基于火麻仁資源綜合價值的蛋白提取工藝研究

蘇芳芳， 楊 光， 張 嬌， 鄭玉光， 錢 丹

(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心1，石家莊 050200) (中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心2，北京 100700) (中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心3，北京 100700) (河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院4，石家莊 050026)

火麻仁為?？浦参锎舐?CannabissativaL.)的干燥成熟果實，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，至今已有3 000多年的使用歷史。2002年原衛(wèi)生部公布的《關(guān)于進一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》將火麻仁作為藥食同源物質(zhì)收錄其中?；鹇槿示哂袠O高的經(jīng)濟價值和開發(fā)潛力，其油脂質(zhì)量分數(shù)為27.04%～37.67%[2]，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為20%～25%[3]，含有P、K、Ca等常量元素和Fe、Zn、Mn、Cu等微量元素，還含有少量的黃酮和酚類物質(zhì)[4]。火麻仁油中不飽和脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量的77.55%～81.21%，具有抗氧化、降脂[5]、調(diào)節(jié)腸道功能[6]等作用；火麻仁蛋白中有65%～75%的麻仁球蛋白和25%～37%的麻仁白蛋白，均屬于容易消化的全價蛋白質(zhì)[3]。

近年來，火麻仁油和火麻仁蛋白在工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的驅(qū)動下受到關(guān)注。主要研究集中在火麻仁油提取方法的考察，如溶劑浸出法[7]、超臨界萃取法[8]、壓榨法[9]和水酶法[10]等。榨油后的火麻仁殘渣即為火麻仁粕，多作為動物飼料添加，經(jīng)濟附加值較低，一定程度上造成火麻仁資源的浪費。堿提酸沉法是通過堿水溶解、酸溶液析出的提取方法[11]，也是工業(yè)提取植物蛋白的常用方法。目前已有學(xué)者研究火麻仁蛋白的堿提酸沉法[12]、水酶法[13]工藝。已有研究多基于火麻仁單一產(chǎn)品，未能綜合考量火麻仁油和蛋白的品質(zhì)和產(chǎn)量。本研究從火麻仁油得率和脂肪酸組成、火麻仁蛋白得率和氨基酸組成作為綜合指標進行考察，用正交實驗優(yōu)化了火麻仁蛋白提取工藝，建立火麻仁資源綜合利用的方法，為火麻仁資源綜合利用、火麻仁油和蛋白的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁，經(jīng)鑒定為?？浦参锎舐?CannabissativaL.)的果實；NaOH、HCl、Na2CO3、NaHCO3均為分析純；牛血清蛋白(BSA)標準品，BCA蛋白定量試劑盒。

1.2 主要儀器與設(shè)備

260型液壓榨油機，F(xiàn)L-S2017型十八油坊榨油機，ALPHA 2-4LDplus型凍干機，Milli-Q Integral型超純水機，Q-250A3型高速多功能粉碎機，Universal 320R通用型臺式高速冷凍離心機，Synergy 2型多功能酶標儀，L8900型全自動氨基酸分析儀，Agilent 7900型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，SHIMADZU GC-2010PlusAFAPC氣相色譜儀，Milestone型微波消解儀等。

1.3 方法1.3.1 火麻仁油和粗蛋白制備

火麻仁油制備：分別采用熱榨和冷榨方法榨油。熱榨采用的是螺旋式榨油法，榨油溫度為255 ℃；冷榨為液壓榨油法，榨油溫度為50 ℃。稱取3批不同產(chǎn)地(山西、陜西、黑龍江)火麻仁各1 kg，分別用冷榨和熱榨2種方式進行榨取，所得油為火麻仁毛油，油渣為火麻仁粕。

(1)

火麻仁粗蛋白制備：稱取火麻仁粕粉5 g，按照1∶20料液比加入100 mL超純水，用NaOH調(diào)節(jié)pH 10.0，溫度為50 ℃，水浴1 h。4 000 r/min離心10 min，在pH 5.0條件下酸沉1 h。用純水洗滌凝乳至pH 7.0左右，4 000 r/min離心20 min，沉淀冷凍干燥，即為火麻仁粗蛋白。

(2)

1.3.2 火麻仁油、粕和蛋白質(zhì)基本組成測定

火麻仁油脂肪酸含量測定：用水解-提取法原理，參照GB 5009.168—2016 第三法。

火麻仁粕蛋白質(zhì)含量測定：用凱氏定氮原理測定，參照GB 5009.5—2016 第一法。

火麻仁蛋白氨基酸含量測定：稱適量樣品置于水解管，加2 mL 6 mol/L HCl，充氮，110 ℃水解22 h。冷卻后取200 μL蒸干，加0.02 mol/L HCl溶解，稀釋成與標樣近似濃度，15 000 r/min離心15 min，取上清液上機測試。將氨基酸混合溶液標準物質(zhì)取50 μL，以0.02 mol/L HCl稀釋成500 μL溶液，制備得氨基酸標準溶液，樣品和標準品進樣量均為20 μL。離子交換樹脂柱溫57 ℃，流速為0.4 mL/min；茚三酮反應(yīng)柱反應(yīng)溫度為135 ℃，流速為0.35 mL/min；檢測波長570 nm和440 nm；樣品分析時間為50 min。用外標法測定樣品氨基酸含量。

1.3.3 蛋白含量測定

蛋白含量采用BCA法測定：使用酶標儀測定吸光度，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，分別稀釋成0、0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL共8個梯度繪制蛋白標準曲線，建立線性回歸方程。

1.3.4 火麻仁蛋白提取工藝考察

火麻仁蛋白提取流程：火麻仁粕粉碎→堿溶液提取→過濾，離心→上清液酸沉→離心→純水洗滌沉淀→離心→沉淀冷凍干燥→火麻仁粗蛋白。

1.3.4.1 等電點測定

稱取火麻仁粕粉末50 g，按照1∶20的料液比加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，60 ℃水浴1 h，過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。取上清液各30 mL，用HCl調(diào)pH分別至4.0～6.0，設(shè)置梯度為0.2。在8 000 r/min，4 ℃，10 min離心，以上清液BCA法反應(yīng)的吸光度為指標，得到火麻仁蛋白等電點。

1.3.4.2 提取pH對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，分別加入pH為9、10、11、12、13、14的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，按照1∶20料液比，40 ℃，40 min水浴。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計算蛋白提取率。

1.3.4.3 提取時間對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，按照1∶20料液比，40 ℃水浴，水浴時間分別為20、30、40、50、60 min。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計算蛋白提取率。

1.3.4.4 提取溫度對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，按照1∶20料液比，水浴50 min，水浴溫度分別為30、40、50、60、70 ℃。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計算蛋白提取率。

1.3.4.5 液料比對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，按照10、15、20、25液料比，加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，40 ℃，水浴50 min。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計算蛋白提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁油出油率和粗蛋白得率

采用BCA法測定BSA標準液濃度，建立標準曲線y=0.256 6x+0.075 1(R2=0.995 7)。根據(jù)標準曲線方程，計算粗蛋白的蛋白純度。

(3)

表1結(jié)果顯示，熱榨法出油率略高于冷榨法，但未形成顯著差異(P>0.1)；通過堿提酸沉法提取的冷榨火麻仁粕粗蛋白提取率為11.38%，顯著高于熱榨火麻仁粕(P<0.001)，冷榨粕粗蛋白提取率為熱榨粕粗蛋白提取率的5.1倍；冷榨粕蛋白純度略高于熱榨粕蛋白(P<0.01)。

表1 不同榨油方式對火麻仁油及蛋白得率影響

2.2 脂肪酸和氨基酸組成

2.2.1 脂肪酸組成

由表2可知，冷榨火麻仁油含脂肪酸(85.19±3.99)%，熱榨火麻仁油脂肪酸質(zhì)量分數(shù)為(85.49±5.16)%，2種榨油方式所得火麻仁油中均含有3種不飽和脂肪酸和6種飽和脂肪酸，脂肪酸的種類及含量無明顯差異(P>0.1)。火麻仁油中含有大量亞油酸、亞麻酸類不飽和脂肪酸，占火麻仁油質(zhì)量的77.43%；亞油酸和亞麻酸含量比例接近3∶1。

表2 火麻仁油脂肪酸成分

2.2.2 氨基酸組成及營養(yǎng)評價

受到氨基酸含量測量方法的影響，采用酸水解法測定時，谷氨酰胺和天冬酰胺會發(fā)生轉(zhuǎn)化，可能變?yōu)楣劝彼岷吞於彼?，色氨酸會完全破壞[14]。2種方式所得粕中提取所得蛋白的氨基酸種類相同，谷氨酸含量最高，精氨酸次之；冷榨粕必需氨基酸含量顯著高于熱榨粕(P<0.001)。谷氨酸占冷榨蛋白中氨基酸總量的17.64%，熱榨蛋白氨基酸總量的22.91%；熱榨粕中谷氨酸和精氨酸的比例提高，可能是高溫使蛋白中某些熱不穩(wěn)定氨基酸發(fā)生破壞，引起谷氨酸含量相對升高；冷榨蛋白中蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和賴氨酸6種必需氨基酸的比例高于熱榨蛋白(見表3)。

表3 不同榨油方式對氨基酸組成影響

火麻仁蛋白的氨基酸營養(yǎng)評價方法，按照FAO/WHO提出的氨基酸營養(yǎng)模式進行評價[15]，指標按照式(4)～式(6)計算。

必需氨基酸比值(RAA)=

(4)

氨基酸比值系(RCAA)=

(5)

氨基酸比值系數(shù)分值(SRC)=100-CV×100

(6)

式中：CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標準差/均值。

RCAA值越接近1，越符合FAO /WHO氨基酸模型；SRC越接近100，說明該蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值越高。由表4數(shù)據(jù)可得，除蛋氨酸和半胱氨酸外，冷榨蛋白和熱榨蛋白的必需氨基酸均接近FAO/WHO標準氨基酸模式；根據(jù)RAA和RCAA數(shù)值由式(6)計算可得：冷榨蛋白SRC為72.73，熱榨蛋白SRC為80.28，熱榨蛋白的營養(yǎng)價值略高于冷榨蛋白；冷榨蛋白中苯丙氨酸和酪氨酸的必需氨基酸比值顯著高于標準模式，為冷榨蛋白的優(yōu)勢氨基酸。

表4 不同榨油方式對必需氨基酸比值和比值系數(shù)的影響

2.3 火麻仁蛋白提取工藝考察

2.3.1 等電點測定

從圖1可以看出，在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)，火麻仁蛋白濃度隨pH的增高，先降低后升高，在pH為4.4～4.8時濃度最低。

圖1 火麻仁蛋白等電點

2.3.2 單因素實驗考察

從圖2可以看出，在pH 9～14范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨pH的增高，先增加后降低，在pH 10時提取率達到最大；在提取時間20～60 min范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨提取時間增長先增加后趨于穩(wěn)定，提取時間達到50 min后，提取率趨于穩(wěn)定；在30～60 ℃范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨提取溫度的增加而增高，50 ℃的提取率達到最高，溫度高于50 ℃后提取率降低，并逐漸趨于穩(wěn)定；在10、15、20、25的液料比范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨液料比增加而增高，20的液料比提取率達到最高；液料比高于20后提取率降低。故選擇pH 9.5、10.0、10.5，時間45、50、55 min，提取溫度45、50、55 ℃，液料比15、20、25作為正交實驗的較優(yōu)水平。

圖2 不同pH、提取時間、溫度、液料比對蛋白提取率的影響

2.3.3 正交實驗

由單因素實驗可知，溫度(A)、提取pH(B)、時間(C)、料液比(D)對火麻仁蛋白提取率均有影響，故選擇4個因素進行3水平考察，設(shè)計正交實驗(見表5)。

表5 L9(34)正交表

對火麻仁蛋白提取影響較大的因素為pH>時間>料液比>溫度。最佳提取條件為溫度60 ℃，pH為10.5，提取時間50 min，料液比1∶15。在此條件下蛋白提取率為(20.87±3.16)%。

3 討論

3.1 液壓冷榨法更有利于火麻仁資源的利用

火麻仁油制備方法有溶劑浸出法、超臨界萃取法、水酶法和壓榨法。溶劑浸出法采用有機溶劑提取，出油率高但可能有溶劑殘留，存在食品安全隱患，且榨油剩余的火麻仁粕無法再次利用；超臨界萃取法得到的火麻仁油質(zhì)量好但設(shè)備成本高；水酶法出油率低且酶成本高，均不適于大規(guī)模工業(yè)化火麻仁油的制備[16]。壓榨法工藝和設(shè)備簡單，操作簡易，是目前工業(yè)常用的榨油方法；壓榨法又可根據(jù)榨油條件，分為熱榨法和冷榨法[17]。熱榨法需要將油料提前蒸或炒制，或高溫螺旋壓榨；冷榨法不經(jīng)過炒或蒸制，且整個榨油溫度不高于60 ℃[18]。

本研究同時考察了冷榨和熱榨兩種方式對火麻仁油和后繼蛋白得率和質(zhì)量的影響，結(jié)果表明冷榨和熱榨對火麻仁油得率和脂肪酸組成無顯著影響。冷榨粕粗蛋白提取率和純度顯著高于熱榨粕，必需氨基酸含量更高；盡管熱榨蛋白的氨基酸評分更接近標準模式，但冷榨蛋白的提取率和純度均顯著高于熱榨蛋白。其原因可能是熱榨中使用高溫使蛋白變性程度高，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)破壞嚴重，尤其是11S蛋白，導(dǎo)致堿提中可溶性氮含量減少，整體提取率降低[19]。液壓冷榨法能夠最大程度利用火麻仁，得到更多火麻仁副產(chǎn)品，兼顧火麻仁油和火麻仁蛋白的產(chǎn)品特性，是適合火麻仁的壓榨方法，能夠滿足火麻仁資源的多環(huán)節(jié)利用。

3.2 堿提酸沉法可用于火麻仁蛋白的提取

與常用的NaOH體系相比，緩沖液作為火麻仁蛋白提取溶劑能夠穩(wěn)定蛋白溶解時引起的pH變化，保證提取效率，具有重復(fù)性和穩(wěn)定性。本研究在前期對比考察了NaOH和NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系，前者提取率不穩(wěn)定，后者提取率較低。也有學(xué)者用超聲輔助堿法提取，雖可提高火麻仁蛋白得率，但也存在工業(yè)化推廣問題[20]。

3.3 火麻仁油和火麻仁蛋白可作為高附加值產(chǎn)品開發(fā)

《中國居民膳食脂肪適宜攝入量》建議亞油酸和亞麻酸攝入比例為(4～6)∶1，嬰兒和老年人建議4∶1。常見植物油大豆油的比例為8∶1，橄欖油為10∶1，火麻仁比例接近3∶1[21]?；鹇槿视湍軡M足人體脂肪酸攝入的健康需求，尤其有益于嬰兒和老年人食用，可作為一種新的食用油開發(fā)。此外，火麻仁榨油后的油粕可用于提取火麻仁蛋白，具有抗氧化、降壓[22]、乙酰膽堿酯酶抑制[23]等活性，在治療高血壓、阿爾茨海默癥方面具有極大的開發(fā)潛力，已有火麻仁蛋白類飲料投放于市場。深入對火麻仁蛋白的應(yīng)用研究，可作為植物蛋白的有力補充，同時可減少資源浪費。本研究基于火麻仁資源多環(huán)節(jié)利用，立足于產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，從火麻仁油的制備到粕的再利用，建立火麻仁資源綜合利用方法，實現(xiàn)多鏈條產(chǎn)品共同開發(fā)的目的，對火麻仁資源產(chǎn)品多維度開發(fā)具有一定的借鑒意義。

4 結(jié)論

對火麻仁油得率和脂肪酸組成、火麻仁蛋白得率和氨基酸組成作為綜合指標進行考察，并采用正交實驗進行火麻仁蛋白提取工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，冷榨和熱榨對火麻仁油得率和脂肪酸組成無顯著影響，火麻仁油中含有大量不飽和脂肪酸，以亞油酸和α-亞麻酸為主，亞油酸和亞麻酸含量比例接近3∶1，占總脂肪酸質(zhì)量的87%左右，還含有少量γ-亞麻酸。堿提酸沉法提取冷榨粕粗蛋白提取率為11.38%，純度為79.67%；熱榨粕提取率為2.23%，蛋白純度為67.33%。冷榨粕中必需氨基酸占總氨基酸的29.87%，熱榨粕中必需氨基酸占總氨基酸的23.93%，冷榨粕粗蛋白提取率和純度顯著高于熱榨粕，必需氨基酸含量更高；盡管熱榨蛋白的氨基酸評分更接近標準模式，但冷榨蛋白的提取率和純度均顯著高于熱榨蛋白。對火麻仁蛋白提取影響較大的因素依次為pH、時間、料液比、溫度；優(yōu)化后提取條件為溫度60 ℃，pH為10.5，提取時間50 min，料液比1∶15，在此條件下蛋白提取率為(20.87±3.16)%。