羅芊芊, 趙明水, 肖德卿, 金國慶, 龐春梅, 祁祥斌, 周志春,①

(1.撫州市林業(yè)科學(xué)研究所, 江西 撫州 344000;2.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 311400;3.浙江天目山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局, 浙江 杭州 311300)

近年來的研究結(jié)果表明：即使是狹域種、瀕危種或特有種，也保持著較高的遺傳多樣性，例如漾濞槭(AceryangbienseY.S.Chen et Q.E.Yang)[1]。Spielman等[2]比較了170個(gè)瀕危物種及相關(guān)非瀕危物種的平均雜合度，77%瀕危物種的雜合度較低，且瀕危物種的雜合度比相關(guān)非瀕危物種低35%，表明瀕危物種的進(jìn)化潛力降低，生殖健康受損，滅絕風(fēng)險(xiǎn)升高。近親繁殖引起的遺傳多樣性降低意味著該物種繁殖適合度降低，這會(huì)增加瀕危物種在自然棲息地滅絕的風(fēng)險(xiǎn)[3]。此外，瀕危植物漸少的主要外部原因是天然植被屢遭破壞和生境惡化[4,5]。了解珍稀瀕危植物的瀕危機(jī)制，掌握珍稀瀕危植物的遺傳多樣性變化規(guī)律和親緣關(guān)系有利于對(duì)其開展科學(xué)保育工作。

羊角槭(AceryangjuechiFang et P.L.Chiu)為槭樹科(Aceraceae)槭屬(AcerLinn.)落葉喬木，被列入《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄(第一批)》，具有重要的科研及園林應(yīng)用價(jià)值[6,7]。由于人為(折損)和自然(臺(tái)風(fēng)和冰雪)的雙重影響，分布于浙江省杭州市西天目山的羊角槭4株原生大樹(親代)已死亡，僅有小苗留存下來。近年來，雖然相關(guān)部門對(duì)羊角槭采取了有效的保護(hù)和引種措施，但由于羊角槭存在敗育嚴(yán)重、生存能力較差和種子深休眠等特性[8]9,35，其仍然面臨生境破壞、人為干擾和自身更新困難等問題。因此，亟需對(duì)羊角槭遺傳多樣性進(jìn)行研究，這對(duì)其遺傳保育和擴(kuò)繁工作具有重要意義。本研究通過13對(duì)SSR引物系統(tǒng)分析了來自浙江省杭州市西天目山的羊角槭子一代和子二代的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以期最大化利用其基因資源的多樣性生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種子，并為其科學(xué)遺傳保育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為分布于浙江省杭州市西天目山的羊角槭子一代和子二代群體。該地區(qū)氣候多霧、潮濕，年平均溫度在12 ℃左右，空氣相對(duì)濕度為76%～81%，年降水量約為1 600 mm，土壤酸堿度為pH 4.0至pH 5.0，土壤為山地紅壤或黃壤[9]。羊角槭天然分布區(qū)內(nèi)的主要伴生樹種為毛竹〔Phyllostachysedulis(Carrière)J.Houz.〕、構(gòu)樹〔Broussonetiapapyrifera(Linn.)L′Hér.ex Vent.〕和楓香樹(LiquidambarformosanaHance)等，植被類型為亞熱帶常綠闊葉林。近年來，有關(guān)部門對(duì)僅存的12株實(shí)生子代苗(以下簡稱為子一代，樹齡20～40 a，編號(hào)Y1至Y12)采取了就地保護(hù)和引種馴化措施，并營建了0.33 hm2羊角槭母樹林。本文中子二代植株共54株，其中，編號(hào)Y13為子一代Y6的旁生小樹，其余53株〔樹齡較大且較為接近(8～10 a)，編號(hào)Y14至Y66〕皆來自羊角槭母樹林[10]。

于2020年6月，在每株冠層中部的靠陽面，隨機(jī)采集無病蟲害當(dāng)年生葉片50 g，單株混合，用錫箔紙包裹后置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80 ℃保存、備用。采樣時(shí)，使用胸徑尺(精度1 mm)測(cè)量樣株胸徑，使用測(cè)距望遠(yuǎn)鏡(精度0.1 m)測(cè)量樹高，使用GPS記錄樣株所處的經(jīng)度、緯度和海拔，使用指南針判斷坡向，使用坡度測(cè)量儀(精度1°)測(cè)量坡度，肉眼判斷坡位和郁閉度。羊角槭子一代和子二代樣株的基本信息見表1。

表1 羊角槭子一代和子二代樣株的基本信息

1.2 方法

參照文獻(xiàn)[11-17]收集多個(gè)引物片段，初篩后選出13對(duì)條帶清晰且多態(tài)性較高的SSR引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用DN14 CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取羊角槭葉樣的基因組DNA，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA濃度及質(zhì)量。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積25.0 μL，包括2×TaqPlus Master MixPCR預(yù)混液(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、20 ng·μL-1DNA模板2.0 μL以及10 μmol·L-1正向和反向引物各1.0 μL。使用TP600梯度PCR儀(日本Takara Bio公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、相應(yīng)溫度退火60 s(退火溫度見表2)、72 ℃延伸60 s，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。采用Qsep100TM全自動(dòng)核酸蛋白分析系統(tǒng)(光鼎生物科技股份有限公司)對(duì)所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離檢測(cè)[18,19]。

表2 用于羊角槭子一代和子二代群體SSR標(biāo)記分析的13對(duì)SSR引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用Q-analyze 3.0軟件對(duì)SSR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行峰圖分析、等位基因讀取和膠圖比對(duì)，然后采用GenALEx 6.5軟件[20]對(duì)子一代和子二代群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，遺傳參數(shù)包括觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、固定指數(shù)(Fi)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)和子二代特有等位基因數(shù)(Nu)，其中，F(xiàn)i值的計(jì)算公式為Fi=1-Ho/He。采用HP-RARE 1.1軟件[21]計(jì)算等位基因豐富度(AR)及私有等位基因豐富度(PA)。采用CERVUS 2.0軟件[22]對(duì)子一代和子二代群體進(jìn)行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡檢驗(yàn)，最小期望頻率為5，使用葉氏連續(xù)性修正，使用Bonferroni校正，獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。采用Micro-checker 2.2.3軟件[23]對(duì)13個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行無效等位基因檢測(cè)，按照Brookfield估算方法得出無效等位基因頻率并對(duì)觀測(cè)等位基因頻率進(jìn)行調(diào)整。采用FSTAT 2.9.3軟件[24]對(duì)上述遺傳多樣性參數(shù)在子一代和子二代群體間的區(qū)別進(jìn)行檢測(cè)(1 000次模擬)，計(jì)算子一代和子二代群體的近交系數(shù)(Fis)[25]。

根據(jù)Q-analyze 3.0軟件顯示的分型結(jié)果，在相同位置，有條帶賦值為“1”，無條帶賦值為“0”。計(jì)算供試材料的遺傳相似系數(shù)(GS)，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀圖。以上操作均在EXCEL 2016和NTSYS pc 2.10e統(tǒng)計(jì)分析軟件中完成[26-28]。

2 結(jié)果和分析

2.1 羊角槭子一代和子二代群體的遺傳多樣性

采用13對(duì)SSR引物對(duì)供試羊角槭12個(gè)子一代樣株和54個(gè)子二代樣株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表3和表4。

由表3可知：13對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出128個(gè)觀測(cè)等位基因(Na)，各引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的Na值為6～17，均值為9.8；有效等位基因數(shù)(Ne)為2.4～8.5，均值為4.4；觀測(cè)雜合度(Ho)為0.421～1.000，均值為0.738；期望雜合度(He)為0.524～0.873，均值為0.727；Shannon’s多樣性指數(shù)(I)為1.058～2.319，均值為1.559；多態(tài)性信息含量(PIC)為0.425～0.906，均值為0.723，表明各引物的多態(tài)性較高。13對(duì)SSR引物中，A14、A21、A61、A67和A82引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的固定指數(shù)(Fi)小于0，且13對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的Fi值的均值也小于0，表明羊角槭群體內(nèi)存在雜合子過剩的現(xiàn)象。哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明：13對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)中，有4對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)顯著偏離遺傳平衡。此外，13對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的子二代特有等位基因數(shù)(Nu)為1～8，均值為4.2;無效等位基因頻率為0.000～0.279。

表3 用于羊角槭子一代和子二代群體SSR標(biāo)記分析的13對(duì)引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的遺傳參數(shù)1)

由表4可知：羊角槭子一代和子二代群體的遺傳多樣性水平總體較高，與子一代群體相比，子二代群體的遺傳多樣性水平更高(Na=9.2，Ne=5.0，He=0.740，I=1.671)。羊角槭子一代群體的Ho值大于He值，而子二代群體的Ho值小于He值，且子一代群體的近交系數(shù)(Fis)小于0，子二代群體的Fis值大于0，表明子一代群體中雜合子過剩，而子二代群體中雜合子缺失。此外，子二代群體的Ho值略小于子一代群體，說明子二代群體中實(shí)際雜合單株比率較子一代群體有所下降。

表4 羊角槭子一代(F1)與子二代(F2)群體的遺傳多樣性比較1)

2.2 羊角槭子一代和子二代群體的親緣關(guān)系分析

羊角槭66個(gè)樣株間的遺傳相似系數(shù)為0.540～0.908。羊角槭子一代樣株中，Y4與Y10的親緣關(guān)系最近(遺傳相似系數(shù)為0.897)，Y5與Y12的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(遺傳相似系數(shù)為0.644)；羊角槭子二代樣株中，Y33與Y34以及Y41與Y43的親緣關(guān)系最近(遺傳相似系數(shù)均為0.908)，Y17與Y65的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(遺傳相似系數(shù)為0.540)。羊角槭子一代樣株與子二代樣株間，子一代Y5與子二代Y24的親緣關(guān)系最近(遺傳相似系數(shù)為0.851)，子一代Y12與子二代Y36、Y37和Y65的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(遺傳相似系數(shù)均為0.575)。

基于遺傳相似系數(shù)的羊角槭子一代和子二代群體的UPGMA聚類圖見圖1。由圖1可知：以遺傳相似系數(shù)0.709為閾值，羊角槭66個(gè)樣株分為A、B和C 3組。A組包括51個(gè)樣株，以遺傳相似系數(shù)0.723為閾值進(jìn)一步分為A1和A22個(gè)亞組。A1亞組中，子一代Y1單獨(dú)聚為一支，與子二代Y46、Y49、Y50、Y51、Y52、Y53、Y54、Y55、Y56、Y57、Y58、Y59、Y60、Y61、Y62、Y63、Y64和Y65的親緣關(guān)系較近；A2亞組中，子一代Y7和Y8與子二代Y14和Y29的親緣關(guān)系較近。B組包括14個(gè)樣株，以遺傳相似系數(shù)0.718為閾值進(jìn)一步分為B1和B22個(gè)亞組，B1亞組包括子一代Y2、Y3、Y4、Y6、Y9、Y10、Y11和Y12以及子二代Y13、Y19和Y24，其中，Y4與Y10先聚為一支，親緣關(guān)系較近；B2亞組包括子一代Y5以及子二代Y22和Y23。大多數(shù)的子一代樣株聚集在B組。C組僅包括子二代Y66。

Y1-Y12: 子一代樣株編號(hào)No.of sampling individual of first filial generation; Y13-Y66: 子二代No.of sampling individual of second filial generation.

3 討論和結(jié)論

羊角槭群體數(shù)量少，種子不孕率高，交配方式以異交為主，部分自交親和[29]，其主要傳粉方式為蟲媒傳粉，具有傳粉效率低、胚珠敗育和落花落果現(xiàn)象明顯等特點(diǎn)，這些因子均導(dǎo)致羊角槭的自然結(jié)實(shí)率和繁殖成功率較低[8]18-19,29。本研究中，羊角槭子一代和子二代群體的遺傳多樣性水平總體較高，且子二代群體的遺傳多樣性水平略高于子一代群體。劉曉宏[30]的研究結(jié)果表明：在槭屬樹種中的遺傳聚類結(jié)果中羊角槭單獨(dú)聚為一類，在槭屬中較特殊。與血皮槭〔Acergriseum(Franch.)Pax〕[11]53、葛蘿槭〔Acerdavidiisubsp.grosseri(Pax)P.C.de Jong〕[31]、金錢槭(DipteroniasinensisOliv.)[32]和云南金錢槭(DipteroniadyerianaHenry)[32]相比，羊角槭的遺傳多樣性水平較高，且明顯高于親緣關(guān)系較近的廟臺(tái)槭(AcermiaotaienseP.C.Tsoong)(Shannon’s多樣性指數(shù)為0.291 8)[33]，說明羊角槭群體具有一定的進(jìn)化潛力。本研究中，羊角槭子二代的親本并不完全包括在供試的子一代群體內(nèi)，由于羊角槭子一代群體中部分植株已死亡，推測(cè)子二代中檢測(cè)到的特有等位基因可能來源于已死亡的子一代植株。

本研究中，13對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的多樣性水平存在一定差異，A21、A27、A52、A61和A118引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)較多，為11～17個(gè)，且這5對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的期望雜合度、Shannon’s多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量也高于其他引物，說明這5對(duì)SSR引物能揭示羊角槭群體更為豐富的遺傳多樣性信息。其余8對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的觀測(cè)等位基因數(shù)較少(6～9)，其相應(yīng)的遺傳多樣性參數(shù)也相應(yīng)較低。羊角槭子一代群體的觀測(cè)雜合度大于期望雜合度，子二代群體的觀測(cè)雜合度卻小于期望雜合度，表明子一代群體中雜合子過剩，子二代群體中雜合子缺失；并且，子二代群體的觀測(cè)雜合度略小于子一代，說明子二代群體中實(shí)際雜合單株比率較子一代群體有所下降，但差異不大，子二代樣株中存在近親交配的后代。雜合子過剩一般出現(xiàn)在研究對(duì)象為小群體或者封閉群體[34]，如羊角槭野生群體中的子一代群體往往由于親本數(shù)量所限，出現(xiàn)的奠基者效應(yīng)(founder effect)會(huì)導(dǎo)致連鎖不平衡現(xiàn)象，繼而造成雜合子過剩。而羊角槭子二代群體呈現(xiàn)的雜合子缺失除與無效基因和研究樣本范圍大小有關(guān)外，還可能與人為干擾、單株交配型式樣改變、群體退化和親緣近交所造成的稀有堿基丟失等有關(guān)[35]。此外，人類砍伐和自然災(zāi)害等也會(huì)影響其群體遺傳多樣性和單株交配型式樣。

聚類分析結(jié)果顯示：A1亞組中，羊角槭子一代Y1與18個(gè)子二代樣株的親緣關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)為0.644～0.805，推測(cè)這18個(gè)子二代樣株為Y1的后代。羊角槭花期傳粉昆蟲以蠅類、蛾類和蜜蜂為主[8]19，這類昆蟲的傳粉飛行距離較短[36]，所以距離相近的子一代Y1和Y2易促成異交結(jié)實(shí)，有利于繁殖成功，這與其異交為主、部分自交可育的繁殖特性相關(guān)聯(lián)[29]。A2亞組中，僅有的子一代Y7和Y8的地理分布位置較近，且二者的親緣關(guān)系也較近，有可能來源于同一個(gè)母本。此外，子一代Y7和Y8與30個(gè)子二代樣株的親緣關(guān)系較近，推測(cè)A2亞組中的這些子二代樣株應(yīng)為Y7和Y8的后代。B1亞組中，子一代Y2、Y3、Y4和Y10聚為一個(gè)小分支，這4個(gè)單株均位于浙江省杭州市西天目山的同一山坳，加上其主要依賴?yán)ハx傳粉，導(dǎo)致這4個(gè)單株很可能來源于同一祖先。子一代Y6和Y9與子二代Y13以及子一代Y11和Y12與子二代Y24的親緣關(guān)系較近。在實(shí)地調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，Y13是Y6樹下旁生的小樹，Y11和Y12與Y24的地理位置也較近，推測(cè)Y13為Y6與Y9的異交子代，Y24為Y11和Y12的異交子代。B2亞組中，子二代Y22和Y23與子一代Y5聚為一個(gè)小分支，三者間親緣關(guān)系較近，推測(cè)Y5很可能是Y22和Y23的父本或母本。66個(gè)樣株中，子二代Y66與其他樣株的遺傳相似系數(shù)為0.632～0.759，但卻單獨(dú)聚為C組，說明Y66的親本可能是子一代中已死亡的植株。

羊角槭與廟臺(tái)槭親緣關(guān)系非常近，《Flora of China》將二者歸并為1個(gè)種[37]，但林立等[38]通過nrDNA ITS和cpDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者差異較大，采集于武漢和杭州的羊角槭樣品在5條DNA序列上都表現(xiàn)出100%相似度，而與廟臺(tái)槭則在5條DNA序列上存在13個(gè)位點(diǎn)差異，分子證據(jù)不支持將羊角槭歸并為廟臺(tái)槭；此外，二者在形態(tài)和地理分布上也差異較大，廟臺(tái)槭分布于甘、陜2省，小枝、果序和葉柄無毛，而羊角槭分布于浙西北地區(qū)，小枝、果序和葉柄被宿存的灰色或淡黃色短柔毛，因此，不支持將羊角槭歸并為廟臺(tái)槭。

本研究中供試的羊角槭子二代群體已被浙江天目山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局劃分為羊角槭母樹林。在對(duì)羊角槭母樹林實(shí)施就地保護(hù)的過程中，可在其分布較為集中的地方，有規(guī)模地?cái)U(kuò)大幼樹和幼苗的林窗面積，這樣既能增加群落下層光照，提高林下幼苗和幼樹的光合作用速率，又不至于因光照太強(qiáng)對(duì)幼苗和幼樹的葉片造成傷害[39]。羊角槭自然受精率、結(jié)實(shí)率低[8]35-37，人為地將遺傳相似系數(shù)較小的植株間的種子、幼苗植株進(jìn)行交叉種植，有利于促進(jìn)自然異交。此外，還可對(duì)其實(shí)施人工采種，選取親緣關(guān)系較遠(yuǎn)植株的種子進(jìn)行人工培養(yǎng)，如Y17和Y65，開展人工雜交授粉，擴(kuò)大羊角槭的遺傳變異，豐富其遺傳信息。