的獼猴桃病原真菌為殼囊孢屬（sp.）、波蘭青霉（）、加州灰霉菌（）和蓋姆斯木霉（），青菜病原真菌為圓形鐮刀菌（）、枝孢梭菌（）和加州灰霉菌（）。

圖5 7 株病原真菌基于ITS 序列的構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of seven pathogenic fungi based on ITS

2.4 病原真菌生物學(xué)特性研究

2.4.1 溫度對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響 不同溫度對(duì)7 株病原真菌的生長(zhǎng)影響有顯著性差異（＜0.05）。M-1 在10～28 ℃范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)，其余6 株菌在4～30 ℃范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)。并且除M-1 外，其余6 株菌的最適生長(zhǎng)溫度均為20～28 ℃。一般冰箱的冷藏溫度為4 ℃，若蔬果本身帶有病原真菌，冰箱冷藏的溫度并不能防止這些病原真菌侵染蔬果，放入冰箱的冷藏室并不能讓蔬果長(zhǎng)久保鮮，只可能減緩病原真菌侵染的速度（圖6）。

圖6 不同溫度對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the growth of pathogenic fungi

2.4.2 pH 對(duì)病原菌真菌落生長(zhǎng)的影響 不同pH 對(duì)7 株病原真菌的生長(zhǎng)影響有顯著性差異（＜0.05）。除Q-2 外，其余6 株菌株的最適pH 在6～8 之間。Q-2 的耐酸性較好，其最適pH 可能在4 以下。Q-1的耐堿性最好，在pH 為10 的情況下，菌落生長(zhǎng)的直徑平均值為5.5 cm。（圖7）

圖7 不同pH 對(duì)病原真菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of different pH treatments on the growth of pathogenic fungi

3 結(jié)論

本研究對(duì)從發(fā)病獼猴桃和發(fā)病青菜中分離純化得到的菌株進(jìn)行致病性鑒定，發(fā)現(xiàn)這7 株真菌均能夠?qū)?yīng)地引起獼猴桃和青菜腐爛。通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS 鑒定，確定從發(fā)病獼猴桃分離出的4 株病原真菌為殼囊孢屬sp.、波蘭青霉、加州灰霉菌和蓋姆斯木霉，確定從發(fā)病青菜分離出的3 株病原真菌為圓形鐮刀菌、枝孢梭菌和加州灰霉菌。加州灰霉菌可以同時(shí)引起獼猴桃和青菜腐爛，灰霉菌是常見(jiàn)的植物病原真菌，對(duì)于多種果蔬均有危害。在蔬果儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，這類致病菌可以引起大規(guī)模的腐爛，甚至?xí)?dǎo)致多種蔬菜水果同時(shí)腐爛，對(duì)其防治應(yīng)該更加重視。本研究測(cè)定了7 株病原真菌的最適宜的溫度和pH，為獼猴桃和青菜腐病發(fā)生規(guī)律和防治研究奠定了較好的基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明20～28 ℃，pH 為6～8 的條件有利于獼猴桃和青菜的大部分病原真菌生長(zhǎng)。研究還發(fā)現(xiàn)枝孢梭菌的耐酸性較強(qiáng)，最適生長(zhǎng)pH 可能在4 以下。波蘭青霉、加州灰霉菌、蓋姆斯木霉和枝孢梭菌在4 ℃的情況下均可以生長(zhǎng)，并且加州灰霉菌和蓋姆斯木霉生長(zhǎng)較快，說(shuō)明冰箱冷藏的溫度并不能防止這些病原菌侵染蔬果。

綜上所述，本研究對(duì)獼猴桃和青菜腐病病原真菌進(jìn)行分離純化、致病性鑒定、種屬鑒定及生物學(xué)特性的測(cè)定。確定了獼猴桃和青菜的病原真菌的種類和其生物學(xué)特性，本文研究結(jié)果為獼猴桃及青菜病原菌的防治提供參考依據(jù)。