李華韜，張巧智，倪皓潔，王彥波，劉福奇，傅玲琳,*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與資產(chǎn)管理處，浙江 杭州 310018）

熱加工是食品工業(yè)中最為常見的處理手段，以此改善食品的風(fēng)味、質(zhì)地并保障產(chǎn)品安全性。在熱加工過程中會(huì)發(fā)生一系列物理、化學(xué)和生物學(xué)變化。其中，美拉德反應(yīng)（非酶糖基化反應(yīng)）是一類發(fā)生在還原糖羰基與蛋白質(zhì)（多肽/氨基酸）自由氨基間的聚合、縮合反應(yīng)，常見于各類食品的熱加工和貯藏過程中。美拉德反應(yīng)進(jìn)入中期階段后，還原糖與游離氨基經(jīng)過縮合、重排、裂解及氧化修飾等一系列復(fù)雜反應(yīng)最終生成一類穩(wěn)定的共價(jià)化合物，統(tǒng)稱為晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。研究發(fā)現(xiàn)，食源性AGEs攝入后可在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致體內(nèi)AGEs水平的升高，進(jìn)而危害人體健康。臨床證據(jù)表明，高AGEs食物的攝入與糖尿病、慢性腎病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

食物是人體攝入AGEs的主要來源，因此開展食源性AGEs的檢測分析十分必要。目前，已針對各類AGEs開發(fā)出不同的檢測方法，但隨著對AGEs研究的不斷深入，以及食品成分、加工手段和貯存方式的不斷變化，有必要系統(tǒng)梳理各類AGEs檢測手段的特點(diǎn)和應(yīng)用情況，以便有針對性地開展分析和機(jī)理研究。鑒于此，本文結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀對食源性AGEs的產(chǎn)生與危害、結(jié)構(gòu)與類型以及AGEs的檢測分析技術(shù)進(jìn)行綜述，在此基礎(chǔ)上，深入探討不同檢測技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)劣勢，以期為后續(xù)食源性AGEs的檢測技術(shù)發(fā)展和研究體系的形成提供參考依據(jù)。

1 AGEs的產(chǎn)生與危害

美拉德反應(yīng)是一種非酶糖基化反應(yīng)，主要發(fā)生在還原糖和帶有游離氨基的分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和核酸之間。美拉德反應(yīng)作為食品加工過程中最常見的化學(xué)反應(yīng)之一，廣泛發(fā)生于各類食品的加工和貯藏過程中。通常，美拉德反應(yīng)可分為3 個(gè)階段：初期階段、中期階段和晚期階段。在初期階段，氨基與羰基通過縮合形成Schiff堿，進(jìn)一步重排產(chǎn)生Amadori產(chǎn)物。在中期階段，Amadori重排產(chǎn)物通過斷裂、環(huán)化、Strecker降解等一系列反應(yīng)生成醛、酮、二羰基和雜環(huán)類化合物。在晚期階段，這些化合物進(jìn)一步發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，包括縮合、脫氫、重排和異構(gòu)化，最終轉(zhuǎn)化為類黑素。在美拉德反應(yīng)進(jìn)入中期階段后，會(huì)形成一系列可與蛋白質(zhì)/多肽/氨基酸共價(jià)結(jié)合的異質(zhì)性穩(wěn)定化合物，統(tǒng)稱為AGEs。

AGEs根據(jù)來源可分為外源性AGEs和內(nèi)源性AGEs，其中食物是外源性AGEs的主要來源，也稱作膳食AGEs，內(nèi)源性AGEs是指在人體器官、組織和體液中發(fā)生糖基化反應(yīng)形成的AGEs。膳食AGEs的攝入是機(jī)體內(nèi)AGEs的主要來源，在現(xiàn)代飲食模式下，高溫烹飪和過度食品加工使得食物中常伴有大量AGEs的形成，尤其是加工肉制品、精細(xì)加工谷物和高熱量食物（如甜食、煎炸食品、快餐等）。大量研究表明，食品中的AGEs攝入并在體內(nèi)蓄積后會(huì)對人體健康產(chǎn)生危害，這與衰老和多種慢性非傳染性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如糖尿病、慢性腎病、心腦血管疾病、視網(wǎng)膜病變等。一般認(rèn)為，AGEs進(jìn)入體內(nèi)后可以通過兩種方式產(chǎn)生負(fù)面影響：一種是直接與體內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和正常生理功能；另一種是通過與多種細(xì)胞表面的AGEs特定受體（如AGEs受體（receptor for AGE，RAGE））結(jié)合，介導(dǎo)下游細(xì)胞信號通路，間接影響細(xì)胞的代謝和功能活性。常見的AGEs受體包括可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的RAGE、負(fù)責(zé)清除AGEs的AGE-R1和清道夫受體等。AGEs與受體結(jié)合后，可激活多條下游信號通路，影響一系列細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和黏附分子的轉(zhuǎn)錄合成，進(jìn)而影響細(xì)胞趨化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖和程序性死亡等多種生理、病理學(xué)進(jìn)程。在正常生理?xiàng)l件下，人體抗糖化防御機(jī)制會(huì)通過乙二醛酶等酶的作用和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的快速更新降解AGEs，減輕其造成的化學(xué)損傷。然而，在病理?xiàng)l件下這些防御機(jī)制會(huì)失效，AGEs開始累積并造成一系列不良后果，最終導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。Cai Weijing等分別用高水平和低水平AGEs飼料喂養(yǎng)小鼠，在第3代小鼠中發(fā)現(xiàn)，高水平AGEs飼料使小鼠體內(nèi)AGE-R1水平顯著降低，體質(zhì)量增加并出現(xiàn)胰島素抵抗，最終誘發(fā)糖尿病。Ying Lingwen等對1 471 名2型糖尿病患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變與患者體內(nèi)AGEs水平密切相關(guān)，AGEs可作為監(jiān)測糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的重要指標(biāo)。除糖尿病患者，在對卵巢功能障礙等代謝性疾病患者的研究中也得到類似的結(jié)果，即高AGEs飲食與患者體內(nèi)高水平的雄激素、抗繆勒管激素等具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。此外，氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的糖基化可增加血管壁膠原蛋白交聯(lián)程度，這可能是AGEs與心血管疾病及其并發(fā)癥密切相關(guān)的原因，如Fishman等發(fā)現(xiàn)AGEs在激活受體后會(huì)通過介導(dǎo)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)并加重炎癥、氧化應(yīng)激、增加鈣沉積和血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。此外，臨床證據(jù)還表明AGEs水平是阿爾茨海默癥和帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵影響因素，大腦中過量的AGEs蓄積會(huì)誘導(dǎo)Tau蛋白磷酸化，加重氧化應(yīng)激，造成腦細(xì)胞氧化損傷。綜上可知，體內(nèi)AGEs的過量積累可誘發(fā)多種慢性疾病，但關(guān)于AGEs在體內(nèi)的生物利用度、代謝以及與生物大分子相互作用的機(jī)制尚未闡明，有待進(jìn)一步研究。

2 AGEs的結(jié)構(gòu)和類型

AGEs結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，目前已被鑒定和表征的AGEs超過40 種，其中在食品中發(fā)現(xiàn)的約有15 種。從反應(yīng)進(jìn)程上看，AGEs是由還原糖自氧化和初期美拉德產(chǎn)物裂解形成的活性羰基中間體與蛋白質(zhì)（多肽/氨基酸）自由氨基反應(yīng)形成。常見的羰基中間體有4 種：乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methyglyoxal，MGO）、3-脫氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）和丁二酮。不同的羰基化合物與不同的氨基反應(yīng)會(huì)生成不同物質(zhì)，最終形成復(fù)雜的AGEs產(chǎn)物（圖1）。根據(jù)AGEs連接基團(tuán)是游離氨基酸還是蛋白質(zhì)/多肽，可將其分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)AGEs；根據(jù)所交聯(lián)氨基酸（殘基）種類可將其分為賴氨酸衍生AGEs、精氨酸衍生AGEs以及賴氨酸和精氨酸共同衍生的AGEs；而根據(jù)所交聯(lián)氨基酸個(gè)數(shù)又可將其分為非交聯(lián)型AGEs和交聯(lián)型AGEs。

在賴氨酸衍生的AGEs中，GO作為中間體形成的羧甲基賴氨酸（-(carboxyethyl)-lysine，CML）是食品中發(fā)現(xiàn)的第一種AGEs，同時(shí)也是食品中普遍存在的一種AGEs；與其他AGEs相比，CML具有更高的酸穩(wěn)定性，其含量與食品中AGEs總含量直接相關(guān)，因此可被作為衡量食品中AGEs含量的主要指標(biāo)。羧乙基賴氨酸（N-(carboxyethyl)-lysine，CEL）是CML的結(jié)構(gòu)類似物，是由MGO與賴氨酸反應(yīng)形成。此外，吡咯啉是食品中另一種主要的AGEs，屬于吡咯衍生物，其結(jié)構(gòu)含有賴氨酸的N-氨基。除賴氨酸衍生的AGEs外，精氨酸分別與MGO、GO和3-DG反應(yīng)可生成甲基乙二醛-羥基咪唑酮異構(gòu)體（methyglyoxal-derived hydroimidazolones，MG-H）1、MG-H2、MG-H3、乙二醛-氫咪唑酮（glyoxal-derived hydroimidazolone，G-H1）和3-脫氧葡萄糖醛酮-二羥基咪唑啉（3-deoxyglucosone-derived dihydroxyimidazoline，3DG-H1）；此外，兩個(gè)MGO與精氨酸反應(yīng)可衍生出精嘧啶。上述AGEs只連接一個(gè)氨基酸殘基，均為非交聯(lián)型產(chǎn)物，而交聯(lián)型AGEs可與多肽鏈內(nèi)或多肽鏈間的兩個(gè)氨基酸基團(tuán)連接。例如，MGO、GO和3-DG分別與兩個(gè)賴氨酸反應(yīng)可形成甲基乙二醛-賴氨酸二聚體（methylglyoxal-derived lysine dimer，MOLD）、乙二醛-賴氨酸二聚體（glyoxal-derived lysine dimer，GOLD）和3-脫氧葡萄糖醛酮-賴氨酸二聚體（3-deoxyglucosonederived lysine dimer，DOLD），類似反應(yīng)發(fā)生在一個(gè)賴氨酸和一個(gè)精氨酸殘基之間可形成甲基乙二醛賴氨酸-精氨酸二聚體（imidazolium cross-link derived from methylglyoxal and lysine-arginine，MODIC）、乙二醛賴氨酸-精氨酸二聚體（imidazolium cross-link derived from glyoxal and lysine-arginine，GODIC）和3-脫氧葡萄糖酮賴氨酸-精氨酸二聚體（imidazolium cross-link derived from 3-deoxyglucosone and lysine-arginine，DODIC）。同樣地，戊糖素由戊糖與蛋白質(zhì)的賴氨酸和精氨酸殘基共同反應(yīng)產(chǎn)生，其本身具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)，因而具有自發(fā)熒光。值得注意的是，目前兩個(gè)精氨酸殘基之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)還未被發(fā)現(xiàn)，有待進(jìn)一步研究。由此可見，AGEs種類復(fù)雜繁多，各類AGEs由于側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的不同而具有不同的紫外和熒光光學(xué)特性。Poulsen等對各類食品中的AGEs進(jìn)行系統(tǒng)性綜述。圖2所示為常見的15 種食源性AGEs結(jié)構(gòu)，表1匯總了各類食源性AGEs的光學(xué)特性。

圖1 不同活性羰基中間體與各典型AGEs的形成關(guān)系Fig. 1 Relationship between different dicarbonyl compounds and down-stream formation of typical AGEs

圖2 常見15 種食源性AGEs的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Structures of 15 common dietary AGEs

表1 常見15 種食源性AGEs的光學(xué)特性Table 1 Dietary AGEs and their optical properties

3 食源性AGEs的檢測分析技術(shù)

針對食源性AGEs開展檢測分析和危害控制等方面的研究十分必要。食品基質(zhì)復(fù)雜，不同原料成分如蛋白質(zhì)或糖類等可能通過多種途徑產(chǎn)生AGEs。目前已知的AGEs化合物種類繁多，其結(jié)構(gòu)和存在形式各異，因此需要有針對性地建立合適的分析技術(shù)檢測食品中的不同AGEs。

3.1 樣品預(yù)處理方法

為準(zhǔn)確定量食品中的AGEs，檢測前需先對樣品中的AGEs進(jìn)行分離和純化。AGEs通常以游離態(tài)或與蛋白質(zhì)/多肽交聯(lián)的結(jié)合態(tài)形式存在。對于游離態(tài)AGEs，因其具有較強(qiáng)的極性和優(yōu)異的水溶性，一般用水或極性溶劑提取即可。如有需要，還需先分離除去樣品中的脂肪，沉淀蛋白質(zhì)，取上清液進(jìn)行固相萃取除雜后進(jìn)行檢測。Nomi等在檢測醬油和啤酒中的游離AGEs時(shí)，使用磺基水楊酸水溶液作為提取溶劑，將樣品離心沉淀后除去蛋白質(zhì)，取上清液通過C固相萃取柱純化后進(jìn)行色譜定量分析。Scheijen等分別使用三氟乙酸和氯仿-甲醇（2∶1，/）進(jìn)行脫脂，通過比較在牛乳、白面包和番茄醬基質(zhì)中的回收率，發(fā)現(xiàn)采用后者的脫脂效果更佳。除此之外，正己烷、丙酮和三氯乙酸等也可用作預(yù)處理中脂肪的萃取溶劑。

為全面準(zhǔn)確定量AGEs，不僅需要檢測游離態(tài)AGEs，還需提取結(jié)合態(tài)AGEs，因此需要將蛋白質(zhì)徹底水解成短鏈肽或游離氨基酸，以釋放其中的結(jié)合態(tài)AGEs。常用的水解方法有酸水解法和酶解法兩種。酸水解法一般使用鹽酸，在酸水解前，需向樣品中加入還原劑硼氫化鈉（NaBH）以防止水解過程中早期美拉德反應(yīng)產(chǎn)物果糖賴氨酸氧化生成CML造成結(jié)果誤判，然后用6 mol/L HCl溶液在110 ℃下水解20～24 h。該方法適用于對酸穩(wěn)定的AGEs（如CML、CEL），但不適用于酸性條件下不穩(wěn)定的AGEs（如吡咯啉）。酶解法常用的酶有胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶E、脯氨酸肽酶和氨基肽酶等，實(shí)際操作時(shí)往往會(huì)將特異性不同的蛋白酶組合以保證蛋白質(zhì)徹底水解。Zhu Rugang等采用胃蛋白酶等多種蛋白酶水解嬰兒配方乳粉，分析并測定AGEs（游離態(tài)和結(jié)合態(tài)）總含量。Jost等在檢測面包中AGEs時(shí)將每個(gè)樣品同時(shí)經(jīng)酸水解和酶水解處理，比較后發(fā)現(xiàn)，對于酸穩(wěn)定的AGEs，酸水解法的效率高于酶解法。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種常見的免疫分析方法，其原理是基于抗原-抗體特異性結(jié)合和酶促底物反應(yīng)產(chǎn)生的吸光度變化定量樣品中的目標(biāo)物。以競爭ELISA法檢測AGEs時(shí)，首先將抗原包被在微孔板上，加入食物樣品和酶標(biāo)抗體，待抗原-抗體反應(yīng)發(fā)生后，添加酶反應(yīng)底物，底物被酶催化發(fā)生顏色變化，利用酶標(biāo)儀檢測吸光度，通過AGEs含量與吸光度關(guān)系得到定量結(jié)果。由于酶催化效率很高，免疫反應(yīng)結(jié)果被間接放大，因此ELISA具有很好的靈敏度和特異性。1999年Tauer等首次報(bào)道了一種無需對樣品凈化處理即可直接檢測加熱乳制品中CML含量的競爭ELISA法，但該方法使用的抗體特異性表位表征不充分，容易造成假陽性結(jié)果，且無法檢測不溶性組分中的CML。對此方法進(jìn)行改進(jìn)后，Goldberg等將食品樣品均質(zhì)化并溶解在磷酸鹽緩沖液中，使用充分表征的抗CML單克隆抗體，通過競爭ELISA法測定250 種常見食品中的CML含量，初步構(gòu)建了膳食AGEs數(shù)據(jù)庫。在此基礎(chǔ)上，Uribarri等將食品種類增加到549 種，同時(shí)使用抗CML和抗MGO單克隆抗體，進(jìn)一步豐富了膳食AGEs數(shù)據(jù)庫，證明了食品原料中宏量營養(yǎng)素的組成和加工方式是影響AGEs形成的關(guān)鍵因素。值得指出的是，ELISA法容易受到樣品預(yù)處理方法、食品基質(zhì)以及抗體與非靶向表位交叉反應(yīng)的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果發(fā)生偏差。例如，Tareke等發(fā)現(xiàn)酸水解預(yù)處理會(huì)使ELISA法檢測燕麥粥樣品中的CML含量偏低。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，因抗體在親脂性基質(zhì)中的溶解性較低，富含脂肪的食品基質(zhì)會(huì)導(dǎo)致AGEs含量測定結(jié)果偏高，富含淀粉的基質(zhì)則會(huì)導(dǎo)致AGEs含量測定結(jié)果偏低。

3.3 儀器分析法

3.3.1 熒光光譜

各類AGEs由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同而具有不同的光學(xué)特性。一般含有氧雜萘鄰?fù)?、喹喔啉酮和苯并噁嗪酮結(jié)構(gòu)的AGEs具有熒光特性（如精嘧啶、戊糖素等（表1）），因此可以通過熒光光譜法檢測這類AGEs的含量。房紅娟等利用熒光光譜法檢測當(dāng)?shù)?9 種日常消費(fèi)食品中的AGEs含量，采用激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm，結(jié)果表明高蛋白和高脂肪食品（如肉類、餅干、巧克力等）相較于高水分和高碳水化合物食品（如蘋果、可樂、方便面等）的熒光AGEs含量更高。Chhabra等使用熒光光譜法，在激發(fā)波長355 nm、發(fā)射波長440 nm下檢測食用油中的熒光AGEs含量。AGEs熒光光譜的激發(fā)波長一般在300～420 mm，發(fā)射波長在350～600 mm。Wu Runlin等將儀器參數(shù)設(shè)置為激發(fā)波長345 nm、發(fā)射波長350～550 nm，對油炸魚塊中的熒光AGEs進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨油炸時(shí)間延長魚塊表面形成的AGEs含量增加，表明加工條件對AGEs含量影響顯著。熒光光譜法操作簡單但缺乏特異性，使用熒光強(qiáng)度間接反映AGEs含量，檢測結(jié)果容易受到其他熒光物質(zhì)的干擾。

3.3.2 高效液相色譜

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是一種高靈敏度的色譜檢測技術(shù)，所用檢測器有二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）、熒光檢測器（fluorescence detection，F(xiàn)LD）等。Poojary等將牛乳樣品經(jīng)酶水解處理后，采用HPLC-DAD檢測其中吡咯啉含量。然而此方法僅適用于具有紫外光吸收特性的AGEs（如吡咯啉、GOLD、MOLD等）。對于具有熒光特性的AGEs，可使用HPLCFLD進(jìn)行檢測。但對于非熒光AGEs（如CML），則需先通過衍生化得到具有熒光特性的AGEs衍生物，然后在反相柱中分離，最后使用FLD分析相應(yīng)AGEs衍生物。Chen Gengjun等以鄰苯二甲醛為衍生劑，分別與雞、豬、牛和魚肉的水解產(chǎn)物混合反應(yīng)5 min，然后采用HPLC-FLD進(jìn)行檢測，根據(jù)衍生物峰面積確定不同樣品中的CML含量。樣品在酸水解和衍生化等復(fù)雜預(yù)處理后容易引入雜質(zhì)造成干擾，為考察方法的準(zhǔn)確度，Kul等利用HPLC-FLD檢測熟肉制品中的CML含量，通過添加CML標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)物驗(yàn)證該方法的回收率為95.92%～105.16%，具有良好的準(zhǔn)確度?？傮w上，HPLC檢測方法穩(wěn)定、可靠，但由于許多常見的AGEs不具有紫外或熒光光學(xué)特性，需要衍生化處理，因此其應(yīng)用范圍受到限制。

3.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

由于樣品在氣相中流動(dòng)速率較快，樣品組分經(jīng)過色譜柱后可被迅速分離，因此氣相色譜（gas chromatography，GC）分析效率較高。經(jīng)GC分離后的氣體化合物聯(lián)合質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）鑒定可對目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。GC-MS已被用于測定不同食品中CML含量，如油炸魚餅、烤蕎麥等。衍生化是GC-MS分析前的關(guān)鍵步驟，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性影響顯著，Prestel等在檢測牛乳中CML含量時(shí)，對衍生化試劑、溶劑、溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇乙腈為溶劑，將樣品在80 ℃下甲硅烷基化45 min，然后采用GC-MS進(jìn)行分析，得到最佳衍生物峰，計(jì)算結(jié)果具有更高準(zhǔn)確度。GC-MS具有高效率、高分辨和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，但是在分析前需通過三氟甲基酯等試劑對AGEs進(jìn)行衍生化，預(yù)處理過程復(fù)雜且回收率低，因此GC-MS不適用于大批量食品中AGEs的檢測分析。

3.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

近年來，越來越多的研究人員將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）應(yīng)用于食源性AGEs的檢測。LC-MS/MS將LC對復(fù)雜樣品組分的高分離能力與MS/MS的高靈敏度、高選擇性和高準(zhǔn)確度相結(jié)合，可高效準(zhǔn)確地檢測食品中的AGEs。常見的MS技術(shù)包括離子阱質(zhì)譜（ion trap mass spectrometer，ITMS）、三重四極桿質(zhì)譜（triple quadrupole mass spectrometer，QqQ-MS）和四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）等。ITMS和QqQ-MS結(jié)構(gòu)不同但原理類似，均通過選擇母離子和子離子將特異性子離子的強(qiáng)度信號轉(zhuǎn)化為色譜峰面積進(jìn)行定量；而Q-TOF-MS則根據(jù)不同質(zhì)荷比離子穿過飛行管的速率不同達(dá)到分離效果，將飛行時(shí)間轉(zhuǎn)化為信號強(qiáng)度進(jìn)行定量。在定量分析物時(shí)，MS/MS常采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，即在樣品離子化后選擇特異性母離子，通過碰撞將其分裂成子離子，然后僅選擇特異性子離子采集MS信號，最后通過統(tǒng)計(jì)分析獲得定量結(jié)果。Gomez-Ojeda等采用不同烹飪方式處理馬鈴薯、肉類和魚類，采用傳統(tǒng)ELISA法無法檢測出其中CML含量的變化，但是利用LC-ITMS/MS可以測出樣品CML含量的微小差異，表明方法靈敏度較高，但該方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%～16.40%，精密度有待提高，這是由于ITMS存在空間電荷效應(yīng)，樣品中雜質(zhì)越多效應(yīng)越強(qiáng)，因此對于復(fù)雜食品基質(zhì)，QqQ-MS是更優(yōu)的選擇?；诖?，Yu Jingjing等使用HPLC-QqQ-MS/MS建立煙草產(chǎn)品中CML和CEL的定量分析方法，該方法的檢出限分別為0.36 ng/mL和0.25 ng/mL，日內(nèi)和日間精密度分別低于6.3%和9.7%，加標(biāo)回收率為88.7%～120.0%。

上述研究工作的色譜分離均采用C色譜柱。由于AGEs為高極性化合物，在C色譜柱中的保留效果和分離度均不理想，通常需要添加離子對試劑（如全氟戊酸）提高其保留性，但離子對試劑對色譜柱和儀器會(huì)造成一定損害。鑒于此，楊明等建立煎炸植物油中CML和CEL含量的HPLC-MS/MS檢測方法，比較C、HILIC和氨基酸3 種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)氨基酸色譜柱不僅對AGEs有較好的保留效果，而且實(shí)現(xiàn)了有效分離。此外，該方法還優(yōu)化了流動(dòng)相體系、MS條件等，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。HPLC-MS/MS雖然準(zhǔn)確可靠，但在面對日常食品的大批量檢測時(shí)，需要更加快捷高效的檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)大批量樣品中AGEs的高效定量分析，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)受到研究者們的關(guān)注。相較HPLC，UPLC系統(tǒng)可承受103～124 MPa高壓，可在更寬的液體流量范圍內(nèi)工作，在很大程度縮短分析周期的同時(shí)確保有良好的分離效果，是一種靈敏度和效率更高的檢測技術(shù)。Hull等根據(jù)西方飲食模式選擇了257 種食物，采用UPLC-MS/MS法檢測各類食品中的CML含量，并結(jié)合膳食調(diào)查評估人均CML攝入水平，為消費(fèi)者減少膳食CML的攝入提供了重要參考。在此基礎(chǔ)上，Scheijen等對方法學(xué)進(jìn)行調(diào)整，實(shí)現(xiàn)了一次性分析食品中CML、CEL和MG-H1這3 種主要AGEs的含量，然后對190 種食品中3 種AGEs進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步豐富了膳食AGEs數(shù)據(jù)庫，為設(shè)計(jì)低AGEs和高AGEs飲食干預(yù)研究奠定了基礎(chǔ)。上述研究結(jié)果表明UPLC-MS/MS可用于谷物、肉類、蔬菜和乳制品等10余種加工食品類別，具有廣泛且良好的適用性。除此之外，該方法也可用于研究烹飪方式對食品中AGEs的影響。朱玉潔采用UPLC-MS/MS方法并優(yōu)化樣品預(yù)處理?xiàng)l件（加入還原劑并用固相萃取柱除雜），發(fā)現(xiàn)煎炸食品中CML和CEL的生成量與煎炸溫度和時(shí)間存在顯著相關(guān)性。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，越來越多的新型加工方式相繼出現(xiàn)，針對不同烹飪方式影響膳食AGEs形成還有待深入研究。

與其他色譜方法相比，UPLC-MS/MS檢測食品中AGEs的優(yōu)勢突出，但仍存在不足，在檢測一些復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)會(huì)受到基質(zhì)效應(yīng)的干擾導(dǎo)致誤差。因此，基于同位素稀釋法的UPLC-MS/MS成為目前檢測食品中AGEs的最佳方法。通過在樣品中定量添加穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，使其與樣品充分混合，通過MS法測定同位素豐度比，再依據(jù)同位素稀釋原理定量待測物質(zhì)含量。該技術(shù)可有效避免樣品基質(zhì)中其他因素的干擾，具有絕對定量性質(zhì)，且靈敏度、分析精度高（圖3）。Poojary等建立一種基于同位素稀釋法的UPLC-MS/MS方法，用于同時(shí)定量加工食品和生物樣品中的各類AGEs化合物。該方法采用反相C色譜柱分離，添加9 種穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，使用Orbitrap對15 種AGEs及其他美拉德反應(yīng)產(chǎn)物共20 種分析物進(jìn)行定量，并在超高溫瞬時(shí)滅菌乳、烤雞胸肉、烤雞皮和牛血漿等6 種基質(zhì)中驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，該方法具有良好的線性、準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性，為全面分析食品和生物基質(zhì)中多種AGEs提供了重要手段。此外，該團(tuán)隊(duì)通過此方法探究綠茶提取物對牛乳貯藏過程中14 種AGEs含量的影響，揭示了多酚對AGEs衍生過程的影響，這為利用天然化合物抑制食品中美拉德反應(yīng)和AGEs形成的機(jī)制研究提供了新思路。Cheng Weiwei等建立了基于穩(wěn)定同位素稀釋的UPLCQqQ-MS/MS方法，用于同時(shí)檢測烘焙和油炸食品中CML、CEL和丙烯酰胺的含量，通過計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)參數(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和適用性。該研究創(chuàng)新性地將AGEs與丙烯酰胺進(jìn)行同步測定，有助于更準(zhǔn)確地評估食品安全性。此外，利用該方法高靈敏度等特點(diǎn)，徐正華等對來自不同國家三文魚中的AGEs含量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CEL含量可作為挪威三文魚的產(chǎn)地特征因子用于區(qū)別智利和法羅群島三文魚，其檢出限為0.032 7 ng/g，該研究成果為食品產(chǎn)地信息溯源以及真?zhèn)舞b別提供了新思路。

圖3 基于同位素稀釋法的LC-MS/MS原理示意圖Fig. 3 Schematic illustration of the principle of isotope dilution LC-MS/MS

表2匯總了若干儀器分析方法測定不同食品中AGEs含量的結(jié)果。

表2 儀器分析方法測定不同食品中AGEs含量的結(jié)果Table 2 Instrumental determination of AGEs in different foods

續(xù)表2

3.3.5 生物傳感器技術(shù)

近年來，基于分子印跡的生物傳感器技術(shù)作為一種低成本、簡單快速的檢測方法，已被應(yīng)用于檢測食品中特定AGEs的含量。通過分子印跡技術(shù)制備的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）對模板分子具有特異性識別能力，可以實(shí)現(xiàn)高選擇性的精確定量檢測。Liu Huilin等通過反相微乳液法以CML為模板分子制備基于半導(dǎo)體納米材料-疏水性量子點(diǎn)的新型MIP，開發(fā)基于此MIP的熒光傳感器用于測定面包、巴氏殺菌乳和嬰幼兒配方乳粉中的CML含量，通過HPLC-MS進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。結(jié)果表明，該熒光傳感器易于制備且成本較低、特異性和靈敏度高，待測樣品預(yù)處理步驟簡單，這為方便、快速、準(zhǔn)確定量食品中的AGEs提供了新技術(shù)方案。相較于其他方法，上述生物傳感器檢出限較高，不建議檢測食品中痕量AGEs。

4 食源性AGEs檢測技術(shù)應(yīng)用優(yōu)勢比較

目前可用于食源性AGEs的檢測方法很多。ELISA法靈敏度高、檢測速率快，適用于大量樣品檢測，但是需要選擇特定抗體，目前市場中商業(yè)化抗體均為針對檢測CML制備，暫無針對其他類型AGEs的特異性抗體可供使用。此外，利用ELISA定量的結(jié)果均以KU/100 g（以食品質(zhì)量計(jì)）表示，并非樣品中AGEs的絕對含量，而使用LC-MS/MS等儀器分析的結(jié)果一般表示為mg/kg（以蛋白或食品質(zhì)量計(jì)），兩種方法對結(jié)果的表達(dá)方式不同，數(shù)據(jù)間難以分析比較。同時(shí)，有研究指出ELISA檢測結(jié)果往往無法通過儀器分析方法重現(xiàn)，這可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)產(chǎn)物復(fù)雜多樣，樣品基質(zhì)中存在交叉反應(yīng)物質(zhì)，而ELISA易受到這些雜質(zhì)干擾導(dǎo)致假陽性/假陰性的出現(xiàn)。因此，對于免疫分析方法，有必要針對特異性抗體的靶向表位、交叉反應(yīng)性、基質(zhì)效應(yīng)和前處理方法等方面進(jìn)行改良和優(yōu)化，以提升這類方法在檢測食品中AGEs時(shí)的適用性和準(zhǔn)確性。

在儀器分析方法中，熒光光譜法雖然成本較低、靈敏度和選擇性好，但僅能分析具有自發(fā)熒光特性的AGEs，不能分析非熒光類AGEs。此外，熒光光譜對檢測樣品試劑要求嚴(yán)格，檢測時(shí)需注意避免被外界環(huán)境因素污染熒光影響準(zhǔn)確度，這一定程度限制了該方法的應(yīng)用。目前，色譜類技術(shù)因其出色的靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度受到研究人員青睞。HPLC-DAD或HPLC-FLD可以對具有特定紫外吸收或熒光特性的AGEs進(jìn)行定量分析；其他AGEs則需經(jīng)過衍生化，使其具備特有的光學(xué)特性才能被定量檢測。在使用GC-MS時(shí)，測試樣品同樣需要繁瑣的柱前衍生化處理，而衍生化試劑等的選擇不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致衍生化不完全、衍生物不穩(wěn)定等，影響檢測結(jié)果。

LC-MS/MS技術(shù)具有適應(yīng)性廣、分離和定性定量能力強(qiáng)等優(yōu)勢，在AGEs檢測領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注。與HPLC-MS/MS相比，UPLC-MS/MS具有更好的選擇性、靈敏度、精密度和回收率，而且分析周期大大縮短，這極大提高了分析效率。但是上述方法的樣品預(yù)處理過程均較復(fù)雜，在檢測時(shí)也易受到不同食品基質(zhì)的干擾和影響?；谕凰叵♂尫ǖ腢PLC-MS/MS法可以有效規(guī)避基質(zhì)效應(yīng)和其他樣品處理過程帶來的誤差，提高檢測準(zhǔn)確性，因此被認(rèn)為是同步準(zhǔn)確定量食品中多種AGEs的最佳手段。但是，這類大型儀器分析設(shè)備成本高、價(jià)格昂貴、耗時(shí)長，且對操作人員要求高，這在一定程度限制了其推廣應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)方便快速、低成本、高靈敏度的AGEs檢測技術(shù)。例如，基于MIP的熒光傳感器成本低且易于制備，是近年來新興的AGEs檢測方法之一，這類方法具有良好的發(fā)展前景，或?qū)⒊蔀槲磥鞟GEs檢測技術(shù)的發(fā)展方向。

不同AGEs檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表3所示。

表3 不同AGEs檢測技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 3 Comparison of different techniques for detecting AGEs

5 結(jié) 語

食品加工過程中美拉德反應(yīng)賦予了食品獨(dú)特的風(fēng)味、顏色和質(zhì)地，但這一過程往往伴隨著大量AGEs的形成。消費(fèi)者攝入過量食源性AGEs會(huì)對機(jī)體健康構(gòu)成潛在危害，因此檢測加工食品中AGEs含量對保證食品品質(zhì)和人體健康方面至關(guān)重要。隨著研究的深入，各類檢測方法的準(zhǔn)確度和靈敏度逐步得到提升，與免疫分析方法相比，儀器分析方法尤其是LC-MS聯(lián)用技術(shù)具有更好的選擇性、回收率、重復(fù)性和準(zhǔn)確性等。然而，現(xiàn)有研究大多局限于少數(shù)幾種代表性AGEs，如CML、CEL等，如何全面快速檢測食品中各類AGEs含量，探究不同食源性AGEs的形成機(jī)理和分布特征仍是該領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。此外，簡化樣品預(yù)處理方法，優(yōu)化針對不同基質(zhì)的預(yù)處理手段，提升AGEs檢測效率，也是當(dāng)前亟需解決的問題。本文針對各種檢測方法進(jìn)行討論并對優(yōu)缺點(diǎn)和發(fā)展方向進(jìn)行總結(jié)，可為進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有檢測手段或開發(fā)新的AGEs檢測技術(shù)提供參考和借鑒。