張英濤，張宗源，馮印印，岳丹丹，安德榮，陳國(guó)參*

(1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì)，豬糞污年產(chǎn)量約18×10t，占畜禽糞污總量的47%。豬糞、豬尿和養(yǎng)殖污水對(duì)水、土壤和空氣質(zhì)量均造成不利影響，其中以養(yǎng)殖場(chǎng)糞污產(chǎn)生的臭氣污染尤為突出，嚴(yán)重危害到飼養(yǎng)人員、周邊居民的日常生活及身心健康，同時(shí)也嚴(yán)重危害畜禽健康以及生產(chǎn)能力，臭氣治理已經(jīng)成為生豬養(yǎng)殖業(yè)急需解決的關(guān)鍵問題之一。生豬養(yǎng)殖場(chǎng)臭源主要成分有氨氣(NH)、硫化氫(HS)等，這些物質(zhì)易溶于水，當(dāng)吸附到人和動(dòng)物呼吸道黏膜，會(huì)導(dǎo)致呼吸道疾病和其它病癥。目前養(yǎng)殖場(chǎng)除臭方法主要包括化學(xué)法、物理法和生物法。由于生物除臭具有高效、環(huán)保、低成本、無毒性、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地用在養(yǎng)殖場(chǎng)除臭方面，應(yīng)用前景廣闊。生物除臭法的有效手段是使用微生物除臭劑，微生物除臭劑的關(guān)鍵在于高效除臭微生物的篩選，由于微生物特異性等原因，效果各有差異，如邵栓等選用具有除臭功能的貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和干酪乳桿菌4種微生物菌種復(fù)配去除NH和HS；成鋼等以新鮮蚯蚓糞為材料篩選出6株具有除NH和HS的微生物用來去除羊糞臭氣。俞潔雅等以土壤為材料，通過NH選擇性培養(yǎng)基篩到的煙曲霉菌。李玥等以雞糞堆肥為材料，分離到芽孢桿菌屬、貝萊斯芽孢桿菌、耐寒短桿菌、木糖葡萄球菌和變異棒桿菌。這些研究報(bào)道大多集中于高效除臭菌株的分離與篩選，實(shí)際應(yīng)用于養(yǎng)殖場(chǎng)的不多，也少見相關(guān)生物除臭劑急性毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)的報(bào)道，同時(shí)文獻(xiàn)中的微生物除臭劑在實(shí)驗(yàn)室條件下，大多需要較長(zhǎng)時(shí)間堆積發(fā)酵才能達(dá)到高效除臭效果。

本研究將已篩選出的有益菌制備的復(fù)合微生物除臭劑應(yīng)用于豬養(yǎng)殖場(chǎng)，對(duì)其糞污進(jìn)行短時(shí)間處理，以豬糞臭氣主要成分NH和HS釋放量為研究指標(biāo)，來評(píng)價(jià)其對(duì)豬排泄物發(fā)酵釋放的惡臭氣味的去除能力，同時(shí)對(duì)該生物除臭劑進(jìn)行小鼠和家兔急性毒性檢測(cè)等毒理學(xué)評(píng)價(jià)，為豬養(yǎng)殖場(chǎng)糞污臭氣的高效處理、環(huán)境保護(hù)及進(jìn)一步應(yīng)用推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與糞樣 復(fù)合微生物菌液包括以下有益菌：羅倫隱球酵母(),10CFU/g;植物乳桿菌(),10CFU/g;枯草芽孢桿菌(),10CFU/g。以上菌株均由西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)用新鮮豬糞采自陜西楊凌某養(yǎng)豬場(chǎng)飼養(yǎng)的健康豬群。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，購(gòu)于成都達(dá)碩試驗(yàn)動(dòng)物有限公司；普通級(jí)新西蘭家兔，購(gòu)于西安迪樂普生物醫(yī)學(xué)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和設(shè)備 普通肉湯培養(yǎng)基、乳酸細(xì)菌(MRS)培養(yǎng)基、綜合馬鈴薯培養(yǎng)基等，均購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

主要設(shè)備有電子天平BS2202S、振蕩培養(yǎng)箱ZQZY-C8、可見分光光度計(jì)L025、DYM空盒氣壓表L031、KB-6E大氣采樣器L182等。

1.2 方法

1.2.1 生物除臭劑的制備 將微生物菌株分別于相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，取培養(yǎng)液按照一定的比例組合制備生物除臭劑，制備的復(fù)合微生物菌液中羅倫隱球酵母數(shù)≥2.0×10mL，植物乳桿菌數(shù)≥2.0×10mL，枯草芽孢桿菌數(shù)≥3.0×10mL。

1.2.2 豬排泄物中廢氣的檢測(cè) 豬排泄物中廢氣的檢測(cè)分為大氣環(huán)境試驗(yàn)和密閉環(huán)境試驗(yàn)，廢氣檢測(cè)的指標(biāo)主要為NH、HS和臭氣濃度。其中去除率(%)=(對(duì)照組廢氣濃度-試驗(yàn)組廢氣濃度)/對(duì)照組廢氣濃度×100%。

1.2.2.1 大氣環(huán)境試驗(yàn) 處理1：將養(yǎng)豬場(chǎng)中的豬排泄物取500 kg置于2 m的池子中，然后使用200 L清水均勻噴灑和攪拌于豬排泄物中，靜置2 h后采用5點(diǎn)采樣法從表面0～5 cm處用大氣采樣器采樣。

處理2：將養(yǎng)豬場(chǎng)中的豬排泄物取500 kg置于2 m的池子中(長(zhǎng)2 m×寬1 m×高1 m)，然后將復(fù)合微生物菌液取1 kg稀釋至200 L后均勻噴灑和攪拌于豬排泄物中，靜置2 h后采用5點(diǎn)采樣法從表面0～5 cm處用大氣采樣器采樣。

1.2.2.2 密閉環(huán)境試驗(yàn) 密閉環(huán)境試驗(yàn)示意圖見圖1。將100 g豬排泄物放入2.5 L塑料桶中，密閉靜置30 min后開始采集豬排泄廢棄物中NH、HS和臭氣濃度樣品，臭氣濃度為瞬時(shí)采樣，記錄除臭前各組分濃度；取2 g復(fù)合微生物菌液稀釋至1 L，每5 min對(duì)塑料桶內(nèi)進(jìn)行噴霧，直至復(fù)合微生物菌液稀釋液全部用完，同時(shí)取等量的無菌水作為對(duì)照組進(jìn)行噴霧。噴霧完成后，靜置30 min后開始采集NH、HS和臭氣濃度樣品各1組，臭氣濃度為瞬時(shí)采樣，以上試驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)。復(fù)合微生物菌液噴灑及采集樣品過程中盡量保持塑料桶密閉狀態(tài)，檢測(cè)項(xiàng)目及時(shí)間見表1。

圖1 密閉環(huán)境試驗(yàn)示意圖

表1 豬排泄物中廢氣的檢測(cè)

1.2.3 復(fù)合微生物菌液小鼠急性毒性的檢測(cè) 選用昆明種小鼠20只，體重18～22 g，雌雄各半，試驗(yàn)前將其禁食6 h，不禁水。試驗(yàn)設(shè)1個(gè)劑量組，按原液(羅倫隱球酵母2.0×10mL，植物乳桿菌2.0×10mL，枯草芽孢桿菌3.0×10mL)進(jìn)行灌胃，灌胃體積為40 mL/kg體重。參照《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》、《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)。按上述劑量一次性經(jīng)口灌胃給予受試物，觀察14 d。記錄各組小鼠中毒表現(xiàn)及死亡情況。通過最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果確定復(fù)合微生物菌液對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃的LD值。

1.2.4 復(fù)合微生物菌液家兔急性毒性的檢測(cè) 選用檢疫合格的成年、健康、皮膚無損傷的家兔4只，試驗(yàn)前一天將家兔背部脊柱兩側(cè)毛剪掉，去毛范圍左、右側(cè)各3 cm×3 cm，表皮光滑無損。試驗(yàn)時(shí)取供試品1 mL均勻涂抹于左側(cè)剪毛區(qū)，然后用2層紗布(2.5 cm×2.5 cm)和一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。采用封閉試驗(yàn)，敷用時(shí)間為24 h，試驗(yàn)結(jié)束后用溫水清除殘留受試物。右側(cè)剪毛區(qū)不做任何處理為對(duì)照。參照《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》、《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》有關(guān)規(guī)定進(jìn)行皮膚刺激強(qiáng)度。皮膚刺激評(píng)分及強(qiáng)度分級(jí)參照表2，皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表2 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表3 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 惡臭等級(jí)(氨、硫化氫)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 氨評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為《工業(yè)企業(yè)設(shè)計(jì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(TJ36-1979)，標(biāo)準(zhǔn)限值為0.20 mg/m，硫化氫評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為《惡臭污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB14554-93)，標(biāo)準(zhǔn)限值為0.60 mg/m。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 豬排泄物臭氣的檢測(cè)結(jié)果

復(fù)合微生物菌液處理豬排泄物臭氣測(cè)定結(jié)果見表4和表5。從表4可以看出，在大氣環(huán)境下，加入復(fù)合微生物菌液的處理方法相比較于只加入清水的處理方法產(chǎn)生的惡臭氣體中NH、HS濃度都明顯下降(<0.05)，通過該生物除臭劑處理，NH去除率為76.13%，HS去除率為82.61%，臭氣濃度去除率83.25%。在密閉環(huán)境下(表5)，相比除臭前，添加復(fù)合微生物菌液對(duì)惡臭體中的NH、HS具有明顯去除效果(<0.05)，NH去除率為80.48%；HS去除率68.42%。臭氣濃度去除82.51%。與清水組也有顯著降低(<0.05)，表明復(fù)位微生物在除臭過程中起主要作用。試驗(yàn)結(jié)果表明該生物除臭劑在自然環(huán)境與密閉環(huán)境下，均有明顯的除臭作用，能夠?qū)H和HS等有害氣體降低到標(biāo)準(zhǔn)限值以下。

表4 大氣環(huán)境下豬排泄物臭氣的檢測(cè)結(jié)果

表5 密閉環(huán)境下豬排泄物臭氣的檢測(cè)結(jié)果

2.2 復(fù)合微生物菌液小鼠急性毒性的檢測(cè)

給予受試物后，兩組共20只小鼠在給藥后14 d觀察期內(nèi)未見其它異常情況，未出現(xiàn)死亡，結(jié)果見表6。參照最大耐受量試驗(yàn)規(guī)定，得出復(fù)合微生物菌液對(duì)雄、雌性小鼠的急性經(jīng)口毒性LD>40 g/kg體重，屬于實(shí)際無毒級(jí)物質(zhì)。

表6 復(fù)合微生物菌液急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.3 復(fù)合微生物菌液家兔急性毒性的檢測(cè)

試驗(yàn)期內(nèi)，家兔試驗(yàn)區(qū)皮膚未見紅斑和水腫等刺激性反應(yīng)，每只動(dòng)物皮膚刺激反應(yīng)積分均值0(表7)，按《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》、《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》皮膚刺激性試驗(yàn)有關(guān)規(guī)定判定為無刺激性。

表7 復(fù)合微生物菌家兔急性皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

臭氣中NH、HS嚴(yán)重危害畜禽正常生長(zhǎng)和影響人類健康，這2種氣體常作為養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境污染的主要檢測(cè)指標(biāo)以及作為衡量除臭劑效果的重要指標(biāo)。養(yǎng)殖場(chǎng)惡臭來源于動(dòng)物糞尿、霉變墊料、飼料等，其中主要來源于動(dòng)物排泄物中未被消化的各種有機(jī)物的微生物發(fā)酵分解，釋放多種揮發(fā)性硫化物、NH和揮發(fā)性胺類等。畜禽糞便中含有大量土著微生物，是惡臭產(chǎn)生的主要微生物種群。邵栓等報(bào)道，以貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和干酪乳桿菌4種微生物菌種復(fù)配得到的微生物除臭劑效果最好，通過7 d的堆積發(fā)酵，NH和HS的去除率達(dá)到63.60%和70.29%。本研究利用酵母菌、乳酸桿菌以及芽孢桿菌3種有益菌制備的復(fù)合微生物除臭劑，NH和HS去除率達(dá)到76.1%和68.42%以上，取得了高效的除臭效果。該結(jié)果可能是因?yàn)樘砑拥尼劸平湍?、芽孢桿菌、乳酸菌等復(fù)合微生物與豬糞中土著微生物產(chǎn)生拮抗作用，產(chǎn)生了乳酸、乙酸等代謝物，形成酸性環(huán)境抑制產(chǎn)生惡臭微生物的生長(zhǎng)，減少惡臭氣體的產(chǎn)生和釋放，或者益生菌自身代謝降解了惡臭物質(zhì)。復(fù)合微生物的除臭機(jī)理比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究探討。目前大多數(shù)微生物除臭劑的研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室階段，本試驗(yàn)是在生豬養(yǎng)殖場(chǎng)大氣環(huán)境和密閉環(huán)境下進(jìn)行，為該除臭劑的實(shí)際應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

生物除臭劑的優(yōu)點(diǎn)還在于安全性高，無二次污染，但是作為微生物制劑，不應(yīng)該忽視其對(duì)環(huán)境以及動(dòng)物和人類帶來的潛在危害，必須對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究使用的復(fù)合微生物除臭劑均為自然環(huán)境中存在的有益菌，能有效治理養(yǎng)殖場(chǎng)的臭氣污染，對(duì)昆明種雄、雌性小鼠急性經(jīng)口毒性LD>40 g/kg體重，且對(duì)皮膚無刺激，具有較好的使用安全性。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)以氨、硫化氫去除率作為衡量除臭劑效果的重要指標(biāo)，同時(shí)經(jīng)急性毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，結(jié)果表明本研究使用的復(fù)合微生物菌液具有較好的安全性及除臭能力，為豬養(yǎng)殖場(chǎng)糞污臭氣的高效處理、環(huán)境保護(hù)及進(jìn)一步應(yīng)用推廣提供依據(jù)。