褪黑素對(duì)低溫貯藏期間薺菜衰老和抗氧化能力的影響

王潔瓊，王軍萍，朱麗娟，郁志芳

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

葉菜是我國(guó)主要的栽培和消費(fèi)蔬菜，其中薺菜作為一種藥食同源的特色葉菜深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。薺菜富含多種有機(jī)酸和氨基酸，無(wú)機(jī)物中鉀、鈣、鈉、鐵等含量較高，具有促進(jìn)子宮收縮、止血、降低血壓以及調(diào)節(jié)睡眠的功效。薺菜生產(chǎn)和銷售的季節(jié)性較強(qiáng)、常溫保鮮困難、品質(zhì)劣變快，縮短了其市場(chǎng)供應(yīng)時(shí)間。因此，采用保鮮技術(shù)來(lái)延長(zhǎng)薺菜的貯藏時(shí)間，維持采后新鮮薺菜品質(zhì)具有重要意義。

果蔬衰老劣變與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。ROS是果蔬生理代謝的必然產(chǎn)物，當(dāng)其含量積累超過(guò)果蔬的氧化防御范圍時(shí)，就會(huì)引起細(xì)胞損傷甚至死亡。植物的抗氧化系統(tǒng)是維持ROS穩(wěn)態(tài)水平的關(guān)鍵，主要分為兩類，一類是非酶抗氧化體系，主要包括抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、多酚、花青素等抗氧化物質(zhì)；一類是酶促抗氧化體系，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）等。當(dāng)果蔬中產(chǎn)生過(guò)多的ROS時(shí)，這兩套體系將會(huì)通過(guò)協(xié)同作用清除ROS，從而維持ROS產(chǎn)生和清除系統(tǒng)的平衡。

褪黑素是一種吲哚類小分子物質(zhì)，化學(xué)名稱為-乙酰基-5-甲氧基色胺。1958年Lemer等首次從牛的松果體中提取出褪黑素，1995年Dubbels等首次在對(duì)煙草的研究中發(fā)現(xiàn)了褪黑素。近年來(lái)，褪黑素作為一種安全綠色的保鮮劑成為研究熱點(diǎn)。已有文獻(xiàn)證明外源褪黑素處理具有抑制葉綠素降解和提高果蔬抗氧化能力的效果，Park等以大麥葉片作為研究對(duì)象，使用褪黑素處理延緩了黑暗誘導(dǎo)的大麥葉片黃化，與對(duì)照組相比，最后一天處理組葉綠素含量是對(duì)照組的1.9 倍；王平以‘寒富’蘋果為實(shí)驗(yàn)試材，向干旱脅迫下的蘋果植株根部定期噴施適宜濃度的褪黑素溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第60天時(shí)處理組葉綠素含量為1.9 mg/g，是對(duì)照組的3.8 倍；杜卓等以‘鄭單958’玉米種子為研究對(duì)象，采用不同濃度褪黑素處理樣品，在葉面噴淋5 d后，葉綠素相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組，提高了8.52%；Ma Qiuxiang等研究表明褪黑素處理能夠提高木薯SOD、CAT等抗氧化酶活力，減少ROS積累，延緩木薯采后衰老；賈樂(lè)等以0.5 mmol/L褪黑素處理香菇，結(jié)果顯示褪黑素可有效降低采后香菇ROS代謝產(chǎn)物生成速率，提高機(jī)體抗氧化能力；此外，褪黑素處理還可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活力以及抑制膜脂過(guò)氧化作用，有效維持桃果實(shí)的感官品質(zhì)，提升桃果實(shí)的抗冷性，從而延長(zhǎng)貯藏期。

以上研究表明，褪黑素作為一種新型保鮮劑，能夠有效抑制植物中葉綠素的降解，提升植物的抗氧化能力，具有良好的應(yīng)用前景。有關(guān)褪黑素應(yīng)于葉菜保鮮的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以薺菜為材料，探究外源褪黑素浸泡處理對(duì)貯藏期間薺菜葉綠素降解、葉綠體結(jié)構(gòu)以及抗氧化能力的影響，以明確褪黑素對(duì)采后薺菜保鮮的作用機(jī)制，為其產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘板葉’薺菜 南京市江寧蔬菜種植基地。

乙醇、氫氧化鈉、正己烷、石油醚、乙醚、硼酸、亞硝酸鉀（均為分析純） 南京化學(xué)試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、3,5-二硝基水楊酸、鹽酸羥胺、-萘胺、四氯化鈦、TritonX-100、硫酸鈦（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸（均為分析純） 廣東汕頭西隴化工廠；對(duì)氨基苯磺酸、核黃素、甲硫氨酸、谷胱甘肽還原酶、還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（均為分析純） 上海伯奧生物科技有限公司；濃硫酸、濃鹽酸（均為分析純） 上海永億化學(xué)試劑有限公司；濃氨水、乙二胺四乙酸二鈉、丙酮、甲醇、2-乙烯吡啶（均為分析純） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵（分析純） 上海泗聯(lián)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1860A紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元有限公司；Sartorius BS 224S型電子精密天平 德國(guó)賽多利斯公司；TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；CR-400 CHROMA METER色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；A11液氮研磨儀 德國(guó)艾卡有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；KQ-300DB數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Check Mate3氣體分析儀 丹麥Dansensor公司；FE20臺(tái)面式pH計(jì) 瑞士梅特勒有限公司；DDS-307電導(dǎo)儀 上?？祪x儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 褪黑素處理

‘板葉’薺菜采后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選葉片鮮綠、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷、葉片表面積相近的薺菜用于實(shí)驗(yàn)。分別設(shè)置不同濃度（5、10、100、200、500 μmol/L）褪黑素對(duì)薺菜進(jìn)行浸泡處理，每5 L溶液浸泡1 kg薺菜，浸泡時(shí)間為10 min。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)薺菜葉片色澤、葉綠素含量、呼吸、質(zhì)量損失率等指標(biāo)的測(cè)定，篩選得到100 μmol/L褪黑素處理效果最好，在該處理濃度下進(jìn)一步探究了褪黑素處理對(duì)貯藏期間薺菜品質(zhì)和抗氧化能力的影響。將實(shí)驗(yàn)材料薺菜隨機(jī)分為2 組，實(shí)驗(yàn)組（MT組）采用100 μmol/L褪黑素溶液浸泡10 min，每5 L溶液浸泡1 kg薺菜，對(duì)照組（CK組）用等體積蒸餾水浸泡10 min。浸泡結(jié)束后于20 ℃下晾至表面無(wú)水（約0.5 h），以每袋500 g分裝于黑色塑料袋，置于（2.0±0.5）℃條件下避光貯藏，分別于0、3、7、12 d和18 d隨機(jī)取5 袋樣品測(cè)定色澤、葉綠素含量、呼吸強(qiáng)度、超氧陰離子生成速率、HO含量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和相對(duì)電導(dǎo)率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行樣品。凍樣準(zhǔn)備時(shí)，取薺菜葉片，切碎并混合均勻，用液氮速凍處理后置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 質(zhì)量損失率的測(cè)定

每組樣品選取（500±10）g進(jìn)行測(cè)定并設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。分別稱量貯藏前后樣品質(zhì)量，按下式計(jì)算質(zhì)量損失率。

1.3.3 色澤的測(cè)定

采用CIELab表色系統(tǒng)測(cè)定樣品色澤（*值、）。用簽字筆進(jìn)行點(diǎn)樣標(biāo)記，標(biāo)記取樣點(diǎn)，每次對(duì)固定葉片的取樣點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

分別于0、7、18 d取樣進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察，每組樣品取10 片具有代表性的葉片，切成約1 mm×3 mm×1 mm的薄片，在2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的戊二醛溶液中4 ℃固定8 h，然后按下列步驟處理樣品：倒掉固定液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min；用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的鋨酸溶液固定樣品1～2 h；小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min；依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種溶液處理15 min，再用無(wú)水乙醇處理2 次，每次20 min。用乙醇-醋酸異戊酯混合液（體積比為1∶1）處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1 h或放置3 h。臨界點(diǎn)干燥法干燥、噴金鍍膜。處理好的樣品通過(guò)SU-8010型掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.5 葉綠素含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定薺菜中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量。單位為mg/g。

1.3.6 呼吸速率測(cè)定

將300 g薺菜樣品置于呼吸罐中密封2 h，然后使用Check Mate 3氣體分析儀測(cè)定呼吸速率。單位為mg/（kg·h）。

1.3.7 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

葉綠素最大熒光產(chǎn)量（）用于表征葉綠體光合作用反應(yīng)中心活力的高低；表示基礎(chǔ)熒光產(chǎn)量；/用來(lái)表征光系統(tǒng)PS II的光化學(xué)效率，從而反映葉綠體功能的完整性。先將薺菜暗處理30 min，然后使用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上駜x分別測(cè)定、，計(jì)算/。

1.3.8 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

采用DDS-307電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)率。稱取5 mm直徑薺菜圓片0.5 g，置于100 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水，于25 ℃靜置1 h后測(cè)定電導(dǎo)率/（μS/cm），然后進(jìn)行沸水浴5 min，將燒杯中蒸餾水補(bǔ)齊至50 mL，冷卻后測(cè)定電導(dǎo)率/（μS/cm）。根據(jù)、的比值計(jì)算出相對(duì)電導(dǎo)率/%。

1.3.9 丙二醛和過(guò)氧化氫含量及超氧陰離子生成速率的測(cè)定

MDA含量參考文獻(xiàn)[16]并略作修改。稱取2.0 g樣品，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液充分研磨，將所得勻漿離心（12 000×、20 min、4 ℃）。取上清液測(cè)定計(jì)算MDA含量，單位為nmol/g。過(guò)氧化氫含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]，單位為μmol/g。超氧陰離子生成速率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]，單位為nmol/（min·g）。

1.3.10 ROS代謝相關(guān)酶活力的測(cè)定

SOD活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]并略作修改。以每分鐘反應(yīng)體系在560 nm波長(zhǎng)處對(duì)氮藍(lán)四唑光化還原的抑制率為50%時(shí)所需酶量為1 個(gè)活力單位U，單位為U/g。POD、CAT、APX活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]。分別以每分鐘各反應(yīng)體系吸光度變化1為1 個(gè)酶活力單位（U），單位為U/g。

1.3.11 總酚和類黃酮含量的測(cè)定

總酚和類黃酮相對(duì)含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]的方法并略作修改。最終結(jié)果分別表示為OD/g和OD/g。

1.3.12 ASA-GSH循環(huán)物質(zhì)水平測(cè)定

ASA、氧化型抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）以及GSH、氧化性谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]并略作修改。ASA、DHA含量單位為mg/g，GSH、GSSG含量單位為μg/g。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroanticyclic acid reductase，DHAR）活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[6]。GR、MDAR以每分鐘反應(yīng)體系340 nm波長(zhǎng)處吸光度變化1為1 個(gè)酶活力單位（U），DHAR以每分鐘265 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U）。以上結(jié)果單位均為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 2021軟件作圖，采用SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素處理對(duì)薺菜葉片色澤、葉綠素含量的影響

色澤指數(shù)*值和分別代表薺菜葉片色澤的明亮度和色調(diào)，二者的變化可以反映薺菜貯藏期內(nèi)顏色的變化。圖1A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的均逐漸減小。第3天后處理薺菜顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)，處理和對(duì)照薺菜的分別為123.41和117.22。圖1B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的*值均呈持續(xù)上升。第3天后處理薺菜*值顯著低于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)，處理和對(duì)照薺菜的*值分別為50.35和54.71。以上結(jié)果表明褪黑素處理保持了貯藏期間薺菜的色澤，延緩了薺菜的黃化。

葉綠素的降解是引起薺菜葉片黃化的直接原因。圖1C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的葉綠素含量均逐漸降低。從貯藏3 d開(kāi)始處理薺菜葉綠素含量顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜葉綠素含量為對(duì)照的1.17 倍，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜葉綠素的降解，延緩了組織的黃化。

圖1 褪黑素處理對(duì)薺菜葉片H（A）、L*值（B）、葉綠素含量（C）的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on H (A), L* value (B) and chlorophyll content (C) in the leaves of Capsella bursa-pastoris

2.2 褪黑素處理對(duì)薺菜葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的影響

透射電子顯微鏡下薺菜葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示，新鮮薺菜葉片中葉綠體數(shù)目較多被膜結(jié)構(gòu)完整，呈梭形結(jié)構(gòu)緊貼細(xì)胞壁分布，基粒片層結(jié)構(gòu)排列緊密有序，含有少量嗜餓顆粒和淀粉粒（圖2）。從貯藏7 d開(kāi)始，褪黑素處理和對(duì)照薺菜葉片細(xì)胞中葉綠體體積開(kāi)始膨脹形狀發(fā)生卷曲，且與細(xì)胞壁之間的距離增大，基粒片層結(jié)構(gòu)的有序性降低，嗜餓顆粒和淀粉粒數(shù)目增多。貯藏18 d時(shí)，褪黑素處理薺菜葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與對(duì)照相比葉綠體膜和細(xì)胞膜仍保持較為完整的形態(tài)，基粒片層結(jié)構(gòu)仍保持較為緊密有序的排列狀態(tài)。以上結(jié)果表明，褪黑素處理維持了貯藏期間薺菜葉片細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性。

圖2 褪黑素處理對(duì)薺菜葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on chloroplast ultrastructure in the leaves of Capsella bursa-pastorise

葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映了植物對(duì)光能的吸收、傳遞和利用效率，可用來(lái)表征植物光合作用效率的高低。圖3A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的逐漸降低。第12天后處理薺菜顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜為對(duì)照的1.23 倍，表明褪黑素處理延緩了貯藏期間薺菜葉綠體PSII反應(yīng)中心活力的降低，保持了葉綠體功能的完整性。圖3B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的/持續(xù)減小。第3天后褪黑素處理薺菜/高于對(duì)照，貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜/為對(duì)照的1.37 倍，表明褪黑素處理保持了貯藏期間薺菜葉綠體功能的完整性。

圖3 褪黑素處理對(duì)薺菜Fm（A）、Fv/Fm（B）的影響Fig. 3 Effect of melatonin treatment on Fm (A) and Fv/Fm ratio (B) of Capsella bursa-pastoris

2.3 褪黑素處理對(duì)薺菜呼吸速率和質(zhì)量損失率的影響

呼吸速率的變化可反映果蔬在貯藏期間的衰老進(jìn)程。圖4A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的呼吸速率呈先上升后下降的趨勢(shì)，第7天出現(xiàn)呼吸高峰。第7天后處理薺菜呼吸速率顯著低于對(duì)照（＜0.05），18 d時(shí)褪黑素處理薺菜呼吸速率低于對(duì)照17.3%，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜的呼吸作用，減少了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗。

質(zhì)量損失率可反映貯藏期間果蔬水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。圖4B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的質(zhì)量損失率均逐漸增大。從貯藏第3天開(kāi)始處理薺菜質(zhì)量損失率顯著低于對(duì)照（＜0.05），表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜水分的流失。

圖4 褪黑素處理對(duì)薺菜呼吸速率（A）、質(zhì)量損失率（B）的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on respiration rate (A) and mass loss rate (B) of Capsella bursa-pastoris

2.4 褪黑素處理對(duì)薺菜葉片細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量以及自由基含量的影響

相對(duì)電導(dǎo)率可反映細(xì)胞膜受損傷的程度。圖5A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)上升。從貯藏第3天開(kāi)始，褪黑素處理薺菜相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照組（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜相對(duì)電導(dǎo)率較對(duì)照下降6.28%。以上結(jié)果表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜相對(duì)電導(dǎo)率的上升，減少了薺菜葉片細(xì)胞電解質(zhì)的外滲，保持了薺菜葉片細(xì)胞膜的完整性。MDA含量是反映果蔬膜脂過(guò)氧化強(qiáng)弱和衰老程度的重要指標(biāo)。圖5B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的MDA含量不斷上升。第3天后處理薺菜MDA含量顯著低于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜MDA含量比對(duì)照低27%，表明褪黑素處理減少了貯藏期間薺菜MDA的積累，抑制了薺菜細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化作用。

圖5C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的超氧陰離子產(chǎn)生速率均連續(xù)增大。從貯藏第12天開(kāi)始褪黑素處理薺菜超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著低于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜超氧陰離子產(chǎn)生速率比對(duì)照組17.3%；圖5D顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的HO含量持續(xù)增長(zhǎng)。第3天后處理薺菜HO含量顯著低于對(duì)照（＜0.05），貯藏12 d時(shí)褪黑素處理薺菜HO含量較對(duì)照減少13.94%，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間ROS的積累。

圖5 褪黑素處理對(duì)薺菜相對(duì)電導(dǎo)率（A）、MDA含量（B）、超氧陰離子產(chǎn)生速率（C）、H2O2含量（D）的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on relative conductivity (A),malondialdehyde content (B), superoxide anion radical production rate(C) and H2O2 content (D) of Capsella bursa-pastoris

2.5 褪黑素處理對(duì)薺菜SOD、CAT、POD活力的影響

SOD、CAT、POD是果蔬體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶。圖6A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的SOD活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。從貯藏7 d開(kāi)始處理薺菜SOD活力顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜SOD活力為對(duì)照的1.33 倍。圖6B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的CAT活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。從貯藏3 d開(kāi)始處理薺菜CAT活力顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏7 d時(shí)褪黑素處理薺菜CAT活力為對(duì)照的1.09 倍。圖6C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的POD活力持續(xù)增強(qiáng)。從貯藏3 d開(kāi)始處理薺菜POD活力顯著低于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜POD活力較對(duì)照下降9.76%。以上結(jié)果表明，褪黑素處理延緩了貯藏期間薺菜SOD、CAT活力的降低，抑制了貯藏期間薺菜POD活力的上升。

圖6 褪黑素處理對(duì)薺菜SOD（A）、CAT（B）、POD（C）活力的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the activities of SOD (A), CAT (B)and POD (C) in Capsella bursa-pastoris

2.6 褪黑素處理對(duì)薺菜APX、DHAR、MDAR、GR活力的影響

DHAR、GR、MDAR、APX是ASA-GSH循環(huán)中的關(guān)鍵酶，其活力對(duì)ASA、GSH的含量變化有重要影響。圖7A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的APX活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。第7天后處理薺菜APX活力顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理組APX活力為對(duì)照的1.27 倍。圖7B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的DHAR活力持續(xù)降低。貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜的DHAR活力為對(duì)照的1.22 倍。圖7C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的MDAR活力持續(xù)降低。從貯藏3 d開(kāi)始褪黑素處理薺菜MDAR活力顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜MDAR活力為對(duì)照的1.13 倍。圖7D顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的GR活力呈先上升后下降的趨勢(shì)。從貯藏7 d開(kāi)始褪黑素處理薺菜GR活力顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏12 d時(shí)褪黑素處理GR活力為對(duì)照的1.18 倍。

圖7 褪黑素處理對(duì)薺菜APX（A）、DHAR（B）、MDAR（C）、GR（D）活力的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on the activities of APX (A),DHAR (B), MDAR (C) and GR (D) in Capsella bursa-pastoris

2.7 褪黑素處理對(duì)薺菜抗氧化物質(zhì)的影響

ASA、GSH、總酚、類黃酮是果蔬體內(nèi)非酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵物質(zhì)，其含量可反映果蔬抗氧化能力。

圖8A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的ASA含量均呈先上升后下降趨勢(shì)，貯藏第7天出現(xiàn)峰值。從貯藏第12天開(kāi)始褪黑素處理薺菜ASA含量顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏12 d和18 d時(shí)褪黑素處理薺菜ASA含量分別為對(duì)照的1.06 倍和1.18 倍。圖8B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的ASA/DHA（二者含量比值）總體逐漸下降。從貯藏3 d開(kāi)始褪黑素處理薺菜ASA/DHA顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏12 d時(shí)褪黑素處理薺菜ASA/DHA為對(duì)照的1.13 倍，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜ASA的降解，提高了ASA的相對(duì)含量。圖8C顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的GSH含量持續(xù)上升。從貯藏第3天開(kāi)始褪黑素處理薺菜DHA含量顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜GSH含量為對(duì)照組的2.23 倍，表明褪黑素處理增加了貯藏期間薺菜GSH含量。圖8D顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的GSH/GSSG（二者含量比值）明顯高于貯藏第0天。從貯藏第3天開(kāi)始褪黑素處理薺菜GSH/GSSG顯著高于對(duì)照，貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜GSH/GSSG為對(duì)照的2.04 倍，表明褪黑素處理促進(jìn)了GSH的產(chǎn)生，提高了GSH的相對(duì)含量。

圖8 褪黑素處理對(duì)薺菜ASA含量（A）、ASA/DHA（B）、GSH含量（C）、GSH/GSSG的影響Fig. 8 Effect of melatonin treatment on ASA (A), ASA/dehydroascorbic acid (B), GSH (C) and GSH/oxidized glutathione (D) contents of Capsella bursa-pastoris

圖9A顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的總酚含量均持續(xù)減少。從貯藏第3天開(kāi)始褪黑素處理薺菜總酚含量顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜總酚含量為對(duì)照的1.11 倍。這一結(jié)果表明褪黑素處理抑制了貯藏期間薺菜總酚的降解，維持了薺菜的抗氧化能力。圖9B顯示，貯藏期間，褪黑素處理和對(duì)照薺菜的類黃酮含量持續(xù)減少。從貯藏第3天開(kāi)始褪黑素處理薺菜總酚含量顯著高于對(duì)照（＜0.05），貯藏18 d時(shí)褪黑素處理薺菜類黃酮含量為對(duì)照的1.06 倍，表明褪黑素處理抑制了貯藏期間類黃酮的降解，維持了貯藏期間薺菜的抗氧化能力。

圖9 褪黑素處理對(duì)薺菜總酚（A）、類黃酮（B）含量的影響Fig. 9 Effect of melatonin treatment on the contents of total phenols (A)and flavonoids (B) in Capsella bursa-pastoris

3 討 論

失水萎焉和葉片黃化是貯藏期間薺菜衰老最直觀的表現(xiàn)。薺菜采后有機(jī)養(yǎng)分持續(xù)供應(yīng)終止，為維持體內(nèi)生理生化穩(wěn)態(tài)，延緩品質(zhì)下降，需要通過(guò)呼吸作用來(lái)消耗機(jī)體內(nèi)剩余的有機(jī)養(yǎng)分。旺盛的呼吸作用會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)伴隨大量水分流失，釋放呼吸熱，造成高溫環(huán)境，加速薺菜品質(zhì)劣變。本研究結(jié)果表明，褪黑素處理能夠降低貯藏期間薺菜的呼吸速率同時(shí)抑制薺菜質(zhì)量損失率的上升。這與褪黑素能夠提高薺菜機(jī)體的抗脅迫能力，從而提升機(jī)體對(duì)水分的利用效率、減少水分的散失有關(guān)。同時(shí)在呼吸作用過(guò)程的ROS可通過(guò)破壞葉綠素分子的四吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)、催化卟啉環(huán)氧化開(kāi)環(huán)，將葉綠素由綠色漂白為白色，導(dǎo)致薺菜葉片黃化。本研究結(jié)果顯示，褪黑素處理有效抑制了貯藏期間薺菜葉綠素的降解，減輕了薺菜葉片的黃化，與褪黑素處理黃瓜和青花菜時(shí)的效果相似。這可能與褪黑素抑制了ROS對(duì)葉綠素的漂白作用有關(guān)。

植物中的ROS主要在光合作用與呼吸作用的電子傳遞鏈過(guò)程中產(chǎn)生，薺菜葉片中ROS的主要來(lái)源為葉綠體和線粒體。貯藏期間ROS作為呼吸作用的副產(chǎn)物不斷積累，ROS的過(guò)量積累會(huì)加速薺菜細(xì)胞膜脂過(guò)氧化進(jìn)程，破壞細(xì)胞膜與葉綠體膜結(jié)構(gòu)，從而促使葉綠體形狀卷曲和基粒片層結(jié)構(gòu)松散，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)完整性。褪黑素作為一種自由基清除劑，可直接對(duì)ROS進(jìn)行清除，從而減輕ROS對(duì)細(xì)胞造成的傷害。本研究結(jié)果表明，褪黑素處理能夠有效抑制貯藏期間薺菜超氧陰離子和HO的積累，降低MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率，延緩膜脂過(guò)氧化進(jìn)程，從而保護(hù)細(xì)胞膜、葉綠體膜結(jié)構(gòu)，抑制葉綠體形狀卷曲以及基粒片層結(jié)構(gòu)的松散，維持葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。這與褪黑素處理桃果實(shí)的研究結(jié)果相似。

當(dāng)果蔬內(nèi)ROS開(kāi)始積累，會(huì)激活其氧化還原防御系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括酶促抗氧化體系和非酶抗氧化體系兩種。酶促抗氧化體系主要通過(guò)調(diào)節(jié)SOD、CAT、POD、APX等抗氧化酶的活力來(lái)清除ROS。本研究結(jié)果顯示，褪黑素處理提高了SOD、CAT、APX活力，SOD可將超氧陰離子特異性地歧化為HO和超氧陰離子；CAT則通過(guò)與SOD的協(xié)同作用將HO還原為HO；APX一方面將HO還原為HO和脫氫抗壞血酸；另一方面協(xié)助CAT以及酚類物質(zhì)將HO還原成HO。此外，褪黑素處理還降低了POD活力，POD在將HO分解成HO的同時(shí)也能將多酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)可反向歧化為鄰醌自由基，間接參與ROS生成，因此降低POD活力直接降低了酚類物質(zhì)氧化的風(fēng)險(xiǎn)，間接減少了ROS的積累。褪黑素通過(guò)調(diào)節(jié)這一系列抗氧化酶的活力，有效抑制ROS的積累，提升了貯藏期內(nèi)薺菜的品質(zhì)，延緩了薺菜的衰老。

非酶抗氧化體系主要通過(guò)ASA、GSH等抗氧化物質(zhì)與ROS發(fā)生反應(yīng)而達(dá)到清除目的。ASA和GSH是植物非酶抗氧化體系的重要成員，二者與GR、MDAR、DHAR、APX共同構(gòu)成ASA-GSH循環(huán)，ASA-GSH循環(huán)對(duì)于ROS的清除具有重要作用，它一方面通過(guò)酶的催化作用直接清除植物細(xì)胞內(nèi)的HO；另一方面通過(guò)促進(jìn)ASA和GSH兩種抗氧化劑的生成來(lái)提高植物細(xì)胞的抗氧化能力，特別是在CAT不足的情況下，果蔬中產(chǎn)生的HO主要是通過(guò)ASA-GSH循環(huán)清除的。ASA和GSH作為重要的抗氧化劑，其氧化還原的狀態(tài)可以反映植物細(xì)胞環(huán)境中的氧化水平，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素處理有效延緩了ASA和GSH的降解，從而提升了薺菜的抗氧化能力。這與褪黑素處理提高了APX、DHAR、MDAR和GR的活力密切相關(guān)，APX可以將植物細(xì)胞內(nèi)的HO清除生成HO，同時(shí)會(huì)將ASA氧化成DHA；DHAR和MDAR分別以DHA和MDHA為反應(yīng)底物還原生成ASA，維持了ASA的還原狀態(tài)，同時(shí)DHAR還將GSH氧化成GSSG；GR利用NADPH提供電子，將GSSG還原為GSH，保證了GSH的高效再生。褪黑素處理通過(guò)調(diào)控ASA-GSH循環(huán)中各個(gè)關(guān)鍵酶的活力，使得該循環(huán)各環(huán)節(jié)高效運(yùn)轉(zhuǎn)，提升了貯藏期間薺菜非酶促抗氧化體系的功能，進(jìn)而提高了薺菜的抗氧化能力，推遲了薺菜的衰老進(jìn)程，有利于薺菜貯藏期的延長(zhǎng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 μmol/L褪黑素處理可以增強(qiáng)2 ℃貯藏期間薺菜抗氧化酶活力、保持較高抗氧化物質(zhì)含量、抑制ROS的積累、維持葉綠體結(jié)構(gòu)完整和功能完整性，達(dá)到抑制薺菜品質(zhì)劣變和保持薺菜抗氧化能力的作用。