基于斑馬魚(yú)模型研究不同磷脂促血管生成活性

解冬曉，李昊楠，孟榮華，李培海，張夢(mèng)啟，翟宏斌，劉可春，馬耀宏，李曉彬,*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，山東 濟(jì)南 250103；2.鄒城市疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)寧 273500；3.北京大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518000）

血管生成是在原有血管基礎(chǔ)上生成新血管的過(guò)程，此過(guò)程受多種誘導(dǎo)因子和抑制因子的相互作用，從而維持機(jī)體處于正常生理健康狀態(tài)。當(dāng)血管生成不足時(shí)，會(huì)引起神經(jīng)缺損、高血壓、腦缺血性中風(fēng)、骨質(zhì)疏松、閉塞性血管炎、糖尿病性周?chē)懿∽兒托募」Ｋ赖纫幌盗邢嚓P(guān)疾病。尋找具有促進(jìn)血管生成作用的藥物是治療上述缺血性疾病的重要策略，也是當(dāng)今臨床研究的熱點(diǎn)。

血管生成藥物的發(fā)現(xiàn)需要借助血管生成模型，常見(jiàn)的血管生成模型包括體外模型（內(nèi)皮細(xì)胞模型和大鼠動(dòng)脈環(huán)模型）、體內(nèi)模型（角膜微囊、雞胚絨毛尿囊膜、圓盤(pán)血管生成模型和海綿-基質(zhì)膠模型等）和整體動(dòng)物模型（斑馬魚(yú)模型和爪蟾蝌蚪模型）。其中，斑馬魚(yú)模型具有體型小、產(chǎn)卵多、發(fā)育周期短、胚胎透明等優(yōu)點(diǎn)，兼具細(xì)胞模型的高通量性和動(dòng)物模型的高內(nèi)涵性，與人類(lèi)基因組的同源性高達(dá)87%。斑馬魚(yú)符合“3R”原則（reduction, replacement, refinement）（減少、替代、優(yōu)化），被歐洲替代法驗(yàn)證中心推薦為新的模式動(dòng)物，也已被美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）和歐洲藥物評(píng)審組織（The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA）接受用于進(jìn)行藥理學(xué)評(píng)價(jià)申報(bào)臨床試驗(yàn)，因此斑馬魚(yú)作為藥物篩選模式動(dòng)物已得到國(guó)際公認(rèn)。斑馬魚(yú)為體外發(fā)育、胚胎透明，同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)基因綠色熒光標(biāo)記血管使得能夠在活體胚胎中直觀而快捷地觀察樣品對(duì)其血管系統(tǒng)的影響。目前，作為藥物篩選模型，斑馬魚(yú)已越來(lái)越多的被研究團(tuán)隊(duì)用于血管功能分子的篩選與評(píng)價(jià)。本研究利用斑馬魚(yú)模型，評(píng)價(jià)各磷脂樣品對(duì)Vatalanib（PTK787）誘導(dǎo)損傷的斑馬魚(yú)體節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）和腸下靜脈血管（subintestinal vein vessel，SIV）生長(zhǎng)情況的影響，綜合評(píng)估和比較不同磷脂的促血管生成活性。

磷脂廣泛存在于生物體內(nèi)，是各種生物膜的重要組成部分，在調(diào)控機(jī)體代謝等方面起著至關(guān)重要的作用。磷脂具有豐富的生物活性和保健功能，如在預(yù)防心腦血管疾病方面，可以降血脂、促進(jìn)血液循環(huán)。現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)磷脂具有保護(hù)或促進(jìn)血管生成的作用，例如增加不飽和脂肪酸的攝入可以改善臨床病理性血管生成減弱的現(xiàn)象，溶血磷脂酰膽堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞具有增殖作用。本課題組前期研究也初步發(fā)現(xiàn)來(lái)源于蝦頭的磷脂對(duì)斑馬魚(yú)血管生成具有較好的促進(jìn)作用，但目前鮮有研究以血管生成作為靶點(diǎn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)磷脂的生物活性。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇不同來(lái)源、不同類(lèi)型的磷脂，利用斑馬魚(yú)血管生成模型，綜合比較磷脂成分的促血管生成活性，以期為以磷脂作為有效成分進(jìn)行促血管生成類(lèi)藥品和保健食品、特醫(yī)食品等功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（∶）由山東省科學(xué)院生物研究所提供，斑馬魚(yú)飼養(yǎng)于斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，溫度（28.0±0.5）℃，每天重復(fù)14 h黑暗和10 h光照交替的循環(huán)，每日喂食顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體兩次。

南美白對(duì)蝦蝦頭、雞蛋和大豆購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；大豆磷脂軟膠囊、魚(yú)油軟膠囊、卵磷脂絡(luò)合碘片、多烯磷脂酰胺膽堿膠囊購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍辍?/p>

1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）、鏈酶蛋白酶Ev、Vatalanib（PTK787）、丹參素鈉（salvianic acid A sodium，SAAS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）美國(guó)Sigma公司；丹紅注射液（10 mL/支） 山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司；乙醇、丙酮等分析純 山東沃恩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

斑馬魚(yú)養(yǎng)殖飼養(yǎng)系統(tǒng) 北京愛(ài)生科技公司；體視熒光顯微鏡 德國(guó)蔡司公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1260超高效液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 磷脂提取物的制備及實(shí)驗(yàn)用磷脂的準(zhǔn)備

參考文獻(xiàn)[11]的方法，以大豆、蛋黃、南美白對(duì)蝦蝦頭為原料分別進(jìn)行磷脂提取物的制備：將各原料分別粉碎、勻漿，按料液比1∶10（/）加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，攪拌提取2 次，每次提取6 h，合并提取液，將提取液減壓抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后蒸干，再溶于50 mL的溶液（（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% CaCl）∶（無(wú)水乙醇）＝1∶20）中，加入溶液4 倍體積的正己烷萃取，正己烷層使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮；加入正己烷，配成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的溶液，加入溶液10 倍體積的丙酮混勻，4 ℃靜置24 h，離心（10 000 r/min、10 min），沉淀于真空干燥箱45 ℃干燥獲得各磷脂提取物。所得大豆、蛋黃、南美白對(duì)蝦磷脂提取率分別為0.15%、4.63%和0.43%（磷脂提取物質(zhì)量除以原料質(zhì)量得到）。采用分光光度法（鉬藍(lán)比色法）測(cè)定磷脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)得大豆、蛋黃、南美白對(duì)蝦磷脂提取物中總磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為47.32%、83.79%和73.28%。

實(shí)驗(yàn)所用磷脂包括不同來(lái)源及不同類(lèi)型的磷脂。不同來(lái)源的磷脂包括商用的大豆磷脂軟膠囊、魚(yú)油軟膠囊、卵磷脂絡(luò)合碘片、多烯磷脂酰胺膽堿膠囊，其中膠囊破碎后取內(nèi)容物，藥片碾碎成粉末。本實(shí)驗(yàn)所用磷脂提取物分別提取自大豆、蛋黃、南美白對(duì)蝦蝦頭；不同類(lèi)型磷脂包括PE、PC、PI、PS、PM 5 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2 斑馬魚(yú)胚胎的準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)選用血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（∶）作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，按雌雄?shù)量1∶2的比例取健康成熟的斑馬魚(yú)放入交配缸內(nèi)，中間放置隔板。次日亮燈前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵1 h后收集受精卵，并用新鮮養(yǎng)魚(yú)水沖洗3 次。為避免發(fā)育過(guò)程中的色素沉著影響結(jié)果，在含胚胎的養(yǎng)魚(yú)水中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的PTU，放入28 ℃光照培養(yǎng)箱中控光培養(yǎng)，中間每24 h更換約1/3養(yǎng)魚(yú)水，并及時(shí)吸出死亡胚胎。

1.3.3 促進(jìn)斑馬魚(yú)ISV生成的活性評(píng)價(jià)

將1.3.2節(jié)發(fā)育至24 h的斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)分為6 組，即空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和磷脂樣品組（3 個(gè)劑量），置于24 孔板中，每組3 個(gè)平行孔，每孔10 枚胚胎。空白對(duì)照組加2 mL養(yǎng)魚(yú)水，模型組加入2 mL含0.25 μg/mL PTK787的養(yǎng)魚(yú)水，陽(yáng)性對(duì)照組加2 mL含有PTK787（0.25 μg/mL）和SAAS（100 μg/mL）的養(yǎng)魚(yú)水，磷脂3 個(gè)劑量組分別加入2 mL含有PTK787（終質(zhì)量濃度0.25 μg/mL）和磷脂樣品（終質(zhì)量濃度分別為20、40、80 μg/mL）的養(yǎng)魚(yú)水。將以上各組分別放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。利用熒光顯微鏡觀察斑馬魚(yú)ISV生成情況并采集其圖像，采用Image Pro Plus 5.0軟件測(cè)量ISV長(zhǎng)度。

1.3.4 促進(jìn)斑馬魚(yú)SIV生成的活性評(píng)價(jià)

將1.3.2節(jié)發(fā)育至72 h的斑馬魚(yú)將胚胎隨機(jī)分為4 組，即空白對(duì)照組和磷脂樣品組（3 個(gè)劑量），置于24 孔板中，每組3 個(gè)平行孔，每孔10 枚胚胎。空白對(duì)照組加2 mL養(yǎng)魚(yú)水，3 個(gè)劑量的磷脂樣品組在加入2 mL養(yǎng)魚(yú)水中的同時(shí)分別加入各磷脂樣品（終質(zhì)量濃度分別為20、40、80 μg/mL）。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，利用熒光顯微鏡觀察斑馬魚(yú)SIV生成情況并采集其圖像，采用Image Pro Plus 5.0軟件測(cè)量SIV長(zhǎng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源磷脂對(duì)斑馬魚(yú)ISV生成的影響

由圖1可見(jiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型組的斑馬魚(yú)ISV長(zhǎng)度顯著降低（＜0.000 1），表明PTK787顯著抑制了斑馬魚(yú)的血管生成，模型制備成功。各劑量的大豆、蛋黃、南美白對(duì)蝦蝦頭的磷脂提取物對(duì)ISV損傷的斑馬魚(yú)有明顯的修復(fù)作用，南美白對(duì)蝦蝦頭磷脂提取物的活性最強(qiáng)且存在濃度依賴(lài)性。與模型組相比，各劑量的卵磷脂絡(luò)合碘片以及多烯磷脂酰胺膽堿膠囊均可顯著促進(jìn)斑馬魚(yú)ISV的生長(zhǎng)，且促進(jìn)作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。但大豆磷脂軟膠囊以及魚(yú)油軟膠囊對(duì)斑馬魚(yú)ISV生成無(wú)顯著促進(jìn)作用，可能是因?yàn)檫@兩種試樣中磷脂的含量較低。

圖1 不同來(lái)源磷脂對(duì)斑馬魚(yú)ISV生成的影響Fig. 1 Effect of phospholipids from different sources on ISV formation of zebrafish

2.2 不同來(lái)源磷脂對(duì)斑馬魚(yú)SIV生成的影響

由圖2可知，與空白對(duì)照組相比，大豆、蛋黃、南美白對(duì)蝦蝦頭磷脂提取物各劑量組均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)SIV生成作用，且大豆磷脂和南美白對(duì)蝦蝦頭磷脂提取物的活性強(qiáng)于其他各磷脂樣品。所選4 種磷脂類(lèi)市售產(chǎn)品對(duì)斑馬魚(yú)SIV均有不同程度的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。多烯磷脂酰胺膽堿膠囊的促SIV生成作用存在一定的濃度依賴(lài)性，隨著質(zhì)量濃度的增加，促SIV生成作用明顯增強(qiáng)，其余3 種市售產(chǎn)品均在中質(zhì)量濃度（40 μg/mL）下促進(jìn)SIV生成作用最強(qiáng)。

圖2 不同來(lái)源磷脂對(duì)斑馬魚(yú)SIV生成的影響Fig. 2 Effect of phospholipids from different sources on SIV formation of zebrafish

2.3 不同類(lèi)型磷脂對(duì)斑馬魚(yú)ISV生成的影響

由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組的斑馬魚(yú)ISV長(zhǎng)度顯著降低（＜0.000 1），表明PTK787顯著抑制了斑馬魚(yú)的血管生成，模型制備成功。同時(shí)，PE、PC、PS以及高質(zhì)量濃度（80 μg/mL）的SM與模型組相比表現(xiàn)出明顯的促I(mǎi)SV生成作用。其中PE、PC的促血管生成活性表現(xiàn)出相反的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著PE質(zhì)量濃度增加，ISV生成促進(jìn)作用逐漸減弱，相反，PC在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著給藥質(zhì)量濃度的增加，ISV生成促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)。PS在各實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度下，ISV生成促進(jìn)作用相差不大。而PI在本研究的給藥質(zhì)量濃度下對(duì)ISV生成沒(méi)有促進(jìn)作用。

圖3 不同類(lèi)型磷脂對(duì)斑馬魚(yú)ISV生成的影響Fig. 3 Effects of different types of phospholipids on the formation of ISV in zebrafish

2.4 不同類(lèi)型磷脂對(duì)斑馬魚(yú)SIV生成的影響

由圖4可知，與空白對(duì)照組相比，5 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品均表現(xiàn)出不同程度的血管生成促進(jìn)作用。其中PS、SM存在一定濃度依賴(lài)性，隨著PS、SM標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度增大，對(duì)SIV生成的促進(jìn)作用增強(qiáng)。與其他標(biāo)準(zhǔn)品相比，PI的SIV生成促進(jìn)作用較為明顯，這與2.3節(jié)中PI對(duì)ISV生成活性的影響結(jié)果有所不同。而對(duì)于PE，僅在高質(zhì)量濃度（80 μg/mL）時(shí)表現(xiàn)出對(duì)SIV生成的促進(jìn)作用。

圖4 不同類(lèi)型磷脂對(duì)斑馬魚(yú)SIV生成的影響Fig. 4 Effects of different types of phospholipids on the formation of SIV in zebrafish

3 討 論

近幾年，斑馬魚(yú)在癲癇、肝損傷、腎損傷、糖尿病等臨床疾病中成功建立模型并被越來(lái)越多的學(xué)者應(yīng)用，成為繼小鼠后的第二優(yōu)勢(shì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。磷脂在臨床疾病治療、食品加工、化工等方面應(yīng)用廣泛，但相對(duì)于市場(chǎng)上主要的大豆磷脂和蛋黃磷脂產(chǎn)品，海產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源磷脂的應(yīng)用研究還較少。本研究采用斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物，對(duì)來(lái)源于大豆、蛋黃和南美白對(duì)蝦蝦頭的磷脂以及市售磷脂產(chǎn)品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)的促血管生成活性評(píng)價(jià)和比較。

前期本團(tuán)隊(duì)采用UPLC-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜方法對(duì)大豆、蛋黃和南美白對(duì)蝦蝦頭3 種原料進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)研究，并基于斑馬魚(yú)模型評(píng)估3 種原料脂質(zhì)的抗炎、抗氧化和抗血栓等活性；研究表明，蝦頭脂質(zhì)結(jié)構(gòu)種類(lèi)最多，高達(dá)1 764 種，且主要脂質(zhì)類(lèi)型是磷脂，大豆和蛋黃中主要脂質(zhì)是甘油脂。3 種原料來(lái)源的脂質(zhì)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性，蝦頭和大豆脂質(zhì)組有明顯的抗血栓活性。本實(shí)驗(yàn)分別采用有機(jī)溶劑提取方法從上述3 種原料中制備磷脂提取物，經(jīng)鉬藍(lán)比色法測(cè)定磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)蛋黃和蝦頭提取物中的磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于大豆；基于斑馬魚(yú)模型進(jìn)行促血管生成活性研究發(fā)現(xiàn)3 種提取物在一定質(zhì)量濃度條件下對(duì)斑馬魚(yú)ISV和SIV均具有較明顯的促血管生成活性，相對(duì)而言，南美白對(duì)蝦蝦頭磷脂促進(jìn)ISV生成的活性更強(qiáng)，這與前期研究中蝦頭磷脂在抗氧化、抗炎和抗血栓活性方面的表現(xiàn)相似，可能是與海洋磷脂中含有豐富的多不飽和脂肪酸側(cè)鏈有關(guān)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還探討了不同質(zhì)量濃度下4 種磷脂類(lèi)產(chǎn)品對(duì)斑馬魚(yú)的促血管生成活性，發(fā)現(xiàn)在一定質(zhì)量濃度條件下4 種磷脂類(lèi)產(chǎn)品均具有促進(jìn)SIV血管生成的活性，而在促I(mǎi)SV生成活性方面，僅有卵磷脂絡(luò)合碘片和多烯磷脂酰胺膽堿膠囊具有顯著的活性，這可能是另外兩種磷脂類(lèi)保健產(chǎn)品大豆磷脂軟膠囊和魚(yú)油軟膠囊中磷脂含量較低，因此，有必要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高純度的磷脂類(lèi)產(chǎn)品以確保其更好的功效。對(duì)于5 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，均在不同程度上表現(xiàn)出一定的血管生成促進(jìn)作用。以ISV生成情況作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，PE、PC、PS以及高質(zhì)量濃度（80 μg/mL）的SM表現(xiàn)出明顯的促血管生成作用，以SIV血管生成情況作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在一定質(zhì)量濃度條件下所有磷脂標(biāo)準(zhǔn)品均表現(xiàn)出較明顯的血管生成促進(jìn)作用，表明對(duì)海洋來(lái)源磷脂進(jìn)一步分離純化以獲得磷脂亞類(lèi)，可能是對(duì)海洋磷脂資源精細(xì)化開(kāi)發(fā)利用的一個(gè)方向。

由前期脂質(zhì)組學(xué)分析以及本次活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，南美白對(duì)蝦蝦頭中的磷脂含量最高，且促進(jìn)血管生成活性最強(qiáng)。由此可見(jiàn)蝦頭磷脂在開(kāi)發(fā)新型促血管生成藥物方面具有巨大潛力。大豆、蛋黃等脂肪酸側(cè)鏈組成相對(duì)簡(jiǎn)單，且不飽和程度較低，而海產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源的磷脂因側(cè)鏈中富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等豐富的-3多不飽和脂肪酸，在生理功能和生物活性方面具有特有的優(yōu)勢(shì)，但其產(chǎn)品化還很少，目前國(guó)際市場(chǎng)上能見(jiàn)到的主要是南極磷蝦油類(lèi)的保健產(chǎn)品，因此對(duì)于海產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源的磷脂開(kāi)發(fā)利用前景廣闊，也已引起很多研究者的關(guān)注。另外，以海產(chǎn)品加工副產(chǎn)物為原料開(kāi)發(fā)和利用海洋磷脂不僅可以為人類(lèi)提供更加優(yōu)質(zhì)的磷脂產(chǎn)品，還可以減少海洋資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染，增加海洋產(chǎn)品的附加值。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的磷脂提取物、市售產(chǎn)品以及磷脂標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)斑馬魚(yú)均具有一定的促血管生成活性，其中，南美白對(duì)蝦蝦頭磷脂的活性強(qiáng)于另外兩種陸地來(lái)源（大豆、蛋黃）的磷脂，推測(cè)是由于海洋磷脂因分子結(jié)構(gòu)的特殊性使其生物活性具有一定的優(yōu)勢(shì)。本研究可為利用不同來(lái)源和種類(lèi)磷脂開(kāi)發(fā)促血管生成藥物、保健品等提供借鑒，為缺血性疾病藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。