玉米糖肽的體外抗氧化活性

王曉杰， 童 玲， 劉曉蘭

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院；黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，齊齊哈爾 161006)

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TGase)，全稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，屬于轉(zhuǎn)移酶類(EC 2.3.2.13)[1]。根據(jù)酰基受體的不同，TGase可以催化交聯(lián)、?；D(zhuǎn)移 (即酶法糖基化)和脫酰胺3種類型反應(yīng)，這3種反應(yīng)均可以用于改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[2-4]。相對于TGase催化的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的研究，TGase途徑的蛋白質(zhì)酶法糖基化反應(yīng)的研究起步較晚。與美拉德反應(yīng)相比，TGase途徑的酶法糖基化反應(yīng)條件更溫和，產(chǎn)物更安全。因此，TGase催化的酶法糖基化反應(yīng)已經(jīng)應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)/多肽的改性中，包括酪蛋白、大豆蛋白、雞肌動球蛋白、蝦原肌球蛋白、黑豆蛋白、乳清蛋白、豌豆蛋白、玉米醇溶蛋白和谷蛋白、魚皮膠原蛋白肽、小麥谷蛋白肽等[5-10]。在TGase催化的酶法糖基化反應(yīng)中，蛋白質(zhì)/多肽功能性質(zhì)的改善程度與底物蛋白及氨基糖的性質(zhì)等因素有關(guān)。例如，當以D-氨基葡萄糖為?；w，修飾雞肌動球蛋白、雞胸肉肌原纖維蛋白、大豆蛋白及酪蛋白時，由于D-氨基葡萄糖附著所賦予的親水性，改善了原蛋白的溶解性、乳化性和凝膠特性[11-13]；而修飾乳清分離蛋白時，D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使乳清分離蛋白的乳化性質(zhì)降低[8]；修飾酪蛋白酸鈉水解產(chǎn)物時，在TGase處理前后產(chǎn)物的抗氧化活性之間無顯著性變化[14]。

玉米肽是以玉米蛋白為原料，經(jīng)蛋白酶水解或微生物發(fā)酵后獲得的小分子質(zhì)量多肽。玉米肽特殊的氨基酸組成與排列順序決定了其具有多重的生物活性，特別是在抗氧化活性方面研究報道較多。相對于已應(yīng)用的抗氧化劑如GSH、維生素C來說，玉米肽的抗氧化活性較低，不利于功能性食品的開發(fā)。但是，玉米肽屬于天然、安全的抗氧化劑，如果能進一步改善其抗氧化活性，將促進玉米加工企業(yè)及功能食品等相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。玉米糖肽是玉米蛋白先經(jīng)蛋白酶水解獲得的低分子質(zhì)量玉米肽，再在TGase催化下與氨基糖共價結(jié)合的產(chǎn)物。與玉米肽相比，玉米糖肽的溶解性顯著增加，但其生物活性的改善程度鮮有研究。因此，本實驗以D-氨基葡萄糖共價修飾玉米肽的產(chǎn)物-玉米糖肽為原料，利用體外化學法和H2O2誘導的Caco-2細胞的氧化性損傷模型對玉米糖肽的抗氧化活性進行了研究，為抗氧化活性玉米糖肽作為功能性食品應(yīng)用于食品工業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性蛋白酶Alcalase，酶活力6.28×105U/mL；Caco-2細胞；玉米醇溶蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2-脫氧-D-核糖，均為色譜純；噻唑藍(MTT)、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽，均為分析純；TGase，酶活力1 000 U/g；DMEM(高糖)培養(yǎng)基；胎牛血清；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)測定試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

NDA701杜馬斯定氮儀，TU1901紫外可見分光光度計，IM-45L-1-25制冰機，LD-53真空冷凍干燥機，NV 4750E二氧化碳培養(yǎng)箱，MB100-2A微孔板恒溫振蕩器，EnSpire多功能酶標儀，SX-500高壓蒸汽滅菌鍋。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽的制備

40 g玉米醇溶蛋白用蒸餾水配成底物質(zhì)量濃度0.05 g/mL的懸浮液，在pH 8.5、溫度60 ℃、Alcalase酶與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比3%、時間2.0 h條件下酶解2.0 h。酶解結(jié)束后，收集上清液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米肽[15]。

1.3.2 玉米糖肽的制備

將玉米肽配成質(zhì)量濃度為0.03 g/mL的溶液，按玉米肽與D-氨基葡萄糖的質(zhì)量比1∶3加入D-氨基葡萄糖，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.7，按加酶量55 U/g蛋白加入TGase，在44 ℃恒溫水浴振蕩器中糖基化反應(yīng)7 h。7 h后，將反應(yīng)物立即放入85 ℃水浴中滅酶5 min。冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，收集上清液過截斷分子質(zhì)量300 u的納濾膜，透過液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米糖肽混合物[16]。

1.3.3 玉米糖肽的體外消化

將底物質(zhì)量濃度為0.1 g/mL 的玉米糖肽和玉米肽溶液分別用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，按酶與底物的質(zhì)量比為2%加入胃蛋白酶，37 ℃條件下水解90 min。用6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，按酶與底物的質(zhì)量比為4%加入胰蛋白酶，37 ℃條件下水解240 min。酶解產(chǎn)物經(jīng)沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫后冷凍干燥，獲得玉米糖肽和玉米肽消化產(chǎn)物。

1.3.4 利用體外化學法研究玉米糖肽的抗氧化活性

用3種自由基(包括DPPH、羥基和超氧陰離子)清除能力、Fe2+螯合能力和還原力表征玉米糖肽的抗氧化活性，參照Wang等[17]描述的方法進行測定。

1.3.5 體外消化對玉米糖肽分子質(zhì)量分布的影響

采用配有凝膠層析色譜柱Superdex Peptide 10/300 GL的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)測定。色譜柱先用藍色葡聚糖2000測定外水體積V0，用標準蛋白(aprotinine, 6 500 u；桿菌肽, 1 400 u；氧化型谷胱甘肽, 612 u；還原型谷胱甘肽，307 u)進行校正。將樣品配成蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，經(jīng)離心和0.22 μm微孔濾膜過濾后加載于色譜柱。上樣體積100 μL，流速0.25 mL/min，檢測波長214 nm。溶解樣品及色譜柱的平衡和洗脫均采用pH 7.0、20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含有0.15 mol/L NaCl)?；跇悠方M分的洗脫體積(Ve)計算有效分配系數(shù)及樣品組分的分子質(zhì)量。

1.3.6 利用H2O2誘導的Caco-2細胞氧化性損傷模型研究玉米糖肽的抗氧化活性

1.3.6.1 玉米糖肽對Caco-2細胞毒性的測定

采用細胞存活率表征玉米糖肽是否對Caco-2細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。取96孔板，每孔加入100 μL、細胞密度為1×105個細胞/mL(以下實驗均采用該密度)、對數(shù)生長期的Caco-2細胞懸液，在37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分為樣品組和對照組，樣品組中每孔加入100 μL玉米糖肽溶液，使終濃度分別為5、25、50、100、200、500、1 000 μg/mL，對照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄孔內(nèi)液體，細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同)洗2次，然后每孔加入100 μL PBS緩沖液和終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h后用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光值，并計算Caco-2細胞的存活率。

1.3.6.2 H2O2氧化應(yīng)激條件下玉米糖肽對Caco-2細胞存活率的影響

將100 μL對數(shù)期Caco-2細胞懸液接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL終質(zhì)量濃度分別為5、50、100、200、500、1 000 μg/mL (同時設(shè)置對照組和H2O2組)的玉米糖肽溶液，作用6 h后吸棄孔內(nèi)液體，加入200 μL 200 μmol/L H2O2溶液培養(yǎng)4 h進行造模，根據(jù)1.3.6.1中 MTT法測定細胞存活率。

1.3.6.3 玉米糖肽對H2O2誘導的氧化性損傷Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響

按1.3.6.2的方法細胞培養(yǎng)和造模，玉米糖肽的終質(zhì)量濃度分別為5、25、50、75 μg/mL。培養(yǎng)結(jié)束后，加入適量胰蛋白酶消化細胞，并收集細胞沉淀。用PBS緩沖液洗滌細胞1次后加入高效RIPA裂解液，4 ℃裂解20～30 min，10 000 r/min 離心5 min后，收集上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取適量裂解液放置于冰水浴中，按照試劑盒說明書測定SOD、CAT、GR和γ-GCS活力，酶活力單位以U/mg表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗，各組間多重比較采用LSD法，P<0.05認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽抗氧化活性的影響

2.1.1 DPPH自由基清除能力

以GSH為陽性對照，測定糖基化修飾對玉米肽以及體外消化對玉米糖肽DPPH自由基清除活性的影響，結(jié)果如圖1所示。

TGase催化的糖基化反應(yīng)使玉米肽對DPPH自由基的清除能力顯著增加(P<0.05)；經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化后，玉米糖肽的DPPH自由基清除能力顯著增加(P<0.05)，而玉米肽質(zhì)量濃度為1.5、2.0 mg/mL時DPPH自由基清除能力也顯著增加。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，玉米糖肽消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為78.27%，比消化前提高19.07%，比玉米肽高30.8%，與0.5 mg/mL GSH的清除能力相當。相對于玉米肽而言，玉米肽與D-氨基葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后，D-氨基葡萄糖分子上具有還原性的半縮醛羥基以及碳氫鏈上的羥基結(jié)構(gòu)能夠提供更多H+將DPPH自由基還原成穩(wěn)定的DPPH-H，從而糖基化產(chǎn)物具有更強的DPPH自由基清除能力。同理，體外消化過程可以將更多氫或電子供體暴露出來，可以更有效的捕獲DPPH自由基，導致消化產(chǎn)物具有更強的DPPH自由基清除能力。García-Mora等[18]研究了體外消化對小扁豆肽抗氧化活性穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)消化酶的作用會增加小扁豆肽的抗氧化活性，這是因為小扁豆肽經(jīng)消化釋放出的較小的肽片段和氨基酸會對抗氧化活性產(chǎn)生加性和協(xié)同的生物學效應(yīng)，與本研究的結(jié)果一致。

注：相同質(zhì)量濃度不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽DPPH自由基清除能力的影響

2.1.2 羥基自由基清除能力

以GSH為陽性對照，測定樣品對羥基自由基的清除活性，結(jié)果如圖2所示。

糖基化修飾使玉米肽對羥基自由基的清除能力顯著增加，尤其是在1.5 mg/mL時，其清除能力與同濃度GSH相當。經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，除0.5 mg/mL外，玉米糖肽的羥基自由基清除能力雖然增加，但與消化前相比無顯著性差異(P>0.05)。在質(zhì)量濃度為1～2 mg/mL范圍內(nèi)，與玉米肽相比，玉米糖肽的羥基自由基清除能力增強，分析有兩方面原因：玉米糖肽作為氫供體與羥基自由基反應(yīng)，將其還原成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而被猝滅；玉米糖肽作為金屬離子螯合劑與過渡態(tài)金屬離子如Fe2+發(fā)生螯合作用，破壞Fenton 反應(yīng)或者Haber-Weiss反應(yīng)，抑制了羥基自由基的產(chǎn)生，進而減少了戊糖氧化產(chǎn)物的生成。

體外消化不能破壞玉米糖肽對羥基自由基的清除能力，這可能歸因于3個方面：與玉米糖肽的氨基酸組成有關(guān)。Ren等[19]發(fā)現(xiàn)含有Pro、Glu和Asp的玉米蛋白水解物對消化酶具有很強的抵抗力，而玉米糖肽富含Pro、Glu和Asp[20]；與玉米糖肽的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。玉米糖肽的分子質(zhì)量小，空間構(gòu)象簡單，又由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的位點特異性，兩步消化對玉米糖肽的組成和構(gòu)象影響較小，進而沒有對玉米糖肽的羥基自由基清除能力產(chǎn)生顯著性影響；與制備玉米糖肽的蛋白酶種類有關(guān)。Xie等[21]研究了體外消化過程中酪蛋白抗氧化肽的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶Alcalase 可以促進抗胃腸消化肽的產(chǎn)生。

圖2 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽羥基自由基清除能力的影響

2.1.3 超氧陰離子自由基清除活性

以GSH為陽性對照，測定樣品對超氧陰離子自由基的清除活性，結(jié)果如圖3所示。D-氨基葡萄糖的共價修飾使玉米肽的超氧陰離子自由基清除能力顯著增加(P<0.05)，且胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用不能破壞玉米糖肽的超氧陰離子自由基清除能力。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，玉米糖肽消化產(chǎn)物的清除率為32.46%，比消化前高3.63%；玉米肽消化產(chǎn)物的清除率為21.93%，比消化前高2.44%；玉米糖肽的清除率為28.82%，比玉米肽高9.33%，可能是因為D-氨基葡萄糖的多羥基結(jié)構(gòu)和玉米肽分子中的抗氧化活性氨基酸殘基使玉米糖肽成為良好的供氫體，猝滅了超氧陰離子自由基。

圖3 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽超氧陰離子自由基清除能力的影響

2.1.4 還原力

還原力也是待測樣品抗氧化能力強度的測定，結(jié)果如圖4所示。TGase催化的糖基化反應(yīng)使玉米肽的還原能力顯著增加。在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，玉米糖肽的還原力為0.909，比玉米肽高0.765，是同濃度GSH的3.56倍，說明D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使玉米肽成為良好的電子供體，具有更強的還原力。經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，玉米糖肽和玉米肽的還原力與消化前相比均增加，可能歸因于2個方面：隨著水解程度的增加，更多的極性或帶電荷氨基酸側(cè)鏈基團暴露出來；在消化過程中，肽鍵斷裂提供了質(zhì)子和電子的額外來源，以維持高氧化還原電位。Zhu等[22]研究了體外消化對玉米醇溶蛋白源玉米肽還原力的影響，也發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶1 h和胰酶2 h處理后消化產(chǎn)物的還原能力增加。

圖4 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽還原力的影響

2.1.5 Fe2+螯合能力

Fe2+是過渡態(tài)金屬離子中最強大的助氧化劑，其具有通過Fenton反應(yīng)或Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基的能力[23]。因此，具有Fe2+螯合能力就能抑制羥基自由基的產(chǎn)生，進而延遲氧化反應(yīng)，待測樣品Fe2+螯合能力的測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 糖基化對玉米肽和體外消化對玉米糖肽Fe2+螯合能力的影響

與玉米肽相比，糖基化修飾使玉米肽的Fe2+螯合能力顯著增加(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，玉米糖肽的Fe2+螯合率比同濃度玉米肽高18.67%，是同濃度GSH的1.68倍。Saiga等[24]發(fā)現(xiàn)酸性氨基酸殘基(Asp和Glu)和堿性氨基酸殘基(His、Lys和Arg)由于自身的電荷特性，側(cè)鏈中的羧基和氨基在肽的Fe2+螯合能力中起著至關(guān)重要的作用。Yang等[25]也發(fā)現(xiàn)包含Glu、Gln和Lys的肽比不包含這些氨基酸的肽表現(xiàn)出更強的Fe2+螯合能力。玉米肽和玉米糖肽均富含Asp、Glu、His和Arg等殘基[20]，且玉米肽分子上共價結(jié)合的D-氨基葡萄糖的多羥基結(jié)構(gòu)也有助于螯合Fe2+[26]，因此，玉米糖肽和玉米肽均具有Fe2+螯合能力，且玉米糖肽的螯合效果高于玉米肽。

經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，玉米糖肽和玉米肽的Fe2+螯合率均顯著降低。孫宏[27]研究了體外消化對棉籽肽的Fe2+螯合能力的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶消化后棉籽肽的Fe2+螯合能力顯著降低(P<0.05)。肽的金屬離子螯合能力可以通過與帶電荷的氨基酸殘基間靜電相互作用完成，也可以在結(jié)構(gòu)上通過對過渡態(tài)金屬離子的俘獲作用完成[28]。經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用導致肽捕獲金屬離子的結(jié)構(gòu)喪失，進而Fe2+螯合活性急劇下降。

因此，玉米糖肽的抗氧化能力與其供氫及電子轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，這些活性是糖基部分和作為底物的玉米肽的協(xié)同作用。

2.2 體外消化對玉米糖肽分子質(zhì)量分布的影響

將樣品配制成2 mg/mL的溶液，測定玉米糖肽經(jīng)胃蛋白酶消化90 min和玉米糖肽經(jīng)胃蛋白酶消化90 min和胰蛋白酶消化240 min時水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，洗脫圖譜如圖6所示。

由圖6a可看出，玉米糖肽的分子質(zhì)量分布比較寬，主要由3個分子質(zhì)量組分構(gòu)成，其中保留時間大于18.69 min的分子質(zhì)量小于300 u的組分質(zhì)量分數(shù)為4.77%；在圖6b中，經(jīng)胃蛋白酶消化90 min后，玉米糖肽消化產(chǎn)物組分的保留時間向右移動，說明與玉米糖肽相比消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量減小，具體表現(xiàn)為保留時間為16.92 min組分的含量降低，而保留時間為18.38 min的分子質(zhì)量小于300 u的組分質(zhì)量分數(shù)增加，達到14.29%；在圖6c中，玉米糖肽的分子質(zhì)量進一步減少，由圖6b的3個組分變成6個組分，主要組分的分子質(zhì)量集中在保留時間17.03 min(52.08%)，說明胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用，進一步將玉米糖肽的分子質(zhì)量降解為分子質(zhì)量更小的肽段，甚至是游離氨基酸。綜合分析，胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用使玉米糖肽的分子組成發(fā)生變化，將玉米糖肽清除自由基的抗氧化活性釋放出來，同時破壞了玉米糖肽螯合Fe2+的結(jié)構(gòu)。

圖6 玉米糖肽及其體外消化產(chǎn)物的凝膠層析洗脫圖譜

2.3 利用H2O2誘導的Caco-2細胞氧化性損傷模型研究玉米糖肽的抗氧化活性

2.3.1 玉米糖肽對Caco-2細胞的毒性效應(yīng)

細胞毒性分析是評估功能性食品生物安全性最重要的檢測方法之一。不同濃度玉米糖肽作用Caco-2細胞6 h后，采用MTT法測定細胞存活率，以表征玉米糖肽的預處理是否對Caco-2細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。

在質(zhì)量濃度為5～50 μg/mL范圍內(nèi)，隨著玉米糖肽濃度的增加，Caco-2細胞存活率呈逐漸增加的變化趨勢，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；當玉米糖肽質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，Caco-2細胞存活率顯著增加(P<0.05)，增加了7.05%；玉米糖肽的濃度繼續(xù)增加，Caco-2細胞的存活率略有下降，但與對照組相比也沒有顯著性差異(P>0.05)，說明在實驗濃度范圍內(nèi)，玉米糖肽對Caco-2細胞沒有毒性，是安全的生物功能因子。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 不同濃度玉米糖肽對Caco-2細胞存活率的影響

2.3.2 玉米糖肽對H2O2誘導損傷的Caco-2細胞存活率的影響

Caco-2細胞先用玉米糖肽預處理6 h，然后暴露于200 μmol/L H2O2溶液中，研究玉米糖肽對H2O2誘導損傷的Caco-2細胞存活率的影響，結(jié)果如圖8所示。與對照組相比，用200 μmol/L H2O2作用4 h后，Caco-2細胞存活率極顯著降低(P<0.01)，降低了40.5%，表明Caco-2氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。玉米糖肽的預處理在一定程度上改善了受損細胞的存活率，且改善的效果呈劑量依賴性。與H2O2組相比，500 μg/mL玉米糖肽的預處理使Caco-2細胞存活率提高12.57%，1 000 μg/mL玉米糖肽的預處理使Caco-2細胞存活率提高18.65%，可能是因為玉米糖肽可以有效地進入細胞內(nèi)并與氧化應(yīng)激相關(guān)途徑相互作用[29,30]，加速清除細胞內(nèi)過量的H2O2、超氧陰離子等活性氧自由基而提高了細胞存活率。

注：**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，##表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)。圖8 玉米糖肽對H2O2誘導的氧化應(yīng)激條件下Caco-2細胞存活率的影響

2.3.3 玉米糖肽對H2O2誘導損傷Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響

為了進一步表征玉米糖肽的抗氧化能力，研究了其對氧性損傷Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響，結(jié)果如表1所示。與對照組相比，H2O2組細胞內(nèi)CAT、SOD、γ-GCS和GR的活力分別降低了80.08%、31.69%、67.38%和70.40%，進一步說明Caco-2細胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。與H2O2組相比，玉米糖肽以劑量依賴的方式拮抗了氧化應(yīng)激細胞內(nèi)抗氧化酶活力的降低。其中，50 μg/mL玉米糖肽的預處理可以使SOD、γ-GCS、GR和CAT活力顯著提高(P<0.05)，分別是H2O2組的1.09、2.75、2.54倍和3.21倍，75 μg/mL玉米糖肽的預處理甚至使4種內(nèi)源抗氧化酶活力恢復到正常水平，與75 μg/mL玉米肽組的GR、SOD、CAT和γ-GCS活力相比分別高6.47%、0.88%、10.77%和0.96%[15]，進一步說明D-氨基葡萄糖的糖基化修飾改善了玉米肽的抗氧化活性。這樣，低劑量玉米糖肽的預處理可以通過增加Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶的活力，加速細胞內(nèi)活性氧自由基的清除，進而拮抗了H2O2誘導的Caco-2細胞的氧化性損傷。

表1 玉米糖肽對H2O2誘導損傷Caco-2細胞內(nèi) 抗氧化酶活力的影響

3 結(jié)論

以還原型GSH為陽性對照，研究了糖基化修飾對玉米肽以及體外消化對玉米糖肽抗氧化活性的影響，同時構(gòu)建H2O2誘導的Caco-2細胞氧化性損傷模型，在細胞水平上對玉米糖肽的抗氧化活性進行研究。D-氨基葡萄糖的糖基化修飾使玉米肽的抗氧化活性顯著增加(P<0.05)，且具有劑量依賴性，并且除Fe2+螯合能力外，體外模擬消化不能破壞玉米糖肽的自由基清除能力和還原力，說明玉米糖肽在胃腸道消化過程中仍能保持其抗氧化活性，能夠以活性形式到達血液，進而在體內(nèi)發(fā)揮其抗氧化活性。另外，質(zhì)量濃度為5～1 000 μg/mL的玉米糖肽對Caco-2細胞沒有毒性，質(zhì)量濃度為75 μg/mL的玉米糖肽可以顯著提高氧化損傷Caco-2細胞內(nèi)SOD、GR、CAT和γ-GCS抗氧化酶的活力，從提高細胞抗氧化水平的角度提高了細胞存活率。在此基礎(chǔ)上，需要對玉米糖肽的抗氧化機制進行研究。