李 姣, 林詩語, 孫 成, 魏旭東, 牟翠黎, 施嬌嬌, 張 紅

(四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101)

據(jù)中國藥典[1]記載,黃連是指毛茛科黃連屬植物雅連(Coptisdeltoidea)、味連(Coptischinensis)和云連(Coptisteeta)的干燥根莖,是我國著名中藥材,具有顯著的抗癌[2-3]、降血脂[4-5]等功效.然而,黃連人工栽培難度大,生長期長,產(chǎn)量低[6],加上過度采集野生黃連,造成黃連種質(zhì)資源相對匱乏,已列入國家二級保護植物.因此,建立高效且遺傳穩(wěn)定性好的黃連再生體系,不僅能提高產(chǎn)量,滿足市場需求,還能保存種質(zhì)資源.

黃連極難再生[7],黃連組織培養(yǎng)研究大都集中在愈傷組織培養(yǎng)[8-12],國內(nèi)僅侯嵩生與桂耀林報道了黃連經(jīng)胚性愈傷組織誘導出的體細胞胚胎發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株[13-14].胚性愈傷組織不僅是體細胞胚胎直接發(fā)育為完整植株的前提,也是黃連定向遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體[7].因此篩選出最適于黃連愈傷組織(特別是胚性愈傷組織)誘導的培養(yǎng)條件是建立黃連再生體系的關鍵.

本文對雅連、味連和云連3種黃連的愈傷組織誘導的3個影響因素[9,15](外植體、植物生長激素和培養(yǎng)條件)進行優(yōu)化，以期為黃連愈傷組織的進一步研究和利用提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試植物材料 三年生味連、雅連和云連植株分別采自四川省峨眉山市黑水村(29°36′0″N,103°21′59″E,925 m 海拔高度)、四川省眉山市洪雅縣黑山村(29°29′50″N,103°9′56″E,1 879 m 海拔高度)和云南省怒江傈僳自治州瀘水市魯掌鎮(zhèn)(26°2′49″N,98°45′35″E,2 634 m 海拔高度).

1.1.2實驗試劑 已有研究表明適于黃連愈傷組織誘導的基礎培養(yǎng)基是6,7-V培養(yǎng)基[12]，該培養(yǎng)基所需的化學藥品如表1所示.

1.1.3實驗儀器 pH檢測儀、培養(yǎng)瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、剪刀、鑷子、剪剖刀、酒精燈、超凈工作臺.

1.2 實驗方法

1.2.1黃連愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配制 本實驗在6,7-V培養(yǎng)基中加質(zhì)量濃度30 g/L的蔗糖、質(zhì)量濃度7.5 g/L的瓊脂和不同配比的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)等植物生長激素組合，用pH調(diào)整液調(diào)pH值為5.8.其中，4種植物生長激素的配制(質(zhì)量濃度mg/L)組合分別為：

表1 配制黃連基礎培養(yǎng)基6,7-V的化學藥品及質(zhì)量濃度

2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA/IAA(0.5)，
2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA/IAA(1.0)，

2,4-D(0.5)+6-BA(2.5)+NAA(0.5)，
2,4-D(0.5)+6-BA(2.5)+NAA(1.0).

pH調(diào)節(jié)液為0.1 M HCl和1 M NaOH，滅菌劑分別為體積分數(shù)75%的乙醇、體積分數(shù)0.1%的氯化汞.

1.2.2黃連外植體的滅菌 分別從健康的味連、雅連和云連植株中選取幼嫩的莖和帶葉柄的葉,先用自來水流水反復沖洗10 min,洗去表面的泥土和灰塵等污垢,用濾紙吸干表面水分后放入潔凈的燒杯中.從乙醇和氯化汞的不同滅菌時間組合條件中篩選出黃連外植體最適宜的滅菌方式.將滅菌后的外植體用無菌蒸餾水沖洗5次,每次5 min,然后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分.

1.2.3黃連外植體的接種 用剪刀將莖剪為長度約1.0 cm的小段,用剪剖刀將葉片切為0.5 cm×1.0 cm左右的帶葉柄或不帶葉柄的小塊.為了增加外植體的創(chuàng)傷面積,提高愈傷組織誘導率,用刀片在莖段上劃一些痕(深度約為1～2 mm,劃痕間距約為3～4 mm),用剪刀沿葉塊邊緣輕輕剪出一些小口 (小口間距約為3～4 mm).然后將外植體接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基中,每個培養(yǎng)瓶中接種2～3個外植體,每種黃連各50瓶.

1.2.4培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,濕度為60%～70%.隨機將接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的黃連培養(yǎng)瓶數(shù)量的1/2(25瓶)置于日光燈照射下,光照強度為1 500 Lx,光照周期為16 h/d;另25瓶置于黑暗條件下,用報紙將培養(yǎng)瓶包裹嚴密,避免光照.

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計 每隔4 d觀察一次外植體的生長狀態(tài),及時記下出現(xiàn)污染、褐化以及愈傷組織的外植體數(shù)量.使用Microsoft Excel 2013軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),分別用以下公式計算黃連外植體的污染率、褐化率和愈傷組織誘導率：

2 結果與分析

2.1 黃連外植體滅菌方式對污染率的影響如表2所示,將外植體先用乙醇浸搖30 s，再用氯化汞浸搖10 min的滅菌方式有效清除了雅連和云連外植體的雜菌,兩者污染率分別為16%和19%;然而不能清除味連外植體的雜菌,其污染率高達100%.

表2 黃連外植體的滅菌方式

因此,在此滅菌方式基礎上增加一次體積分數(shù)0.1%氯化汞浸搖10 min后,味連外植體污染率降至10%.

2.2 黃連外植體類型、植物生長激素和光照條件對黃連愈傷組織形成的影響

2.2.1黃連外植體類型對愈傷組織形成的影響 將黃連外植體接種到含有不同植物生長激素組合(具體組合見2.2.2)的6,7-V培養(yǎng)基(pH 5.8)上,在光照或黑暗條件下誘導愈傷組織.接種45 d后光照條件下黃連外植體未出現(xiàn)愈傷組織;黑暗條件下除了黃連莖段未出現(xiàn)愈傷組織以外,葉柄(圖1A)、無葉柄葉片(圖1B)和帶葉柄葉片(圖1C)出現(xiàn)了較多數(shù)量的愈傷組織,愈傷組織誘導率分別為70.8%、83.3%和87.5%(表3).

A B C

帶葉柄葉片產(chǎn)生的愈傷組織不僅數(shù)量最多,生長狀況也最好,質(zhì)地緊密,顏色呈黃白色,具有胚性愈傷組織的典型特征.這些結果表明帶葉柄葉片是誘導黃連胚性愈傷組織形成的最適宜的外植體,還表明不同種類和濃度的植物生長激素對不同品種黃連愈傷組織誘導的影響不同.

表3 黃連不同外植體類型產(chǎn)生的愈傷組織的生長情況

2.2.2 植物生長激素對黃連愈傷組織形成的影響如表4所示,以帶葉柄葉片為外植體,雅連愈傷組織誘導率在激素組合為2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)時最高,為58%;在激素組合為2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA(0.5)時降為39%.味連和云連愈傷組織誘導率在激素組合為2,4-D(0.5)+6-BA(2.0)+NAA(0.5)時都是最高的,分別是40%和43%.與IAA相比,NAA誘導味連和云連外植體產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)量更多,顏色略深,質(zhì)地更緊密,體積明顯更大,因此更利于愈傷組織形成.這些結果表明雅連愈傷組織誘導只需要2,4-D和6-BA兩種激素,而味連和云連愈傷組織誘導需要2,4-D、6-BA和NAA等3種激素.

表4 不同植物生長激素組合對黃連愈傷組織形成的影響

2.2.3光照條件對黃連愈傷組織形成的影響 如表5所示,光照條件(光照強度1 500 Lx,光照周期16 h/d)下3種黃連的外植體不僅未產(chǎn)生愈傷組織,而且有嚴重的褐化現(xiàn)象,褐化率高達93%.然而,黑暗條件下黃連外植體愈傷組織誘導率為74%,褐化率為7%,表明黑暗條件最適于黃連愈傷組織誘導.這些結果說明了植物細胞內(nèi)催化酚類物質(zhì)的氧化酶需要光誘導,而黑暗培養(yǎng)能降低氧化酶活性,抑制酚類物質(zhì)的氧化,降低外植體褐化率.

表5 光照條件對黃連愈傷組織形成的影響

3 討論

前人在黃連組織培養(yǎng)中采用莖尖、莖段、花梗、嫩葉等作為外植體,雖然都成功誘導出愈傷組織[7-14,16-17〗,但都是研究一種黃連的愈傷組織誘導,沒有系統(tǒng)地研究最適于雅連、味連和云連3種黃連愈傷組織誘導的外植體類型.由于黃連莖尖和花梗材料來源少,具有局限性,本研究分別采用雅連、味連和云連的莖段與嫩葉進行愈傷組織誘導,發(fā)現(xiàn)以帶葉柄葉片為外植體愈傷組織誘導率高,并且誘導形成的愈傷組織質(zhì)地致密,呈黃白色,具有胚性愈傷組織的顯著特征.這個以帶葉柄葉片為適宜的3種黃連外植體誘導出大量胚性愈傷組織的發(fā)現(xiàn),對后續(xù)研究中提高黃連遺傳轉(zhuǎn)化率和植株再生率具有重要意義,也擴大了黃連胚性愈傷組織誘導的外植體范圍.

植物生長激素的種類與濃度配比不僅影響愈傷組織誘導,還影響愈傷組織轉(zhuǎn)化為胚性愈傷組織.KT、2,4-D、6-BA、NAA和IAA等植物生長激素成功地誘導出黃連愈傷組織[7-14],然而都只是從一種黃連中誘導出愈傷組織,而且只有少數(shù)研究將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)化為了胚性愈傷組織[13-14].本研究對雅連、味連和云連3種黃連愈傷組織誘導的激素種類和濃度進行系統(tǒng)研究后,發(fā)現(xiàn)雅連愈傷組織的誘導需要2,4-D 和6-BA兩種植物生長激素,兩者質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0 mg/L時最適于雅連愈傷組織誘導;味連和云連愈傷組織的誘導需要2,4-D、6-BA和NAA等3種植物生長激素,三者質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0、0.5 mg/L時最適于味連和云連愈傷組織誘導.

有研究在光照強度1 200 Lx和光照周期16 h/d的條件下成功誘導出味連愈傷組織[12],也有研究發(fā)現(xiàn)黑暗更有利于雅連愈傷組織誘導[17].本研究發(fā)現(xiàn)黑暗培養(yǎng)下雅連、味連和云連3種黃連愈傷組織誘導率高,褐化率低,因此黑暗條件最適于黃連愈傷組織誘導.

植物組織培養(yǎng)褐化的影響因素[18]有多種,包括外植體(生理狀態(tài)與年齡、取材時間、滅菌方式等)、培養(yǎng)基(瓊脂與植物生長激素的濃度、pH等)、培養(yǎng)條件(光照或黑暗)等.本研究在3月選取健康的三年生黃連植株上的幼嫩的帶葉柄葉片為外植體,采用適宜的滅菌方式和培養(yǎng)基,在黑暗條件下誘導黃連愈傷組織,大大降低了3種黃連外植體的褐化率.

本研究不僅誘導出3種黃連的愈傷組織,還在外植體、植物生長激素和培養(yǎng)條件3個關鍵因素方面優(yōu)化了愈傷組織誘導的條件,獲得了大量胚性愈傷組織,為后續(xù)研究誘導胚性愈傷組織產(chǎn)生體細胞胚胎、建立高效且遺傳穩(wěn)定性好的黃連再生體系奠定基礎；對提高黃連產(chǎn)量,滿足市場需求,有效保護黃連種質(zhì)資源具有重要意義.同時，胚性愈傷組織是植物定向遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，本研究中大量胚性愈傷組織的獲得，還為后續(xù)研究采用基因槍法轉(zhuǎn)化黃連生物堿合成途徑中的關鍵酶基因奠定了基礎.

致謝四川師范大學2019年度“大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃”項目對本文給予了資助,謹致謝意.