楚艷貞，于林君，張彥昂

冠心病是一種以動(dòng)脈粥樣硬化病變、冠狀動(dòng)脈管腔狹窄、心肌供血減少為主要病理特征的心腦血管疾病[1]。病人臨床表現(xiàn)為胸悶、胸痛等，嚴(yán)重者會(huì)伴有心源性哮喘、暈厥等心肌梗死癥狀。目前，冠狀動(dòng)脈造影檢查是臨床診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn)，可準(zhǔn)確、直觀顯示犯罪血管，但因其屬于有創(chuàng)檢查且費(fèi)用相對(duì)較高，加之心肌本身存在代償功能，發(fā)病早期不易被發(fā)現(xiàn)，延誤診斷與治療，增加主要心血管不良事件(MACE)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。因此，探討簡(jiǎn)便易行且靈敏度高的生物標(biāo)志物對(duì)早期診斷冠心病及預(yù)后評(píng)估尤為關(guān)鍵。冠心病的主要病因在于冠狀動(dòng)脈病變，其中炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝異常等與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。miR-342-5p是早期巨噬細(xì)胞豐富病變中高度上調(diào)的miRNA之一，廣泛參與炎癥反應(yīng)、糖脂代謝過(guò)程，其可通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抑制蛋白激酶 B1(Akt1)蛋白磷酸化及破壞心肌細(xì)胞的作用[5]。潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(LTBP-2)屬于細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白之一，參與彈性纖維凝聚、細(xì)胞黏附、機(jī)體損傷等過(guò)程[6]。細(xì)絲蛋白 A(細(xì)絲蛋白 A)可介導(dǎo)多種細(xì)胞活動(dòng)，其高表達(dá)與炎癥反應(yīng)中內(nèi)皮細(xì)胞遷移密切相關(guān)[7]。但目前臨床上關(guān)于miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白 A水平變化與冠心病的關(guān)系尚未明確。本研究分析冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白 A水平與病情程度及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年5月—2020年11月于我院治療的95例冠心病病人作為病例組，其中，男54例，女41例；年齡42～81(68.29±4.98)歲；體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(23.62±2.19)kg/m2，受教育年限為(10.03±2.46)年；高血壓史26例，糖尿病史9例，飲酒史10例，吸煙史5例；疾病類型：穩(wěn)定型心絞痛42例，不穩(wěn)定型心絞痛30例，心肌梗死23例；心功能分級(jí)：Ⅱ級(jí)49例，Ⅲ級(jí)25例，Ⅳ級(jí)21例。另選取同期60名健康體檢者作為健康組，其中，男34名，女26名；年齡45～79(69.54±5.25)歲；BMI為(22.62±2.59)kg/m2；受教育年限為(9.65±2.05)年。兩組年齡、性別、BMI、受教育年限比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象自愿簽署知情同意書，本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合冠心病[8-10]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查，≥1支冠狀動(dòng)脈血管狹窄≥50%；能配合治療及隨訪。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 伴有免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、感染性疾?。淮嬖诟鞣N急性、慢性感染；既往有冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)等重大手術(shù)史或入組前6個(gè)月內(nèi)接受手術(shù)治療；伴有瓣膜性心臟病、心肌病、甲狀腺疾病；惡性腫瘤；合并彌散性血管內(nèi)凝血、休克等危重狀態(tài)；近6個(gè)月出現(xiàn)腦梗死或新發(fā)腦出血；肝腎功能不全；妊娠期或哺乳期女性。

1.4 研究方法

1.4.1 miR-342-5p檢測(cè) 采集兩組空腹肘靜脈血3 mL，置于EDTA抗凝試管，在4 ℃ 3 000 r/min環(huán)境下離心10 min，提取上清液。提取血漿中總RNA后參照說(shuō)明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(PRISM 7000型定量PCR儀)檢測(cè)miR-342-5p表達(dá)水平。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，采集熒光，以U6作為內(nèi)參，U6：正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-342-5p：正向引物為5′-CTCAACTGGTGTCGTGG AGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAATCAC-3′，反向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGAGGGGTGCTATCTGT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-342-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.4.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 提取病人血清，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman公司)檢測(cè)兩組血清LTBP-2、細(xì)絲蛋白 A、Ⅰ型膠原羧基末端肽(ⅠCTP)、蛋白酶K(CatK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、白介素(IL)-6、IL-10水平；使用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒購(gòu)自湖南普拉特澤生物科技有限公司)檢測(cè)兩組腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；采用免疫散射比濁法(試劑盒購(gòu)自上海羽哚生物科技有限公司)測(cè)定超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。

1.4.3 Gensini評(píng)分 ①病變部位：左主干冠狀動(dòng)脈病變計(jì)5.0分；左前降支或回旋支近段計(jì)2.5分；左前降支中段計(jì)1.5分；右冠狀動(dòng)脈、左回旋支中遠(yuǎn)段、左前降支遠(yuǎn)段計(jì)1.0分；第二對(duì)角支與后側(cè)支計(jì)0.5分。②狹窄程度：狹窄≤25%計(jì)1分；狹窄26%～50%計(jì)2分；狹窄51%～75%計(jì)4分；狹窄76%～90%計(jì)8分；狹窄91%～99%計(jì)16分；100%狹窄計(jì)32分。每處病變部位積分為病變部位評(píng)分與狹窄程度評(píng)分乘積，Gensini評(píng)分為所有病變部位積分之和。輕度：Gensini評(píng)分為1～20分；中度：Gensini評(píng)分為21～40分；重度：Gensini評(píng)分>40分。

1.4.4 隨訪 隨訪1年，統(tǒng)計(jì)病人心源性死亡、嚴(yán)重心律失常、病變血管再狹窄、心肌梗死等MACE發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1 兩組miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A水平比較 病例組miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A水平均高于健康組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A水平比較(±s)

2.2 不同病變程度冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A及Gensini評(píng)分比較 重度組miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A及Gensini評(píng)分均高于中度組、輕度組，中度組miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A及Gensini評(píng)分均高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 不同病變程度冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A、Gensini評(píng)分比較(±s)

2.3 不同病變程度冠心病病人斑塊穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)比較 重度組ⅠCTP、CatK、MMP-2、MMP-9均高于中度組、輕度組，中度組ⅠCTP、CatK、MMP-2、MMP-9均高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3 不同病變程度冠心病病人斑塊穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)比較(±s)

2.4 不同病變程度冠心病病人炎性因子水平比較 重度組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-10水平均高于中度組、輕度組，中度組TNF-α、hs-CRP、IL-6、IL-10水平均高于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表4。

表4 不同病變程度冠心病病人炎性因子水平比較(±s)

2.5 冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A與病情相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A與Gensini評(píng)分、斑塊穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)、炎性因子指標(biāo)均呈正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)表5。

表5 冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A與病情相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.6 不同預(yù)后冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A比較 MACE組miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A均高于非MACE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)表6。

表6 不同預(yù)后冠心病病人miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A比較(±s)

2.7 miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A預(yù)測(cè)冠心病發(fā)生及預(yù)后的價(jià)值 繪制ROC曲線，miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A及三者聯(lián)合預(yù)測(cè)冠心病發(fā)生的AUC分別為0.809，0.779，0.770，0.874，預(yù)測(cè)MACE發(fā)生的AUC分別為0.772，0.821，0.754，0.882。詳見(jiàn)表7及圖1、圖2。

表7 miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A預(yù)測(cè)冠心病、MACE發(fā)生的價(jià)值

圖1 miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A預(yù)測(cè)冠心病發(fā)生的ROC曲線圖

圖2 miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A預(yù)測(cè)MACE發(fā)生的ROC曲線圖

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的發(fā)病基礎(chǔ)，其病理機(jī)制復(fù)雜多樣，多認(rèn)為與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)膜、內(nèi)皮細(xì)胞受損、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞蓄積及增殖等因素相關(guān)[11-12]。隨著病人病情加重，血管腔不斷狹窄至阻塞，心肌細(xì)胞因缺氧、缺血而出現(xiàn)壞死情況，甚至誘發(fā)心源性死亡、嚴(yán)重心律失常、病變血管再狹窄等MACE，不利于病人預(yù)后[13]。因此，準(zhǔn)確評(píng)估冠心病病人疾病嚴(yán)重程度、尋找早期標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)治療、預(yù)防MACE具有重要意義。

miRNA作為一種易感基因，其能夠通過(guò)結(jié)合目標(biāo)mRNA的3′-UTR區(qū)來(lái)誘導(dǎo)目標(biāo)mRNA的降解，調(diào)節(jié)靶基因蛋白以及mRNA表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞血管的生成、分化以及凋亡。miR-342-5p是miR-342家族成員，其參與了結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病過(guò)程。Natarelli等[14]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期鍛煉的人動(dòng)脈血管會(huì)分泌miR-342-5p并運(yùn)送至心臟，保護(hù)心肌細(xì)胞，進(jìn)而預(yù)防心肌梗死發(fā)生。Wei等[15]研究報(bào)道，miR-342-5p通過(guò)抑制Akt1與miR-155依賴途徑而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的炎癥刺激，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。本研究結(jié)果顯示，病例組miR-342-5p高于健康組，MACE組miR-342-5p高于非MACE組，提示miR-342-5p可能參與冠心病的發(fā)生、發(fā)病過(guò)程，可作為預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)，分析原因可能在于miR-342-5p可促進(jìn)炎性因子分泌及調(diào)控脂質(zhì)的攝入，其水平升高時(shí)可加重炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)紊亂程度，增加炎性因子的分泌，從而誘發(fā)冠心病；miR-342-5p可通過(guò)激活機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的傳導(dǎo)過(guò)程，從而誘發(fā)心肌缺血再灌注造成的神經(jīng)損傷；此外，miR-342-5p可通過(guò)抑制c-Jun氨基末端激酶2(c-Jun N-terminal kinase，JNK2)及Caspase-9蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，加速心肌凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致心肌梗死[16]。炎癥反應(yīng)在冠心病發(fā)病機(jī)制中尤為關(guān)鍵，而白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移(TEM)是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。目前，關(guān)于TEM參與冠心病發(fā)病中的炎癥反應(yīng)已被證實(shí)，但臨床上仍缺少關(guān)于其參與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)信號(hào)通路研究。細(xì)絲蛋白-A可介導(dǎo)多種細(xì)胞活動(dòng)，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)絲蛋白-A參與炎癥反應(yīng)中內(nèi)皮細(xì)胞遷移，其過(guò)表達(dá)可抑制TEM[17]。本研究中，病例組病人血清細(xì)絲蛋白-A水平比健康組高，與高貝貝等[18]的研究結(jié)果相似。血清細(xì)絲蛋白-A與Gensini評(píng)分、斑塊穩(wěn)定性、炎性因子水平均呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)血清細(xì)絲蛋白-A與冠心病病情、預(yù)后有關(guān)，但其作用機(jī)制需進(jìn)一步闡明。

LTBP-2作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的受體，其不僅能夠調(diào)節(jié)TGF-β表達(dá)，穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)，影響成纖維細(xì)胞的數(shù)量，其還與腫瘤進(jìn)展、惡性程度、腫瘤分期、腫瘤直徑等病理特征參數(shù)密切相關(guān)[19]。但目前關(guān)于LTBP-2在心血管疾病中的研究報(bào)道較少見(jiàn)。白媛媛等[20]研究顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可經(jīng)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路提升心肌細(xì)胞中LTBP-2表達(dá)，且LTBP-2診斷心力衰竭的作用與N-末端腦鈉肽前體相似。本研究發(fā)現(xiàn)，LTBP-2表達(dá)與冠心病發(fā)生、炎癥反應(yīng)、斑塊穩(wěn)定性及預(yù)后有關(guān)，可能原因與LTBP-2通過(guò)影響心肌重構(gòu)、心肌纖維化等因素而導(dǎo)致病情進(jìn)展相關(guān)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A預(yù)測(cè)冠心病病人MACE發(fā)生的AUC分別為0.772，0.821，0.754，最佳截?cái)嘀捣謩e為0.31、22.02 μg/L、53.95 ng/mL，而三者聯(lián)合檢測(cè)的AUC最高，為0.882，說(shuō)明miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A三者聯(lián)合可有效評(píng)估冠心病病人預(yù)后，降低漏診率。

綜上所述，miR-342-5p、LTBP-2、細(xì)絲蛋白-A在冠心病中呈高表達(dá)，與病人病情嚴(yán)重程度、斑塊穩(wěn)定性及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，且三者聯(lián)合有助于預(yù)測(cè)冠心病及MACE的發(fā)生。