李峰，何立

西安建筑科技大學體育學院，西安 710055

隨著對大氣顆粒物的深入研究和人們健康意識的增強，關(guān)于細顆粒物(fine particular matter,PM2.5)對運動人體健康風險評價的研究也日趨增多。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，作為一類主要的污染物，PM2.5可以通過多種途徑進入生物體內(nèi)，在體內(nèi)產(chǎn)生含氧自由基等活性氧物質(zhì)[1]，并通過多種信號通路及酶反應(yīng)引起氧化應(yīng)激，造成生物體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化[2]、蛋白質(zhì)損傷和酶失活等[3]，引起機體發(fā)生氧化應(yīng)激。尤其是在運動的狀態(tài)下，由于呼吸加深加快，會使機體吸入更多的PM2.5，并且隨著血液循環(huán)進入到身體各組織中，誘導(dǎo)產(chǎn)生心肺功能障礙，造成機體的系統(tǒng)性損傷。目前，我國國內(nèi)從多器官水平上研究不同濃度PM2.5對運動狀態(tài)下機體氧化-抗氧化網(wǎng)絡(luò)的影響尚處在探索階段。因此，本研究通過收集體育場館內(nèi)PM2.5，研究其對運動狀態(tài)大鼠肺和心臟抗氧化系統(tǒng)的影響，以期為評價體育場館內(nèi)細顆粒物濃度和機體氧化損傷之間的關(guān)系提供理論依據(jù)，同時也為PM2.5暴露劑量-運動反應(yīng)之間的關(guān)系機制提供一定的實驗依據(jù)，研究結(jié)果亦可以為霧霾天氣下健身鍛煉者提供防護參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備

利用TH-150C型顆粒物智能采樣器(武漢天虹)采集某校體育館內(nèi)PM2.5，采樣前清理采樣點周圍的運動器械及其他物品，同時確定采樣點為非污染源。為了最大程度模擬PM2.5對運動機體的影響，將儀器放置在人體呼吸帶高度(1.5 m)，同時采用同心圓方式選取5個點，每2個采樣點之間相距5 m左右，使采樣儀器離墻>1 m、離門窗>3 m，空氣流量為1.13 m3·min-1。采樣時將已經(jīng)真空干燥、稱量質(zhì)量的濾膜放入采樣夾的濾網(wǎng)上，濾膜毛面朝進氣方向，將濾膜壓緊至不漏氣。采樣結(jié)束后將濾膜真空干燥，根據(jù)采樣前、后濾膜質(zhì)量差和采樣體積得出顆粒物的質(zhì)量濃度。將收集了PM2.5的玻璃纖維濾膜裁剪為小塊后浸入去離子水中，經(jīng)超聲振蕩4次，每次30 min后用去離子水洗脫顆粒物，然后將濾液在4 ℃離心20 min(1 000 r·min-1，離心半徑59 mm)，真空干燥后稱量質(zhì)量，-20 ℃保存。為保證顆粒物實際毒性效果，實驗并未對顆粒物進行消毒滅菌處理，滴注前用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度，超聲振蕩15 min使染毒懸液均勻，并滅菌備用。

1.2 實驗動物染毒劑量與染毒方式

運動大鼠采用非暴露式PM2.5氣管滴注染毒，滴注時保持室內(nèi)溫度在20～26 ℃之間，室內(nèi)相對濕度為44%～70%。滴注前先將染毒懸液預(yù)溫至37 ℃，在大鼠乙醚麻醉后，分別按低(7.5 mg·kg-1)、中(15 mg·kg-1)和高(30 mg·kg-1)3種劑量經(jīng)氣管注入PM2.5顆粒物懸液，對照組滴注同等容量的生理鹽水，實驗大鼠染毒后進行運動。

1.3 實驗動物分組與運動方案

實驗動物選用32只7周齡健康雄性SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g。動物購回后在溫度為20～26 ℃、濕度為44%～70%的常規(guī)飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由進食和飲水，照明隨同光照自然變化。所有動物處置均依照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求進行[4]。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后將大鼠隨機分為對照組(control group,CG)、高劑量染毒組(high-dose group,30 mg·kg-1,HG)、中劑量染毒組(middle-dose group,15 mg·kg-1,MG)和低劑量染毒組(low-dose group,7.5 mg·kg-1,LG)4組，每組8只，根據(jù)大鼠體質(zhì)量/攝氧量回歸方程建立遞增負荷運動模型，正式訓(xùn)練前將所有大鼠以10 m·min-1、5 min·d-1的方案先進行2 d的適應(yīng)性訓(xùn)練，具體運動方案如表1所示。

表1 實驗大鼠運動方案Table 1 Training program of experimental rats

1.4 肺泡灌洗液(BALF)和心臟組織勻漿的制備與指標測試

1.4.1 BALF制備

運動結(jié)束后用乙醚麻醉處死大鼠，切開頸部皮膚，暴露氣管，結(jié)扎左肺，在主氣管處剪一“V”形小切口，插人灌洗針頭，結(jié)扎固定。注射器抽取37 ℃生理鹽水緩慢注入肺內(nèi)，同時輕輕按摩胸壁，待右肺變得膨隆后緩慢抽出灌洗液。灌洗2次，第1次注入6 mL，第2次注入3 mL，混勻抽吸2次，至灌洗液總量為6 mL。然后以4 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min，取上清液于-20 ℃保存待測。

1.4.2 心臟組織勻漿液制備

大鼠宰殺后即刻稱取適量心臟組織，加入0.9%的生理鹽水，按體質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4，0.01 mol·L-1Tris-HCl，0.0001 mol·L-1EDTA-2Na，0.01 mol·L-1蔗糖，0.8%的NaCl溶液)于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，然后倒入研缽中按照順時針方向進行研磨至糊狀。勻漿液通過二層紗布過濾后按試劑盒要求分別于低溫冷凍離心機4 000 r·min-1離心10 min，分離上清液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆没蚶洳鼗?20 ℃冰箱冰凍備用，使用前按照試劑盒要求作相應(yīng)的稀釋。

1.4.3 指標測試

采用5,5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxide,GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量；采用羥胺氧化法測定總抗氧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性；過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)采用分光光度方法測定。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同劑量PM2.5暴露對運動大鼠BALF抗氧化酶活性的影響

如表2所示，和CG組相比，除CAT之外，LG組中GSH-Px、T-SOD活性和GSH含量均高于CG組，其中GSH-Px活性有極顯著性差異(P<0.01)；除GSH含量外，MG組、HG組GSH-Px、T-SOD和CAT活性呈劑量相關(guān)性下降，其中，GSH-Px、T-SOD活性與CG組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)，而GSH含量雖呈劑量相關(guān)性下降，但仍高于CG組，且有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。

表2 PM2.5暴露對大鼠BALF抗氧化酶活性的影響(n=8)Table 2 Effects of PM2.5 exposure on antioxidant enzymes activity of BALF in rats (n=8)

2.2 PM2.5 暴露對運動大鼠心臟抗氧化酶活性的影響

如表3所示，和CG組相比，在3個劑量組中，隨著PM2.5劑量的增加T-SOD活性逐漸下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)；而LG組GSH-Px活性與CG組相比略有上升，但MG組和HG組呈下降趨勢，且HG組與CG組相比有顯著性差異(P<0.05)。

表3 PM2.5暴露對運動大鼠心臟抗氧化酶活性影響(n=8)Table 3 Effects of PM2.5 exposure on antioxidant enzymes activity of heart in rats (n=8) (U·mL-1)

2.3 PM2.5 暴露對運動大鼠BALF自由基含量的影響

運動及不同濃度PM2.5染毒對大鼠BALF自由基含量的影響如表4所示，由表4可知，和CG組相比，在3個不同劑量的PM2.5暴露組中，BALF中自由基含量隨著PM2.5暴露劑量的增加呈劑量相關(guān)性上升，差異有統(tǒng)計學意義。

表4 PM2.5對訓(xùn)練大鼠BALF中丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量的影響(n=8)Table 4 The influence on malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) content of BALF of training rats after PM2.5 exposure (n=8) (U·mL-1)

2.4 PM2.5暴露對運動大鼠心臟自由基含量的影響

由表5可知，和CG組相比，在3個不同劑量的PM2.5暴露組中，隨著PM2.5暴露劑量的增加，MDA和ROS含量也成劑量相關(guān)性上升，差異有統(tǒng)計學意義。

表5 PM2.5對訓(xùn)練大鼠心臟MDA、ROS含量的影響(n=8)Table 5 The influence on (MDA) and (ROS) content of heart of training rats after PM2.5 exposure (n=8) (U·mL-1)

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5暴露對運動大鼠BALF抗氧化酶活性的影響

抗氧化系統(tǒng)作為內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)因素之一，可以通過非酶類物質(zhì)和酶類如抗氧化酶構(gòu)成抗氧化防御的屏障，從而消解自由基對機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞。PM2.5的機械損傷和生物化學損傷，會加重呼吸系統(tǒng)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，BALF中抗氧化酶活性的改變是衡量PM2.5致肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)重要參考指標。心臟作為機體的動力器官，在運動過程中易受到外界應(yīng)激，引起結(jié)構(gòu)與功能改變[5]。以往研究表明，吸入空氣污染物會影響心率變異性、血管張力和動脈粥樣硬化的進展[6]。

由本實驗結(jié)果可知，不同劑量的PM2.5暴露對運動大鼠BALF內(nèi)的GSH-Px、T-SOD、GSH和CAT產(chǎn)生不同的影響。其中和CG組相比，LG組中GSH-Px、T-SOD活性和GSH含量均出現(xiàn)上升趨勢，而CAT活性下降。而隨著PM2.5暴露劑量的增加，4個指標均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性下降。分析其原因可能是由于大鼠在運動過程中受到神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)，促進抗氧化酶活性的暫時性升高，以對抗運動過程中產(chǎn)生的自由基及PM2.5暴露帶來的負面影響，但是由于低劑量的PM2.5暴露對GSH-Px和T-SOD的負面影響不足以破壞機體的抗氧化防御系統(tǒng)，因此在LG組中呈現(xiàn)出GSH-Px和T-SOD活性升高的現(xiàn)象。

由于不同抗氧化酶的底物特異性、親合性以及在細胞中的位置不同，而且機體內(nèi)決定抗氧化酶活性變化的一些因素很大程度上取決于不同的外界應(yīng)激源及干擾因素，所以LG組CAT的降低，可能是低濃度的PM2.5暴露作為一種觸發(fā)因素，使CAT在PM2.5的刺激下出現(xiàn)防御性下降；但是隨著PM2.5暴露劑量的增加，MG和HG組中各酶活性出現(xiàn)顯著性下降，主要機制可能是PM2.5中的重金屬有機成分可以誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，或通過GSH、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生自由基[7]。當氧化應(yīng)激增強時，細胞內(nèi)ROS水平的升高導(dǎo)致溶酶體膜損傷，刺激肺組織與系統(tǒng)炎性因子和氧自由基的釋放，繼而促使氧化損傷[8]。染毒組GSH含量下降但仍高于CG組，推測隨著PM2.5劑量的增加，大鼠運動過程中H2O2生成增多，這些自由基與GSH中的—SH結(jié)合，大量消耗了組織中的—SH，加深了抗氧化酶的流失。染毒組GSH含量高于CG組，說明PM2.5染毒和力竭運動中自由基的增加反過來促進了氧化型GSH(GSSG)向還原型GSH的轉(zhuǎn)變，拮抗自由基的損傷。

3.2 PM2.5暴露對運動大鼠心臟抗氧化酶活性的影響

研究結(jié)果顯示，和CG組相比，LG組除GSH-Px外，心肌組織T-SOD和GSH在PM2.5染毒后下降，且T-SOD具有顯著性差異，在MG組和HG組中各酶活性下降。這說明心肌組織在抵抗由于運動和PM2.5染毒帶來的氧化損傷中處于劣勢。推測主要機制是：(1)運動或者PM2.5染毒造成了包括心肌結(jié)構(gòu)改變、心肌間質(zhì)膠原改建和心臟生物化學及心臟功能改變等方面的變化，從而使心臟包括抗氧化在內(nèi)的一系列功能受損；(2)進入呼吸系統(tǒng)的PM2.5可通過血液循環(huán)引起心臟的氧化應(yīng)激，削弱心臟的抗氧化功能，最終引發(fā)心血管系統(tǒng)損傷[9]；(3)PM2.5作用于心臟后，其本身所吸附的有害物質(zhì)會產(chǎn)生自由基，引起膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化或水解，進而引起其抗氧化能力的下降；(4)由于本實驗大鼠的運動方案為一次性急性遞增負荷實驗，因此大鼠在運動過程中的肺通氣量會在短時間的內(nèi)大幅度增加，同時中、高劑量的PM2.5由于攜帶更多的有害物質(zhì)，會通過肺部進入血液循環(huán)，從而引起心臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]；有研究表明，PM2.5對大鼠心臟氧化損傷程度隨PM2.5濃度的增加而增加，說明其抵抗自由基能力變?nèi)鮗11]；由于抗氧化酶活性的下降，誘導(dǎo)或抑制蛋白酶活性、引起心血管系統(tǒng)一系列病理和抗氧化能力的下降[12]。

3.3 PM2.5暴露對運動大鼠BALF和心臟ROS和MDA的影響

正常情況下，體內(nèi)存在抑制自由基反應(yīng)和清除自由基的抗氧化體系，從而維持體內(nèi)自由基代謝的動態(tài)平衡[13]。但是當由于外界的強應(yīng)激導(dǎo)致機體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生紊亂時，可以造成機體自由基代謝的紊亂，使氧化與抗氧化失衡，造成對各組織系統(tǒng)的損傷[14]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，PM2.5暴露可以升高BALF及心肌MDA和ROS的含量，表明當機體處于運動和PM2.5暴露應(yīng)激狀態(tài)時，自由基的生成速度大于抗氧化系統(tǒng)的清除速度，造成ROS在體內(nèi)的累積，對組織和細胞產(chǎn)生危害。尤其是PM2.5刺激組織誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的內(nèi)源性ROS可以作為第二信使，通過改變氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)與細胞增殖、分化及凋亡相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多種靶分子的活性，最終決定細胞的命運[15]。在運動和PM2.5暴露組，各抗氧化酶活性總體呈下降趨勢，而組織中自由基的升高也對應(yīng)了抗氧化酶的降低。

氧自由基的增加可以通過分子機制誘導(dǎo)氧化酶發(fā)生適應(yīng)性變化，大強度訓(xùn)練時機體處于脈沖式的氧化應(yīng)激態(tài)中[16]，同時運動過程中酸性代謝產(chǎn)物的堆積也產(chǎn)生較多的自由基。在低、中、高劑量濃度的PM2.5暴露后，MDA和ROS均呈劑量相關(guān)性升高，因此結(jié)合抗氧化酶的結(jié)果推測，PM2.5所含的炭核、氮、硫、多環(huán)芳烴、內(nèi)毒素、細胞片段和過渡金屬等多種有害的化學成分，可以隨血液循環(huán)通過與各組織細胞接觸，并相互作用釋放出大量的ROS，穿過氣血屏障和血腦屏障，造成組織內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡。