和曉明，Sameeullah MEMON，劉興能，岳 丹，鄧衛(wèi)東，席冬梅*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，云南 昆明 650031)

牛海綿狀腦病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)，也被稱為“瘋牛病”，是一種發(fā)生在牛上的傳染性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)，自英國暴發(fā)后傳遍了英國的牧場，并進入食物鏈，嚴重威脅著人類健康。BSE是具有傳染性和遺傳性的致命神經(jīng)退行性疾病，由異常折疊的朊病毒(protease-resistant infectious protein, PrP)誘導宿主中正常和非感染性的朊蛋白(cellular prion protein, PrP)轉(zhuǎn)化為非正常和傳染性的致病性PrP朊病毒構象。研究表明，敲除PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠可以抵抗朊病毒，動物體內(nèi)PrP減少可以抵抗BSE。在正常生物體內(nèi)PrP是一種高度保守并廣泛表達的糖蛋白，介導細胞增殖、分化和惡性變異，干預多條與腫瘤形成有關的信號通路，若完全缺失PrP可能會帶來一些副作用。編碼PrP的基因是個高度保守的基因，不同物種間的PrPmRNA序列不相同，甚至同一物種的不同個體中PrP氨基酸序列也有差別，眾多研究認為人和多種動物TSEs的發(fā)生與基因多態(tài)性有關。第1內(nèi)含子12 bp序列和啟動子區(qū)23 bp序列的插入/缺失(InDel)多態(tài)性影響著基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，12 bp InDel與轉(zhuǎn)錄子SP1相關，23 bp InDel與轉(zhuǎn)錄因子阻遏蛋白58(RP58)相關，這兩位點的插入/缺失多態(tài)與BSE的抗性(或易感性)顯著相關。報告基因分析顯示兩個假定的轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，等位基因23 bp插入(insertion，ins(+))/12 bp缺失(deletion，del(-))的表達水平低于23 bp del/12 bp del，12 bp del導致表達水平顯著降低，有這些缺失的牛，因缺乏其各自調(diào)控元件的結(jié)合位點，更容易感染經(jīng)典的BSE。本研究通過比較云南中甸3種地方品種?；?2 bp和23 bp位點的InDel多態(tài)性，以及對延髓組織中基因mRNA的表達量測定，進一步對中甸地區(qū)牛BSE的易感性進行分析，為牛的抗病育種提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

562頭中甸牦牛、377頭中甸犏牛和368頭中甸黃牛的DNA樣品采自迪慶州香格里拉市屠宰場。動物組織DNA提取試劑盒、2×PCR Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，Ⅱ內(nèi)切酶購自Fermentas公司，總RNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司，熒光定量試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 PCR擴增

DNA提取試劑盒提取3種牛樣本中的總DNA，取1 μL進行PCR擴增，采用全式金的2×PCR Mix反應體系進行擴增。PCR反應體系總體積為20 μL(1 μL樣本、17 μL Mix、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL)；樣品94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、56(12 indel)/58(23 indel)℃退火45 sec、72 ℃延伸1 min的條件下進行38個循環(huán)，反應完后在72 ℃延伸7 min，整個體系反應結(jié)束后4 ℃保存。每個樣品都電泳檢測或送出到生工(上海)生物公司進行測序。將獲得的目的序列與GenBank上的序列進行比對并分型。PCR引物見表1。

表1 各基因PCR引物及相關信息

1.3 PRNP基因23 bp和12 bp等位基因插入/缺失多態(tài)檢測

1.3.1 第1內(nèi)含子區(qū)域12 bp插入/缺失的多態(tài)鑒定基因第1內(nèi)含子區(qū)域12 bp目的基因短不易電泳判斷，該區(qū)域內(nèi)有1個Ⅱ限制性內(nèi)切酶的識別位點5'-CCGC↓GG-3'，故采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術，對擴增的目的片段酶切處理，消化切割成不同大小片段。酶切產(chǎn)物的電泳檢測：用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(120 V，1 h)和凝膠成像儀拍照并分析條帶，統(tǒng)計結(jié)果，對第1內(nèi)含子區(qū)域12 bp插入/缺失進行分型。

1.3.2 啟動子區(qū)域23 bp插入/缺失的多態(tài)鑒定 對基因啟動子區(qū)域23 bp的PCR產(chǎn)物采用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(60 V，3 h)，凝膠成像儀拍照并分析條帶，統(tǒng)計結(jié)果，進行啟動子區(qū)域23 bp插入/缺失多態(tài)性的分型。電泳無法分析的PCR產(chǎn)物樣品送至生工(上海)生物工程測序。

1.4 實時熒光定量PCR

建立基因和基因標準曲線。反應體系組成見表2，混勻離心后的反應物在Bio-RadiCycler熒光定量PCR儀上進行Real Time PCR反應，以擬合標準曲線。進行溶解曲線分析，抽取熒光定量PCR產(chǎn)物進行電泳分析其多態(tài)性，判斷反應產(chǎn)物是否是目的條帶，有無引物二聚體。反應程序：95 ℃ 30 sec；95 ℃ 5 sec，57 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，40個循環(huán)。

表2 實時熒光定量反應體系

2 結(jié)果與分析

2.1 朊蛋白基因23 bp和12 bp插入/缺失的檢測

基因啟動子區(qū)域23 bp插入/缺失相差23個堿基，缺失純合基因型在130 bp處有1個條帶，插入純合基因型條帶在153 bp處，雜合基因型在130 bp和153 bp處各有1個條帶(圖1A)；第1內(nèi)含子區(qū)域12 bp缺失純合基因型在414 bp處有條帶，插入純合基因型被酶切后在276 bp和150 bp各1個條帶，雜合基因型在414、276 bp和150 bp處各有1個條帶(圖1B)。

圖1 PRNP基因23 bp(A)、12 bp(B)插入/缺失的電泳檢測

基因23 bp和12 bp序列圖的峰值單一，且基因23 bp插入、23 bp缺失、23 bp雜合、12 bp插入、12 bp缺失和12 bp雜合缺失6種基因序列特征明顯(圖2)。

圖2 23 bp(A)和12 bp(B)插入/缺失的序列檢測

2.2 朊蛋白基因23 bp和12 bp插入/缺失的基因頻率和基因型頻率

中甸牦牛的23 bp indel缺失純合(-/-)基因型頻率最高(0.838)，插入等位基因頻率極低，中甸犏牛(0.467)和黃牛(0.399)的缺失基因型(-/-)頻率也高于插入純合(+/+)和雜合(+/-)基因型頻率，中甸牦牛缺失等位基因頻率(0.91)顯著高于中甸犏牛(0.588)和中甸黃牛(0.594)；而在12 bp InDel中，3種牛的最高基因型頻率為插入純合(+/+)，缺失等位基因頻率均較低(表3)。結(jié)果表明在3種牛中23 bp 的缺失和12 bp的插入比例較高，頻率基本呈現(xiàn)出中甸牦牛>中甸犏牛>中甸黃牛的現(xiàn)象。

表3 牛23 bp和12 bp插入/缺失的基因頻率和基因型頻率

2.3 朊蛋白基因23 bp和12 bp插入/缺失的單倍型構建

采用SHEsis軟件包(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)對啟動子區(qū)域的23 bp和第1內(nèi)含子區(qū)域的12 bp多態(tài)位點進行單倍型構建，結(jié)果表明，3種中甸地方牛中雜合的單倍型頻率較高，中甸牦牛和中甸犏牛單倍型均以2312為主，頻率為0.794和0.444，而中甸黃牛為2312，頻率為0.434；中甸犏牛和中甸黃牛的次要單倍型為2312，頻率為0.392和0.332，所占的比例也較高(表4)。

表4 牛PRNP基因23 bp和12 bp位點插入/缺失單倍型頻率

2.4 PRNP mRNA在3種牛延髓組織的表達

RNA提取物28S、18S和5S 3條帶均清晰，RNA條帶未降解無DNA污染(圖3)，RNA百倍稀釋后，總RNA濃度在0.9 g/L以上，所提取的RNA有較好的純度和濃度。RT-PCR擴增結(jié)果，除目標條帶之外沒有非特異性條帶，沒有引物二聚體，且目的條帶清晰明亮，說明參與反應的模板質(zhì)量很好，基因和基因的引物設計、合成準確，反應條件已優(yōu)化到最佳。

圖3 部分樣品總RNA點樣圖片

在分別對中甸牦牛、中甸犏牛和中甸黃牛這3種牛的不同性別、年齡、毛色的延髓組織基因表達量檢測后，結(jié)果表明不同性別、年齡和毛色牛延髓組織中基因的mRNA表達量不存在顯著差異(>0.05)(表5)。

表5 不同性別、年齡和毛色牛中延髓組織PRNP基因的表達

對3種牛23 bp(表6)和12 bp(表7)InDel基因型的基因mRNA表達量測定結(jié)果表明，23 bp缺失基因型(-/-)在3種牛基因mRNA表達量最高，23 bp的缺失增加了PRNP表達；而在12 bp中，缺失基因型(-/-)在中甸牦牛表達量最高，在中甸犏牛中雜合基因型(+/-)表達高，而在中甸黃牛中12 bp插入基因型(+/+)表達量最高。但由于樣本數(shù)量差異較大，故標準差()較大，統(tǒng)計結(jié)果顯示23 bp +/-基因型對在延髓的表達量差異均不顯著(>0.05)。

表6 23 bp插入/缺失基因型對3種牛PRNP基因mRNA表達量的影響

表7 12 bp插入/缺失基因型對3種牛PRNP基因mRNA表達量的影響

由表8可以看出，中甸牦牛中--/--單倍型的表達量高，中甸犏牛中+-/--單倍型表達量高，中甸黃牛+-/+-單倍型表達量高。由于標準差(SD)較大，23 bp和12 bp插入/缺失位點組成的單倍型在延髓的表達量差異不顯著(>0.05)，在中甸黃牛中有+-/++和--/+-這兩個中甸牦牛和犏牛沒有的單倍型。

表8 不同單倍型對PRNP基因在3種牛延髓組織中mRNA表達量的影響

3種牛23 bp和12 bp的不同基因型和單倍型之間的mRNA表達量差異均不顯著(>0.05)，可能與不同基因型mRNA表達量測定時獲得的樣品量差異太大有關。但中甸牦牛的23 bp和12 bp及中甸犏牛和中甸黃牛的23 bp均表現(xiàn)為插入基因型的mRNA表達量低于相關缺失基因型，同時中甸牦牛的單倍型++/++的表達量也低于--/--。這與家養(yǎng)牛關于23 bp純合子插入基因型通過降低的表達可以增加對BSE的抗性的趨勢一致。因此可以利用23 bp和12 bp的插入缺失多態(tài)位點來評價非家養(yǎng)牛的BSE抗性。

3 討 論

中甸牦牛、犏牛、黃牛是生長于迪慶藏族自治州的優(yōu)良地方品種，能良好適應高海拔、氣候寒冷環(huán)境，有較強的抗病力。本研究通過分子克隆技術和酶切技術，鑒定中甸牦牛、中甸犏牛、中甸黃?；騿幼訁^(qū)域23 bp和第1內(nèi)含子區(qū)域12 bp的InDel多態(tài)，同時對3種牛的基因表達量進行分析驗證，檢測3種中甸地方品種牛性別、年齡、毛色的延髓組織內(nèi)基因表達變化，結(jié)果表明所有檢測樣品獲得的標準S形曲線C值無顯著差異，說明延髓組織中PrPmRNA表達量在不同性別、年齡、毛色牛中差異不顯著。

以往研究表明，12 bp插入和23 bp插入多態(tài)性都增加了對BSE抗性，健康牛的23 bp插入高于感染BSE的牛，12 bp和23 bp缺失的等位基因、基因型和12del-23del單倍型與典型的BSE易感性增加有關。在土耳其3種地方品種牛研究中發(fā)現(xiàn)12 bp InDel高頻率的插入與BSE的低易感性有關。盡管樣本數(shù)量不同，許多品種牛中12 bp和23 bp 缺失的等位基因頻率較高，日本荷斯坦牛的缺失頻率最高，12 bp為74%，23 bp在79%。波蘭荷斯坦奶牛中缺失頻率也較高12 bp為54%，23 bp為63%。相反的是，在水牛的研究中，12 bp和23 bp InDel的缺失等位基因頻率異常的低，在BSE暴發(fā)的歐洲也沒有報道過感染BSE的水牛，認為水牛因12 bp和23 bp高插入等位基因頻率，對BSE有較高抗性。在本研究中，中甸牦牛的23 bp缺失基因型(-/-)頻率最高(83.8%)，其次是中甸犏牛(46.7%)和中甸黃牛(39.9%)；而在12 bp InDel中，中甸牦牛(76.7%)插入基因型(+/+)頻率最高，中甸犏牛71.4%，中甸黃牛62.1%。與Qing等對南陽牛的研究結(jié)果相似，在南陽牛中，23 bp InDel缺失純合基因型(-/-)的個體占優(yōu)勢，12 bp InDel插入純合基因型(+/+)的個體較多，并認為23 bp的缺失削弱了RP58與啟動子的結(jié)合，12 bp InDel插入可以通過結(jié)合Sp1增強的高表達，23(-/-)12(+/+)基因型可能增強表達。

基于單倍型的方法能夠更好的捕獲突變的原因，單倍型研究可以更好闡明indels和特定性狀之間的關系。23ins-12ins單倍型在健康的瑞士牛中出現(xiàn)的頻率為46%，在感染BSE的牛中出現(xiàn)的頻率為37%。BSE抗性的單倍型(23ins-12ins)在英國荷斯坦牛的比例為24%，在德國荷斯坦牛的比例為30%，在德國布朗牛的比例為45%，在弗萊克維耶赫牛的比例為27%，在波蘭荷斯坦奶牛中比例為27%。趙卉等對中國地方水牛的研究顯示水牛以23ins-12ins單倍型為主(92.8%)。在檳榔江水牛中，23ins-12ins單倍型最多，頻率為94.5%。大額牛中，23del-12del單倍型低于水牛和牦牛，認為大額牛比起水牛和牦牛更能抵抗BSE。12 bp缺失的等位基因和23del-12del單倍型均在受感染的動物中更常見。認為單倍型23del-12del與BSE的發(fā)病率有關，在普通牛中很常見，而在印度尼西亞、泰國牛和水牛中23ins-12ins是主要的單倍型，對典型BSE的易感性較低。由于23del-12ins和23ins-12ins單倍型都與BSE抗性同等相關，12 bp InDel被認為是BSE抗性的基本組成。一些研究表明，23 bp InDel是影響B(tài)SE易感性的主要因素，而一些研究表明12 bp的InDel是主要因素。整體上認為，PrP表達水平低的牛在抗BSE方面具有優(yōu)勢，增加12 bp和23 bp插入等位基因的頻率將提高對BSE的抗性。

除了控制疾病，基因突變還影響著健康反芻動物的生產(chǎn)性狀，如乳用性狀、繁殖性能、生長性狀。因此，可通過對多態(tài)性位點選擇來加快經(jīng)濟育種的進程。本研究揭示了3種基因型、6種單倍型在3種牛中的比例和趨勢，這些結(jié)果可能有助于了解地方品種?；虻倪z傳特征，分析這3種牛的抗病力，為培育抗BSE牛提供理論依據(jù)和分子標記。

4 結(jié) 論

本研究中，中甸牦牛、中甸犏牛和中甸黃牛的23 bp InDel缺失等位基因頻率和基因型頻率都是最高的，而在12 bp InDel中，缺失等位基因頻率和基因型頻率均較低；中甸牦牛和中甸犏牛單倍型均以2312為主，中甸黃牛以2312為主，對比以往認為的BSE抗病單倍型2312，可通過育種改良、高效準確的個體篩選，培育出對BSE有較強抗病性的群體，來減少BSE的感染風險。迄今為止，中國尚未發(fā)生BSE，但隨著中國市場經(jīng)濟的發(fā)展、對國際動物及動物產(chǎn)品需求的增長，時刻存在BSE傳入的風險，而選擇抗性基因型被認為是避免朊病毒病的策略之一，所以開展本病的研究工作，對診斷、鑒別診斷以及防治具有十分重要的意義。