基于溫控近紅外光譜快速檢測泥蚶重金屬污染

周頎偉，宋燕如，張展碩，袁雷明，孫一葉

（溫州大學(xué)電氣與電子工程學(xué)院，浙江溫州 325035）

伴隨著城鎮(zhèn)化、工業(yè)化進(jìn)程的快速發(fā)展，大量有毒有害物質(zhì)隨之產(chǎn)生。對一些缺乏排污管理、清潔技術(shù)保障的地區(qū)，造成嚴(yán)重的環(huán)境、生態(tài)污染，其中重金屬污染是各類污染中最為嚴(yán)重的一種。重金屬污染不僅毒害水產(chǎn)生物，還通過食物鏈濃縮最終進(jìn)入人體，引起中毒反應(yīng)。為應(yīng)對日益嚴(yán)峻的重金屬污染問題，早在2011 年3 月，我國就出臺了第一個“十二五”專項(xiàng)規(guī)劃《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》。溫州地處東南沿海，具有豐富的海洋資源，其中貝類泥蚶富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，口味鮮美，深受當(dāng)?shù)厝罕娤矏?。灘涂養(yǎng)殖、非選擇性濾食習(xí)性的泥蚶，相比其他水產(chǎn)品具有更強(qiáng)的重金屬富集能力，且具有隱蔽性、長期性、累積性等特性，這凸顯了貝類泥蚶在食品安全上的風(fēng)險(xiǎn)地位。因此，開展對貝類重金屬污染信息的檢測，可以評估貝類的品質(zhì)安全性。

目前，重金屬的常規(guī)檢測方法，主要包括物理化學(xué)檢測法（原子光譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法）和生物檢測法（生物傳感器法、酶聯(lián)免疫吸附法）。這些方法檢測靈敏度高，檢測結(jié)果精確，但存在檢測成本高、操作過程復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、有破損等問題。因此，當(dāng)前迫切需要研發(fā)一種能夠適用于多種重金屬污染信息的貝類快速定性、低成本的檢測技術(shù)，提高貝類重金屬污染的監(jiān)測能力。近紅外光譜（780～2526 nm）技術(shù)的出現(xiàn)，為解決此類問題帶來了契機(jī)。它具有靈敏度高、成本低、操作簡單等特點(diǎn)，對含氫官能團(tuán)有著特異性的信號響應(yīng)，能實(shí)現(xiàn)大批量樣本的快速檢測。對生物制品而言，由于多種含氫基團(tuán)能產(chǎn)生光譜共軛響應(yīng)，特別是O-H、N-H 等官能團(tuán)二級倍頻、三級倍頻等信號疊加響應(yīng)，使得一些結(jié)構(gòu)相近或濃度低的生物組分光譜信息難以解析。鑒于此，一種基于溫控紅外光譜的檢測技術(shù)被提出，它是調(diào)控樣品溫度引起物質(zhì)組分微觀結(jié)構(gòu)變化，使分子振動能級躍遷所需光子頻率發(fā)生變化，導(dǎo)致光譜吸收信息差異化。孫巖等以溫度作為擾動因子，探究了溫度梯度變化下液體組分的微觀結(jié)構(gòu)及紅外光譜信息的相應(yīng)變化，提出“水光譜組學(xué)”的概念，并對模擬血清中的葡萄糖含量進(jìn)行精確檢測。另外，為降低溫度影響，在酒精濃度、煙草植物堿、水果品質(zhì)等檢測中引入溫度校正模型來開展應(yīng)用，降低檢測誤差，增強(qiáng)了紅外光譜技術(shù)的精準(zhǔn)分析能力。目前，溫控光譜技術(shù)還未在水產(chǎn)品重金屬污染的檢測中進(jìn)行探究。

本工作利用蛋白酶解技術(shù)對重金屬污染的泥蚶進(jìn)行全蛋白提取，調(diào)節(jié)溫度梯度變化分別來獲取近紅外光譜信息，借助模式識別來區(qū)分各種重金屬污染的泥蚶，旨在提供一種能夠快速鑒別重金屬污染泥蚶的光譜判別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品泥蚶（）試驗(yàn)人工養(yǎng)殖；PbCl、CdCl、CuSO分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；全蛋白試劑 Sigma 公司；玻璃水族箱 尺寸：60 cm×50 cm×40 cm；比色皿 量程2 mm；塑料密封袋 50 mm×70 mm。

ML204T/02 電子天平 德國梅特勒托利多公司；TGL-12GB-C 高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；VS-35S 手持式勻漿器 無錫沃信儀器制造有限公司；Bruker Vertex 70 臺式光譜儀 德國布魯克公司；卡薩帝BCD-500WL 冰箱、DW-86L959BPT超低溫保存箱 海爾集團(tuán)；M-Cube-T 溫控儀器 上海熒颯光學(xué)儀器有限公司；VX200-T 旋渦振蕩器美國MET 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泥蚶脅迫養(yǎng)殖 參照貝類養(yǎng)殖技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（DB37/T 2069-2012）方法，由技術(shù)人員在同時(shí)養(yǎng)殖健康對照組和重金屬脅迫組的泥蚶。分別配置不同濃度的Pb（0.611～1.833 mg/L）、Cd（0.545～1.634 mg/L）、Cu（20～100 mg/L）重金屬溶液于消毒后的水族箱，控制溫度（20.8±2.6 ℃）、酸度（8.05±0.1）、鹽度（2.1%）、溶氧量（＞6 mg/L）、水流（3 L/h）等參數(shù)模擬海洋環(huán)境養(yǎng)殖泥蚶，培養(yǎng)7～14 d，使其體內(nèi)富集不同含量的重金屬。將同一水族箱內(nèi)的養(yǎng)殖泥蚶，每5～7 個泥蚶作為一組，去殼取肉、袋包裝密封，作類別標(biāo)記，于-18 ℃冰箱冷凍保存。收集的4 類樣本包括：Pb、Cd、Cu 單一重金屬污染樣本和健康樣本；每一類樣本集收集15 個密封袋，共60 個密封袋泥蚶樣本。

1.2.2 蛋白提取方法 從冰箱冷凍室取出密封袋，泥蚶肉質(zhì)解凍后，經(jīng)剪刀剪碎、小型手持式勻漿器進(jìn)一步磨細(xì)。參考文獻(xiàn)[23]配比各試劑濃度，制作全蛋白試劑提取盒。電子天平準(zhǔn)確稱取100 mg 樣品置于1.5 mL 的離心管中，每個密封袋制作4 個平行樣（用于擴(kuò)展樣本），將全蛋白試劑0.1 mL 分別注入各離心管中，于振蕩器上搖晃10 min 至大部分顆粒溶解；8000 r/min 高速離心2 min 后，取上層清液于離心管，置于-80 ℃冰箱保藏，防止提取的蛋白結(jié)構(gòu)被破壞。在本試驗(yàn)操作過程中，所有樣品的用具及試劑均需要預(yù)冷至0 ℃使用。經(jīng)樣品平行擴(kuò)展后，每個類別有60 個小樣（即15×4），其中每個類別的前40個小樣作為訓(xùn)練集，后20 個小樣作為預(yù)測集。

1.2.3 光譜采集 臺式光譜儀（波數(shù)范圍是4000～12000 cm，分辨率是2 cm）開機(jī)預(yù)熱10 min，設(shè)置溫控儀器的溫度25 ℃升溫至60 ℃，間隔為5 ℃，共計(jì)8 個溫度梯度。移液槍從離心管吸取0.2 mL樣品液于比色皿內(nèi)（量程2 mm），插入溫控儀器的樣品池中，1 min 受熱穩(wěn)定后，掃描其透射光譜信息；取出該比色皿振蕩2 s 后，再次測量其光譜。重復(fù)測量3 次后，該比色皿加蓋保存至冰箱-18 ℃，待下一個溫度梯度點(diǎn)再取出采集光譜信息。取3 次透射光譜的平均值作為樣本當(dāng)前溫度的透射光譜。在每個溫度梯度點(diǎn)，采集完所有樣本的光譜信息后，再升溫至下一個溫度梯度點(diǎn)進(jìn)行采集。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理與建模分析

形成樣本×波數(shù)×溫度對應(yīng)的三維光譜數(shù)據(jù)塊，溫度維度對應(yīng)8 個梯度點(diǎn)；波數(shù)維度即近紅外光譜的變量個數(shù)；樣本維度共240 個，存在4 個類別，每個類別為60 個樣本，其中前40 個劃分到訓(xùn)練集，后20 個劃分到預(yù)測集；于是，訓(xùn)練集有160 個樣本，預(yù)測集有80 個樣本。

在常規(guī)的數(shù)據(jù)處理中，線性判別為常用的分類方法，但光譜變量多，存在共線性問題。本文以偏最小二乘-判別法（Partial Least Squares-Discriminant Analysis，PLS-DA）來壓縮光譜空間投影，對泥蚶樣本的污染信息進(jìn)行線性判別區(qū)分。模型的分類評價(jià)指標(biāo)主要為精準(zhǔn)率（Precision）、敏感性（Sensitivity）、特異性（Specificity）。由于光譜變量數(shù)較多，后續(xù)擬通過變量篩選方法來選出對溫度敏感的光譜特征變量，本文以競爭自適應(yīng)重加權(quán)算法（Competitive Adaptive Reweighting Sampling，CARS）、無信息變量剔除法（Uninformative Variable Elimination，UVE）、遺傳算法（Genetic Algorithm，GA），作為PLS-DA 分類器的前端變量篩選方法。所有數(shù)據(jù)于MATLAB（2018b，Mathwork Inc.）處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜曲線分析

圖1 為25 ℃時(shí)各類泥蚶樣本的近紅外平均吸收光譜圖，光譜曲線平緩，無明顯的吸收脈沖峰，且變化趨勢一致；在短波段的近紅外區(qū)域8500～12000 cm之間光譜波峰強(qiáng)度差異變大；在長波近紅外光譜區(qū)域4000～7200 cm之間表現(xiàn)平緩，僅在6000 cm存在一個微小波峰，可能是由于近紅外光譜區(qū)域受到C-H、O-H 官能團(tuán)的二級倍頻、三級倍頻重疊吸收效應(yīng)的影響，由于比色皿內(nèi)樣本含水率較高，致使透射信號衰減。因此，在應(yīng)用中應(yīng)盡可能地降低水分干擾，或是通過光譜軟件設(shè)置去除水吸收峰區(qū)域。本文是為避免脫水方式影響酶解蛋白的生物結(jié)構(gòu)，采取軟件設(shè)置方式去除水分干擾。

圖1 四類泥蚶樣本25 ℃時(shí)的近紅外平均透射光譜Fig.1 The averaged transmittance of NIR at termperature of 25 ℃for four classes of Tegillarca granosa samples

圖2 為不同溫度下所有樣本的平均透射光譜。隨著溫度的升高，樣品內(nèi)水分子之間形成簇狀體的范德華力變小，光譜的透射強(qiáng)度在6000 cm波峰處依次增加，但是在光譜區(qū)域8000～12000 cm范圍內(nèi)，各溫度下的平均光譜強(qiáng)度增減幅度不一，特別是在波谷8500 cm處譜線趨勢發(fā)生變化、在波段9000～11000 cm范圍內(nèi)交叉，說明在升溫過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)受熱發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其吸收光學(xué)特性的變化。

圖2 不同溫度下的泥蚶樣本平均透射光譜Fig.2 The averaged transmitted spectra of Tegillarca granosa samples at different temperatures

2.2 基于PLS-DA 的泥蚶污染判別

所有泥蚶樣本類別分別設(shè)為標(biāo)簽號1（健康組），2（鎘污染），3（銅污染），4（鉛污染）。將訓(xùn)練集中同一溫度下樣本透射光譜作為輸入項(xiàng)，標(biāo)簽號作為輸出項(xiàng)，訓(xùn)練偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）分類器，再以預(yù)測集來驗(yàn)證所建分類器的可行性，得到準(zhǔn)確率指標(biāo)；并以此方法構(gòu)建其他溫度下的PLS-DA 分類器，結(jié)果如圖3 所示。相同的樣品采集及處理方法，不同溫度下泥蚶類別分類準(zhǔn)確率各不相同，波動較大，準(zhǔn)確率從室溫25 ℃的51%逐漸提高到40 ℃時(shí)的最高準(zhǔn)確率92%，此后溫度區(qū)間劇減至50%左右。由于溫控光譜是處于一個溫度升高的過程，據(jù)此推測：溫度在逐步升溫至40 ℃時(shí)，重金屬離子、酶解蛋白、水分子之間可能形成的絡(luò)合物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，再結(jié)合圖2 的光譜強(qiáng)度變化，可知它們的光譜吸光頻率及強(qiáng)度發(fā)生了變化，而這些變化則有益于區(qū)分不同重金屬離子的絡(luò)合物。但是在40 ℃后繼續(xù)升溫，光譜識別率卻劇減至一個低的數(shù)值區(qū)間，表明此階段的溫度變化對重金屬絡(luò)合結(jié)構(gòu)影響減小，是由于溫度過高導(dǎo)致原先的酶解蛋白變性、絡(luò)合物結(jié)構(gòu)破壞，且這些絡(luò)合物結(jié)構(gòu)變化不利于光譜識別；再結(jié)合圖2光譜區(qū)域（9000～12000 cm）的變化分析，在升溫的后半程（≥ 45 ℃），透射光譜的變化趨勢差異減小，其幅度正小于升溫的前半程。因此認(rèn)為，在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)分析下，40 ℃時(shí)泥蚶酶解蛋白提取液中絡(luò)合物空間結(jié)構(gòu)最有益于光譜表征，是測量重金屬污染的最佳溫度。

圖3 PLS-DA 各溫度下的分類準(zhǔn)確性Fig.3 Classification accuracy of PLS-DA at different temperatures

表1 列出了40 ℃時(shí)泥蚶樣本的預(yù)測分類結(jié)果。健康組泥蚶樣本預(yù)測集的分類準(zhǔn)確性達(dá)到73%，受重金屬Cd、Pb 污染的脅迫泥蚶樣本的預(yù)測集準(zhǔn)確性能達(dá)到100%，對加入重金屬Cu 脅迫樣本的預(yù)測集準(zhǔn)確性達(dá)到94%，總體識別準(zhǔn)確率為92%。從表中可知，對于健康泥蚶，有27%的樣本被誤判為重金屬污染；而對于被污染的樣本，基本都判別正確。

表1 40 ℃ PLS-DA 分類結(jié)果Table 1 Classsification results of 40 ℃ PLS-DA

2.3 基于變量篩選的PLS 建模分析

經(jīng)光譜儀器獲取的一維光譜共有2074 個波數(shù)點(diǎn)，數(shù)據(jù)量偏大，從圖1、圖2 可見，在區(qū)間4000～7200 cm之間表現(xiàn)平緩且光譜強(qiáng)度差異極小，不隨溫度變化，說明此區(qū)域受溫度影響可以忽略，此區(qū)域的光譜信息對于識別重金屬污染分析并不重要；另外，由于相鄰光譜變量間存在共線性問題，會降低模型的計(jì)算精度。因此，有必要對特定溫度下的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行變量篩選。本文選用CARS、UVE、GA 三種方法進(jìn)行變量篩選，以各類別的標(biāo)簽號作為定量擬合目標(biāo)，依據(jù)預(yù)測標(biāo)簽值就近歸屬標(biāo)簽類別。

以樣本被加熱恒溫至40 ℃時(shí)獲取的光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)均值化光譜預(yù)處理后，再以變量篩選方法降低數(shù)據(jù)維度。運(yùn)行變量篩選程序時(shí)，參數(shù)設(shè)置參考文獻(xiàn)[7-8]；對于UVE、GA 算法，則連續(xù)運(yùn)行10 次降低隨機(jī)波動，取其中最好的一次運(yùn)行結(jié)果予以記錄，用于后續(xù)分析。各模型的分類結(jié)果如表2 所示。經(jīng)篩選后的變量，PLS 建模后得到的分類結(jié)果得到了不同程度的提高，且篩選的變量數(shù)量接近，均低于100 個波數(shù)點(diǎn)，是原數(shù)量的5%以內(nèi)；其中CARS 處理后建模效果最好，達(dá)到了98%的準(zhǔn)確率；而GA 處理后模型識別效果卻有所降低，這可能是GA 在處理光譜共線性問題有待進(jìn)一步提供，且擬合目標(biāo)值取整有關(guān)，篩選變量過少，未能達(dá)到光譜數(shù)據(jù)的優(yōu)化目的。因此，認(rèn)為CARS 與UVE 可適用于非常規(guī)溫度下的光譜數(shù)據(jù)變量篩選。

表2 40 ℃溫度下光譜變量篩選后建模分類結(jié)果Table 2 Modeling classification results by variable selection at temperature of 40 ℃

對于光譜技術(shù)識別泥蚶重金屬污染的問題，在文獻(xiàn)[25]中進(jìn)行冷凍烘干、磨粉、壓片等預(yù)處理，以紅外光譜捕捉潛在的重金屬-蛋白絡(luò)合物，優(yōu)化模型92%的分類準(zhǔn)確率低于本工作最優(yōu)的98%分類準(zhǔn)確率。由于重金屬離子在泥蚶體內(nèi)含量較低，在中紅外指紋圖譜中的信息極少。鑒于重金屬離子包含于壓片樣本，文獻(xiàn)[26-27]借助金屬直接測量方法：激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)，捕獲重金屬的激發(fā)譜線，但是泥蚶有機(jī)樣本的基體效應(yīng)影響，識別精度與中紅外光譜的識別率接近。而本文則通過蛋白酶解與離心，盡可能地富集重金屬離子，并以液體狀態(tài)檢測，并探尋最適溫度充分展開重金屬離子-蛋白絡(luò)合的空間結(jié)構(gòu)，使得近紅外光譜能捕獲不同重金屬蛋白絡(luò)合物之間的差異。若進(jìn)一步減少離心液中的水分，可嘗試具有指紋圖譜特性的中紅外光譜檢測。

3 結(jié)論

本文以控溫近紅外光譜技術(shù)定性識別重金屬污染的泥蚶樣本，其肉質(zhì)經(jīng)過細(xì)磨、酶解、離心等預(yù)處理操作提取上清蛋白液，在近紅外光譜（7200～12000 cm）呈現(xiàn)出微小差異，以PLS-DA 方法對污染類別進(jìn)行區(qū)分，在接近室溫25 ℃時(shí)分類準(zhǔn)確率僅為51%；通過調(diào)節(jié)蛋白測試液的溫度，可改變重金屬離子、水分子、酶解蛋白之間的絡(luò)合結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光譜吸光度差異化；在上清蛋白液恒溫至40 ℃時(shí)具有很好的光譜表征特性，PLS-DA 模型的識別率達(dá)到92%，經(jīng)變量篩選后進(jìn)一步提高到98%。另外，不同溫度之間光譜信息的聯(lián)動變化，可結(jié)合二維相關(guān)光譜解析技術(shù)進(jìn)一步研究，尋找溫度敏感的特征區(qū)域。