熊 爽, 張 麗,2, 黃益嘉, 彭麗芳, 邵歡歡, 勾 洵*

(1. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101; 2. 內(nèi)江衛(wèi)生與健康職業(yè)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 四川 內(nèi)江 641100)

我國(guó)作為畜禽養(yǎng)殖大國(guó),抗生素被大規(guī)模地用于預(yù)防、治療禽畜疾病和促進(jìn)禽畜生長(zhǎng),每年被應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖的抗生素約占我國(guó)抗生素使用總量的46.1%[1-3].但相關(guān)研究表明,一半以上進(jìn)入到動(dòng)物體內(nèi)的抗生素因無(wú)法被吸收而以原藥或糞便、尿液等代謝物的形式排出體外.這些抗生素逐漸進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后,很難完全得到轉(zhuǎn)化或降解[4-5].隨著使用時(shí)間的增加,一些微生物產(chǎn)生抗生素抗性基因,而后病原菌對(duì)抗生素的抗性也隨之增加,環(huán)境細(xì)菌的耐藥性增加,給人類健康帶來(lái)威脅[6-7].另一方面,微量金屬元素作為飼料添加劑被養(yǎng)殖場(chǎng)使用,畜禽糞便中的重金屬殘留也是養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中重金屬污染的主要來(lái)源[8].這些重金屬污染不僅嚴(yán)重危害畜禽的健康、食品的安全,也對(duì)周圍土壤環(huán)境和地下水循環(huán)造成威脅.高濃度的重金屬污染被證實(shí)與抗生素抗性基因的豐度密切相關(guān),細(xì)菌耐藥性水平隨著重金屬污染水平增加而增加.畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)及周圍土壤環(huán)境受到重金屬和抗生素的復(fù)合污染,對(duì)環(huán)境細(xì)菌的抗生素抗性水平表現(xiàn)出交互影響,促進(jìn)或抑制細(xì)菌抗生素抗性的污染,但具體影響尚不清楚,相關(guān)研究較少,且缺乏系統(tǒng)性[9-10].

本研究從某畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中篩選具有抗生素抗性的菌株,研究在抗生素(慶大霉素、阿莫西林、頭孢拉定、四環(huán)素)濃度一定情況下,不同濃度梯度的典型重金屬(Cu2+、Cr6+、Cd2+)對(duì)其抗生素抗性水平的影響,為研究重金屬和抗生素復(fù)合污染對(duì)畜禽養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響及利用微生物法進(jìn)行防治提供科學(xué)支撐[11].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 樣品采集于成都市某廢棄畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤,質(zhì)控菌株分別為銅綠假單胞菌ATCC 27853和大腸桿菌ATCC 35218.

1.1.2主要儀器 SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);H1850R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);HH-S6電子恒溫水浴鍋(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);GHP-9050隔水式培養(yǎng)箱(上海和羽電子科技有限公司);UV1000紫外可見(jiàn)分光分析儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司);JD200-3電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司);PHS-25B數(shù)字酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司);S1000 PCR儀(Bio-Rad);酶標(biāo)儀(SpectraMax i3x);微型離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司,Mini-6K);恒溫震蕩機(jī)(SPH-200B);水平電泳槽(Bio-Rad).

1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基 培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基,基礎(chǔ)培養(yǎng)基,MH瓊脂培養(yǎng)基,重金屬離子實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基等.

重金屬標(biāo)準(zhǔn)液:配制質(zhì)量濃度為104mg/L的CdCl2·2.5H2O、CuSO4·5H2O和K2Cr2O7重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于調(diào)節(jié)選擇培養(yǎng)基中重金屬的濃度.

藥敏紙片:頭孢拉定(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片),購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司.

1.2 方法

1.2.1土壤菌的篩選與分離純化 稱取10 g土壤溶于90 mL無(wú)菌水,20 ℃振蕩培養(yǎng)24 h.向99 mL的LB液體培養(yǎng)基中加入1 mL土壤培養(yǎng)液的上清液,30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h.培養(yǎng)基平板上均勻涂布50 μL稀釋菌液,菌液干燥后倒置于30 ℃生化培養(yǎng)箱中.挑取形態(tài)不一樣的單菌落,轉(zhuǎn)移至液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h.經(jīng)劃線分離后,在30 ℃生化培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng).甘油管藏保存分離出的單菌落.

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定及繪制 按照麥?zhǔn)媳葷峁艿牟煌葷峁芘渲葡鄳?yīng)濁度的硫酸鋇溶液,分光光度計(jì)測(cè)量625 nm時(shí),空白、0.5、1、2、3和4時(shí)各個(gè)濁度的硫酸鋇溶液的光吸收值,每個(gè)樣測(cè)3個(gè)平行樣,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

菌株平板劃線接種后,在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)18 h.按照1%的接種量,接種到液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至第2、4、8 h時(shí),分別測(cè)定625 nm時(shí)光吸收值,得到菌株的生長(zhǎng)曲線,以確定1.5×108cfu·mL-1的懸菌液合適的培養(yǎng)時(shí)間,用于重金屬最小抑制濃度(Minimal Inhibition Concentration,MIC)測(cè)定及抗生素抗性研究.

1.2.3抗性菌株的篩選及鑒定 采用K-B紙片擴(kuò)散法做抗生素耐藥試驗(yàn)[12].初篩過(guò)程篩選出10株具有抗生素抗性的菌.移取比濁后的100 μL懸菌液,均勻涂布到MH試驗(yàn)培養(yǎng)基上,放置15 min后,將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面,各紙片中心距離大于24 mm,平板邊緣到紙片邊緣的距離大于15 mm.每個(gè)平板貼3片相同的抗生素紙片作為對(duì)照,靜置18 min后37 ℃培養(yǎng)18 h,測(cè)量抑菌圈直徑.

1.2.416S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取模板DNA,采用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×Taq PCR Master-mix KT20112.5 μL,27F 1μL,1492R 1μL,ddH2O 7.5 μL,模版DNA3 μL.

引物序列27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′.

PCR程序:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸10 min.

PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,后將基因序列提交GenBank,采用BLAST分析所測(cè)序列同源性,通過(guò)EzBioCloud網(wǎng)站(www.ezbiocloud.net/)對(duì)該菌株進(jìn)行初步的菌株確定,并利用MEGA 5.0構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.2.5重金屬最小抑制濃度的測(cè)定 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加不同量的重金屬標(biāo)準(zhǔn)液,Cd2+的質(zhì)量濃度變化范圍為0～200 mg·L-1，Cr6+的質(zhì)量濃度變化范圍為0～400 mg·L-1，Cu2+的質(zhì)量濃度變化范圍為0～1 600 mg·L-1,將100 μL菌懸液涂布到各培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h.記錄抑制菌株生長(zhǎng)的最低重金屬濃度,即為重金屬最小抑制濃度MIC.

1.2.6重金屬與抗生素交叉抗性的研究 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在抗生素濃度一定時(shí)(慶大霉素10 μg/片、阿莫西林20 μg/片、頭孢拉定30 μg/片、四環(huán)素30 μg/片),不同濃度的重金屬對(duì)菌株的抗生素抗性的影響.根據(jù)3種重金屬的MIC值,分別添加一定量的重金屬標(biāo)準(zhǔn)液至MH培養(yǎng)基中,凝固后取100 μL菌懸液滴加至含重金屬的試驗(yàn)培養(yǎng)基上,涂布均勻.15 min后,取藥敏紙片貼在涂好菌液的培養(yǎng)基上,每個(gè)平板上貼3片,37 ℃培養(yǎng)18 h,測(cè)定抑菌圈大小，并計(jì)算抑菌圈的直徑變化率.

1.2.7統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量多因素方差分析(P<0.05).通過(guò)加入重金屬前后的抑菌圈直徑比值計(jì)算抑菌圈直徑變化率.利用origin 8.5繪制不同濃度Cd2+、Cu2+、Cr6+對(duì)抗生素抗性水平影響的柱形圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性菌株的篩選和鑒定實(shí)驗(yàn)前期共篩選出38種菌,對(duì)其進(jìn)行抗性研究,其中編號(hào)10-③的菌對(duì)4種抗生素抗性相對(duì)較高,命名為C32.革蘭氏染色陰性，呈桿狀,單個(gè)或成對(duì).生化性質(zhì)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1.菌落為圓形,灰白色,表面濕潤(rùn),有光澤,不透明,邊緣不規(guī)則,較黏稠.易挑取,中央部位比邊緣顏色深.偶爾可見(jiàn)黏液或粗糙型(見(jiàn)圖1).

表1 C32的生化試驗(yàn)結(jié)果

圖1 C32的形態(tài)觀察

注:C32在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)1天

2.2 C32的16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST軟件對(duì)C32的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果表明C32菌株與Citrobacterfreundiistrain NBRC 12681 (NR 113596.1)和Citrobacterfreundiistrain JCM 1657(NR 113340.1)的相似度為99.71%,通過(guò)EzBioCloud網(wǎng)站比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)C32最可能是Citrobacterfreundii菌株,同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果也發(fā)現(xiàn)C32與C.freundiistrain NBRC 12681和C.freundiistrain JCM 1657親緣關(guān)系最近,因此,C32菌株很有可能是Citrobacterfreundii菌株(見(jiàn)圖2).

圖2 菌株C32的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 重金屬最小抑制濃度的確定測(cè)得C32對(duì)Cd2+、Cr6+、Cu2+的MIC分別為125、125和1 600 mg/L,并在此基礎(chǔ)上研究重金屬對(duì)其抗生素抗性的影響.根據(jù)C32的重金屬M(fèi)IC值分別設(shè)置3種重金屬的濃度梯度,Cd2+和Cr6+的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、0.1、2、10、50、100和150 mg/L,Cu2+的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、0.1、2、10、50、150、300、500、1 000、1 200、1 400和1 600 mg/L.

2.4 測(cè)定C32對(duì)重金屬與抗生素的交叉抗性

2.4.1C32抗生素抗性的測(cè)定 抗性菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知,C32對(duì)阿莫西林、四環(huán)素和對(duì)頭孢拉定表現(xiàn)耐藥,而對(duì)慶大霉素表現(xiàn)敏感.

表2 C32的抗生素敏感性

2.4.2重金屬種類和濃度與抗生素抗性的相關(guān)性分析 單變量多因素方差分析結(jié)果顯示F種類=1 728.803,P種類<0.05,表明重金屬種類對(duì)抑菌圈直徑的變化影響顯著;另外F濃度=26.509,P濃度<0.05,也表明重金屬濃度對(duì)抑菌圈直徑的變化影響顯著.此外,不同類型的二維交互效應(yīng)對(duì)抑菌圈直徑也有顯著的影響(P<0.05),重金屬濃度×重金屬種類×抗生素種類之間的三維交互效應(yīng)同樣顯著影響抑菌圈直徑(F=14.023,P<0.05),說(shuō)明重金屬與抗生素之間具有交互作用,同時(shí)交互效應(yīng)的影響也表明重金屬脅迫對(duì)菌株抗生素抗性水平有一定的影響(表3).

表3 主效應(yīng)方差分析

2.4.3重金屬濃度對(duì)抗生素抗性的影響 1) Cd2+濃度對(duì)C32的抗生素的抗性影響.圖3A顯示,與阿莫西林共存時(shí),隨著Cd2+濃度升高,抑菌圈直徑由12.35 mm(0.1 mg/L)逐漸增大到19.59 mm(100 mg/L),表明隨Cd2+濃度的升高,協(xié)同殺菌作用逐漸增強(qiáng);頭孢拉定與Cd2+共存時(shí),抑菌圈直徑的相對(duì)變化率依次為1.12%(0.1 mg/L)、-16.80%(2 mg/L)、-19.92%(10 mg/L)、-13.84%(50 mg/L)、52.16%(100 mg/L),結(jié)果表明低濃度Cd2+與頭孢拉定表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,較高濃度Cd2+與頭孢拉定表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用;四環(huán)素與Cd2+共存時(shí),抑菌圈直徑變化率為-6.67%～16.06%,表明Cd2+存在時(shí)抑菌圈直徑變化率很小,但抑菌作用隨Cd2+濃度的升高而增強(qiáng);慶大霉素與Cd2+共存時(shí),抑菌圈的直徑變化率為4.89%～22.58%,結(jié)果表明Cd2+存在時(shí)表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用,且抑菌能力隨Cd2+濃度的升高而升高.

A

2) Cr6+濃度對(duì)C32的抗生素的抗性影響.圖3B顯示,阿莫西林與Cr6+共存時(shí),抑菌圈直徑變化率分別為51.05%(0.1 mg/L)、64.72%(2 mg/L)、35.79%(10 mg/L)、96.46%(50 mg/L),表明隨Cr6+濃度的升高,協(xié)同殺菌作用逐漸增強(qiáng);頭孢拉定與Cr6+共存時(shí),抑菌圈直徑由10.5增大到15.13 mm,抑菌圈直徑變化率范圍為-15.95%～21.02%,結(jié)果表明低濃度Cr6+與頭孢拉定表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,較高濃度Cr6+與頭孢拉定表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用;四環(huán)素與Cr6+共存時(shí),抑菌圈的直徑變化率范圍為-5.45%～4.18%,表明Cr6+存在時(shí)抑菌圈直徑變化率很小,但抑菌作用隨Cr6+濃度的升高而增強(qiáng).慶大霉素與Cr6+共存時(shí),抑菌圈直徑變化率為0.53%(0.1 mg/L)、-1.97%(2 mg/L)、-9.68%(10 mg/L)、-10.88%(50 mg/L),表明Cr6+存在,主要表現(xiàn)協(xié)同抗性作用.

B

3) Cu2+濃度對(duì)C32的抗生素的抗性影響.圖3C顯示,當(dāng)Cu2+與阿莫西林共存時(shí),抑菌圈直徑變化率范圍為-10.10%～15.08%(0.1～1 200 mg/L),說(shuō)明低濃度Cu2+共存對(duì)C32的阿莫西林抗性影響很小;但當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度為1 400和1 600 mg/L時(shí),抑菌圈變化率分別為74.10%和87.01%,說(shuō)明高濃度Cu2+與阿莫西林表現(xiàn)為協(xié)同殺菌,且隨Cu2+濃度升高而增大;Cu2+與頭孢拉定共存時(shí),抑菌圈直徑變化率范圍為-37.92%～-3.73%(0.1～500 mg/L),27.73%～42.08%(1 000～1 600 mg/L),結(jié)果表明低濃度Cu2+與頭孢拉定表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,較高濃度Cu2+與頭孢拉定表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用;Cu2+與四環(huán)素共存時(shí),抑菌圈的直徑變化率范圍為-14.12%～31.21%(0.1～1 600 mg/L),表明Cu2+存在時(shí),表現(xiàn)低濃度為協(xié)同抗性作用,高濃度為協(xié)同殺菌作用;慶大霉素與Cu2+共存時(shí),抑菌圈的直徑變化率范圍為-4.36%～46.40%(0.1～1 600 mg/L),結(jié)果表明低濃度Cu2+與慶大霉素表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,較高濃度Cu2+與慶大霉素表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用.

C

2.4.4C32抗生素抗性與重金屬種類之間的關(guān)系 由表4可知,菌株的抗生素抗性變化可能只與重金屬種類相關(guān),Cd2+的共存導(dǎo)致菌株的四環(huán)素、阿莫西林和頭孢拉定抗性減弱;Cr6+存在時(shí),使菌株阿莫西林抗性明顯減弱;而Cu2+的共存導(dǎo)致菌株的四環(huán)素抗性明顯減弱.敏感程度變化見(jiàn)表4.

表4 重金屬共存對(duì)抗生素敏感性的影響

3 討論

抗生素是一種天然或人工條件下產(chǎn)生的可以抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì).畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中飼喂抗生素會(huì)導(dǎo)致抗性基因的出現(xiàn),且飼喂抗生素的種類和濃度與細(xì)菌的抗生素抗性基因有明顯的正相關(guān)性[7,13],抗生素的長(zhǎng)期濫用易引起環(huán)境細(xì)菌抗生素抗性基因擴(kuò)散,這已成21世紀(jì)威脅人類健康的最大挑戰(zhàn)之一[14],微量金屬元素隨畜禽飼料添加劑進(jìn)入環(huán)境,金屬元素的含量也影響著抗生素抗性基因的豐度,使環(huán)境細(xì)菌同時(shí)具備重金屬抗性與抗生素抗性,加劇了細(xì)菌耐藥水平[15-17].為研究重金屬和抗生素復(fù)合污染對(duì)畜禽養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響,本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室條件從成都市某廢棄畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中篩選出抗生素抗性菌株C32,并對(duì)其進(jìn)行了耐藥性質(zhì)的鑒定及重金屬脅迫對(duì)其抗生素抗性影響的測(cè)定.結(jié)果發(fā)現(xiàn):C32耐藥性質(zhì)的鑒定表明其具有四環(huán)素、頭孢拉定和阿莫西林抗性,經(jīng)16S rDNA鑒定C32屬于Citrobacterfreundii,屬條件致病菌,在適宜的條件下可引起人體腦膜炎、創(chuàng)面感染和敗血癥等疾病,亦可引發(fā)食物中毒,造成食源性污染,故對(duì)畜禽養(yǎng)殖而言有較高風(fēng)險(xiǎn).重金屬和抗生素間的交互作用表現(xiàn)為抗生素抗性隨重金屬濃度增加而減弱的協(xié)同抗性作用和抗生素抗性隨重金屬濃度增加而增強(qiáng)的協(xié)同殺菌作用.方差分析表明,不同的重金屬種類和濃度對(duì)C32的抑菌圈直徑有顯著影響(P<0.05),說(shuō)明C32的抗生素抗性水平與重金屬的種類和濃度有著密切的關(guān)系.重金屬和抗生素之間的吸附和絡(luò)合作用可能影響其協(xié)同作用,Wang等[18]研究表明四環(huán)素與Cu2+之間能形成絡(luò)合物,并在土壤中顯著影響環(huán)境化學(xué)行為,改變Cu2+的生物有效性,如Cu2+可以增強(qiáng)阿莫西林的殺菌效果,以及四環(huán)素可以增加Cu2+在畜禽養(yǎng)殖土壤上的吸附量[18-19].楊統(tǒng)一等[20]報(bào)道的Cu2+與頭孢拉定的交叉組合對(duì)細(xì)菌的抗性作用表現(xiàn)為:低濃度時(shí)表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,高濃度時(shí)表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用,本研究中Cu2+與頭孢拉定、Cu2+與阿莫西林、Cu2+與四環(huán)素及Cu2+與慶大霉素分別交叉組合時(shí)的抗性作用結(jié)果與其他的結(jié)果表現(xiàn)較為一致,可能是因?yàn)樵谛笄蒺B(yǎng)殖過(guò)程中,低濃度的重金屬作為營(yíng)養(yǎng)素能刺激細(xì)菌的生長(zhǎng),而在高濃度時(shí)與菌株的酶或DNA結(jié)合,抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[21],但這與抗生素的抑菌作用機(jī)制不同,導(dǎo)致不同重金屬對(duì)其影響也不同,如阿莫西林和頭孢拉定主要抑制細(xì)胞壁的合成[13].孫建平[22]研究表明重金屬與抗生素的毒性可以發(fā)生疊加,使得菌株的抗生素的敏感性降低,從而表現(xiàn)為協(xié)同殺菌作用.當(dāng)Cr6+與頭孢拉定交叉組合時(shí),低濃度時(shí)表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,高濃度時(shí)表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用;當(dāng)Cr6+與阿莫西林交叉時(shí),表現(xiàn)為協(xié)同殺菌作用;當(dāng)Cr6+與慶大霉素或四環(huán)素分別交叉組合時(shí),重金屬離子從低濃度開始即表現(xiàn)為協(xié)同抗性;可能是Cr6+既有毒性,又有致突變性,Cr6+會(huì)引起細(xì)菌DNA損傷[23],Cr6+的毒性與頭孢拉定或阿莫西林的殺菌效果有相加作用,表現(xiàn)為協(xié)同殺菌作用,而大部分的微生物都能依賴其自身特殊的結(jié)構(gòu),發(fā)生氧化還原反應(yīng),可使Cr6+轉(zhuǎn)化成Cr3+的形態(tài),從而達(dá)到降低毒性的效果,這就可能使得高濃度的Cr6+與四環(huán)素或慶大霉素組合表現(xiàn)為協(xié)同抗性.Cd2+與慶大霉素或阿莫西林組合時(shí)具有協(xié)同殺菌作用;Cd2+與頭孢拉定或四環(huán)素分別交叉組合，表現(xiàn)為低濃度和協(xié)同抗性作用,高濃度表現(xiàn)為協(xié)同殺菌作用;可能是抗生素能使Cd2+在畜禽養(yǎng)殖土壤上富集[19],使殺菌效果增強(qiáng)而表現(xiàn)協(xié)同殺菌.可是,也有一些研究結(jié)果表明，重金屬離子可以降低細(xì)菌的抗生素敏感性[24],從本研究結(jié)果來(lái)看,Cd2+的共存導(dǎo)致菌株的四環(huán)素、阿莫西林和頭孢拉定抗性減弱;Cr6+存在時(shí),菌株阿莫西林抗性明顯減弱;Cu2+的共存導(dǎo)致菌株的四環(huán)素抗性明顯減弱,而此時(shí)重金屬濃度對(duì)抗生素抗性表現(xiàn)無(wú)顯著影響,表明C32的某些耐藥性與重金屬濃度無(wú)關(guān).由此,高濃度的重金屬離子雖然能降低抗生素的敏感性,達(dá)到降低耐藥性的目的,但重金屬會(huì)在環(huán)境中富集,并且難以降解,污染畜禽養(yǎng)殖的生態(tài)環(huán)境.畜禽飼料添加劑的重金屬應(yīng)避免加入大劑量的Cu2+,Cr6+與阿莫西林和Cd2+與慶大霉素或阿莫西林在低濃度狀態(tài)下即能達(dá)到殺菌和降低抗生素敏感性的效果,可聯(lián)合使用以降低細(xì)菌的耐藥性,具有一定的應(yīng)用價(jià)值.本研究雖然對(duì)部分金屬離子對(duì)抗生素抗性的影響有探究,但針對(duì)重金屬與不同抗生素復(fù)合效用的基因定位等仍需進(jìn)一步研究.因此,探究細(xì)菌的多重抗性、重金屬和抗生素的交互效應(yīng)對(duì)修復(fù)重金屬與抗生素的復(fù)合污染、探明治理過(guò)程中的微觀機(jī)制起著重要作用[25].

4 結(jié)論

從成都市某廢棄畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中篩選出一株具有抗生素抗性菌株C32,經(jīng)鑒定屬于檸檬酸桿菌屬(Citrobacter),具有阿莫西林、頭孢拉定和四環(huán)素多重抗性,對(duì)重金屬Cd2+、Cr6+、Cu2+的MIC分別為125、125和1 600 mg/L.研究表明重金屬的濃度及種類均會(huì)對(duì)C32的抗生素抗性影響顯著(P<0.05),在Cu2+、Cd2+與頭孢拉定、Cd2+與四環(huán)素及Cu2+、Cr6+與慶大霉素交叉組合時(shí),重金屬低濃度時(shí)表現(xiàn)協(xié)同抗性作用,高濃度時(shí)表現(xiàn)協(xié)同殺菌作用.Cr6+、Cd2+與阿莫西林及Cd2+與慶大霉素交叉組合，表現(xiàn)為協(xié)同殺菌，且隨著重金屬濃度升高,抑菌能力逐漸增強(qiáng).