謝 丹，王明麗，王秀海??，胡 泓，李正炎，趙曉明，沈佳峰

(1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.山東省青島生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山東 青島 266003)

藥品的使用在治療疾病、提高人類平均壽命的同時也可能給生態(tài)環(huán)境造成壓力。中國作為世界上最大的藥品和個人護(hù)理品(Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)生產(chǎn)國和消費(fèi)國，對PPCPs的使用非常廣泛，其代謝產(chǎn)物進(jìn)入水環(huán)境后，會給水生生物的生存帶來威脅。布洛芬(Ibuprofen，IBU)為非甾體類抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，是一種不溶于水的白色結(jié)晶性粉末，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易被降解，被廣泛應(yīng)用于鎮(zhèn)痛、解熱以及抗炎等臨床治療中。對非甾體類抗炎藥使用情況的調(diào)查結(jié)果表明，IBU在全球被普遍使用，歐洲國家布洛芬和雙氯芬酸的使用率最高[1]，亞洲國家布洛芬、雙氯芬酸、萘普生和乙酰水楊酸的使用率較高[2]，且IBU已列為中國優(yōu)先控制的藥物[3]。布洛芬被攝入人體后，經(jīng)肝、腎代謝，大部分隨尿液及廢水處理廠等的大量排放進(jìn)入自然環(huán)境，加劇了水環(huán)境的污染程度。

隨著IBU的廣泛使用，水體中IBU含量已呈上升趨勢。環(huán)境調(diào)查監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，英國、德國河流地表水IBU含量范圍為0.008～2.38 μg/L；污水處理廠進(jìn)水中IBU含量高于河流，英國和瑞士污水處理廠進(jìn)水中IBU的平均含量分別為20.7和3.12 μg/L[4-5]。在47個國家的地表水、地下水、飲用水和污水處理廠進(jìn)出水等各類水體的6 950個樣品中檢測到IBU，平均濃度為0.108 μg/L，其中西歐地區(qū)的最高檢測濃度為303 μg/L[6]。對中國長江中、下游以及流域內(nèi)四大淡水湖(洞庭、鄱陽、太和巢湖)范圍內(nèi)31個站點(diǎn)的檢測中，僅在長江下游上海地區(qū)附近的2個河口站點(diǎn)檢測到 IBU，這可能是由于上海及周邊區(qū)域的廢水排放導(dǎo)致IBU在河口區(qū)域富集，其平均和最高濃度分別為11.3和99.3 ng/L[7]。在華北黃河、海河、遼河所有地表水中(共37個站點(diǎn))均檢測到IBU，且在人口高密度地區(qū)、河流下游及匯合處檢測頻率較高，檢測濃度范圍為2.4～416 ng/L[8]。

由于IBU具有較高的生物活性，水生生物通過蓄積作用導(dǎo)致組織濃度增加，進(jìn)而產(chǎn)生急、慢性毒性效應(yīng)[9-10]。美國環(huán)保署也認(rèn)為這類藥物可能對生物繁殖存在風(fēng)險(xiǎn)，尤其對生物生命早期階段更加敏感[11]。已有多項(xiàng)研究表明IBU對水生生物具有急性毒性效應(yīng)，且其難降解的特性可能會對水生生物產(chǎn)生潛在的慢性毒性效應(yīng)，特別是對富有經(jīng)濟(jì)價值的物種。調(diào)查顯示，IBU會對魚類等高營養(yǎng)級生物產(chǎn)生慢性毒性作用，具有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，且水生生物對藥物中化合物的敏感性順序?yàn)樵孱?> 水蚤 > 魚類[12]。

對布洛芬毒性效應(yīng)的研究在國外最先開始，其中淡水物種占多數(shù)。生態(tài)毒理學(xué)研究表明，魚類長期暴露在低濃度的IBU中，代謝酶等受到影響，從而引起腎臟毒性、免疫抑制作用等[13]。IBU還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[14]，會對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響，導(dǎo)致神經(jīng)損傷，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。此外IBU還可抑制小球藻(Chlorellavulgaris)生長[16]。商品化的IBU[17]和雙氯芬酸[18]藥物均可在鯉魚(Cyprinuscarpio)的肝臟、皮膚和鰓等組織中富集，誘導(dǎo)其氧化應(yīng)激[19]。IBU對斑馬魚(Daniorevio)不同組織的慢性毒性效應(yīng)研究也得出了同樣的結(jié)果，證實(shí)了其在鰓和肝臟中的富集程度最高[20]。長期的IBU暴露會延長魚類產(chǎn)卵時間，可能會對魚類受精、繁殖產(chǎn)生影響[21]。Gutiérrez-Noya等發(fā)現(xiàn)IBU在環(huán)境濃度下能夠?qū)︴庺~產(chǎn)生胚胎毒性和致畸作用[6]。較高濃度的IBU對斑馬魚胚胎發(fā)育、孵化率及仔魚的存活和行為活動等產(chǎn)生顯著影響[22]。Li等在研究化合物藥品萘普生對斑馬魚胚胎和仔魚的急性毒性時，產(chǎn)生了孵化抑制、心率變緩和形態(tài)異常等中毒反應(yīng)[23]。有研究得出IBU的致畸指數(shù)(TI)值為2.82，因而證實(shí)其為潛在致畸物質(zhì)[24]。目前IBU對水生生物毒性效應(yīng)研究相對較少，且局限于組織器官和基因組學(xué)等方面的研究，缺乏對水生生物宏觀毒性效應(yīng)的研究；而IBU的環(huán)境檢測濃度通常在μg/L級別，不足以對稀有鮈鯽產(chǎn)生宏觀毒性作用，難以評估IBU對水環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此急需開展IBU宏觀毒性效應(yīng)研究，探究IBU的毒性作用大小，評估其對水生生物的潛在危害，為中國IBU水質(zhì)基準(zhǔn)的制定和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)選用中國本土稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)作為受試物種。稀有鮈鯽具有飼養(yǎng)方便、體型小、繁殖速度快、產(chǎn)卵量大等優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)人工控溫全年產(chǎn)卵，且胚胎透明易觀察[25]。研究表明，稀有鮈鯽與國際標(biāo)準(zhǔn)化受試物種斑馬魚對同一污染物的敏感性相近，毒性結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性[26]，且胚胎對藥物的敏感性高于仔魚[20]。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[27]中的NO.236、NO.210、NO.212和文獻(xiàn)[28]，開展布洛芬對稀有鮈鯽的急、慢性毒性實(shí)驗(yàn)，從受精卵開始進(jìn)行暴露，涵蓋了生物早期生命階段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用布洛芬(IBU，C13H18O2，純度≥98%)產(chǎn)自上海麥克林生化科技有限公司。藥品于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用曝氣除氯后的自來水配制成120 mg/L母液，以甲醇為助溶劑，在磁力攪拌器上攪拌溶解2 h。母液每3 d配置一次，實(shí)驗(yàn)時將母液加入曝氣除氯后的自來水，依次稀釋到所需質(zhì)量濃度制成暴露溶液，暴露溶液中甲醇助溶劑終濃度最高為0.5%。上述所用試劑均為分析純。

1.2 受試生物

稀有鮈鯽親魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所(武漢)。以不高于1 g/L的密度暫養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室30 cm×18 cm×20 cm(長×寬×高)的玻璃缸內(nèi)(雌雄分開)。加熱棒控溫，溫度保持在(25±1)℃，采用循環(huán)過濾裝置，每5～6 d換2/3水(曝氣除氯48 h并用紫外燈照射殺菌的自來水)。光照周期14 h∶10 h(晝∶夜)，自然日光燈照射。保持恒定條件馴養(yǎng)7 d以上，每天換水前、后測定缸內(nèi)溶液的溶解氧、pH、溫度等參數(shù)，保持溶解氧含量大于飽和濃度的60%，pH在7.5～8.5之間。每日10：00和16：00按時飼喂紅蟲，每次喂食量以15～30 min吃完為準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚卵的收集 實(shí)驗(yàn)開始前一天下午將親魚分別置于產(chǎn)卵網(wǎng)中，用網(wǎng)隔離以防止親魚吞食魚卵。用加熱棒控溫，并將水溫從25 ℃緩慢升高1 ℃，稀有鮈鯽產(chǎn)卵一般在晚20：00左右，產(chǎn)卵后8 h內(nèi)收集，將幾個產(chǎn)卵網(wǎng)中的卵混合并隨機(jī)選擇用于實(shí)驗(yàn)。稀有鮈鯽卵直徑為1.5 mm左右，采用內(nèi)徑4 mm的一次性移液管進(jìn)行卵的轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移過程中避免受精卵接觸空氣。通過體視顯微鏡下觀察來選擇分裂期間無明顯不規(guī)則或絨毛膜損傷的原腸期卵。

1.3.2 暴露實(shí)驗(yàn) 將正常的受精卵與未受精卵分離(記錄受精率)，將正常發(fā)育的卵轉(zhuǎn)移至用恒溫水浴鍋(26±1)℃預(yù)熱的標(biāo)準(zhǔn)24孔板中(每塊板設(shè)20個暴露組，4個空白組。每孔1個卵，共24個卵)，并在暴露實(shí)驗(yàn)前3 h內(nèi)填充2 mL/孔的布洛芬溶液。胚胎孵化前每12 h更換90%的暴露液，孵化后每24 h更換一次暴露液，并及時剔除死亡的胚胎。每24 h記錄一次觀察結(jié)果，直到測試結(jié)束。在更新暴露液前后分別測量pH值，保持溶解氧濃度大于飽和度的80%，溫度(26±1)℃。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，急性毒性試驗(yàn)共設(shè)置55、65.45、77.88、92.68、110.3 mg/L 5個IBU濃度梯度實(shí)驗(yàn)組，外加0.5%甲醇溶劑對照組和空白對照組。急性毒性實(shí)驗(yàn)測試周期為96 h。

慢性實(shí)驗(yàn)方法同急性實(shí)驗(yàn)，待仔魚卵黃囊吸收完全，可以游動時，轉(zhuǎn)移至結(jié)晶皿中進(jìn)行后續(xù)暴露實(shí)驗(yàn)。每個結(jié)晶皿20條仔魚，250 mL暴露液。每個濃度組設(shè)置3個平行，每24 h更換一次暴露液，每天喂食豐年蝦蟲卵一次。持續(xù)觀察仔魚行為特征并記錄，及時撈出死亡的仔魚(死亡標(biāo)志為身體發(fā)白，不游動，用玻璃棒觸動無反應(yīng))。慢性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置5、8、12.8、20.48、32.77、52.43 mg/L 6個濃度梯度實(shí)驗(yàn)組，外加0.5%甲醇溶劑對照組和空白對照組。慢性毒性實(shí)驗(yàn)測試周期為21 d。

在更換暴露液之前對所有不同濃度的暴露液進(jìn)行取樣，用0.22 μm聚丙烯膜抽濾，采用高效液相色譜儀分析其濃度。

1.3.3 顯微鏡觀察 對受試胚胎進(jìn)行每天至少1次的顯微鏡觀察：①48 h起記錄所有暴露組和對照組的孵化率及孵化時間；②在24、48、72和96 h后記錄尾巴未脫落的數(shù)量；③在24、48、72和96 h后記錄凝結(jié)的胚胎數(shù)量；④在24、48、72和96 h后記錄缺乏體節(jié)形成的胚胎數(shù)量(24 h后未形成體節(jié)可能是由于發(fā)育延遲所致。最遲在48 h后，應(yīng)開始形成體節(jié)。如果沒有，則認(rèn)為胚胎已經(jīng)死亡)；⑤在48、72和96 h后記錄無心跳(不規(guī)則心跳不記錄為無心跳)；⑥記錄孵化后仔魚的成活率；⑦記錄其他畸形癥狀，如心包水腫、卵黃囊腫、脊柱和尾巴彎曲等。其中②～⑤為死亡標(biāo)志[29]。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)處理 急性實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用SPSS Statistics 25.0對稀有鮈鯽胚胎的孵化率、死亡率、畸形率和異常率進(jìn)行概率回歸分析，以濃度和各毒性效應(yīng)終點(diǎn)的異常胚胎數(shù)目進(jìn)行概率分析和卡方檢驗(yàn)(p>0.15即存在顯著性差異)，確定其95%置信區(qū)間，估算96 h時布洛芬對稀有鮈鯽胚胎的急性毒性效應(yīng)值，即半數(shù)效應(yīng)或半數(shù)致死濃度(ECx或LCx)。

慢性實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用SPSS Statistics 25.0對稀有鮈鯽早期生命階段的孵化率、死亡率、畸形率、異常率、全長、干質(zhì)量和濕質(zhì)量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。對3組平行比較均值，進(jìn)行單因素ANOVA方差分析，運(yùn)用Dunnett′s Test(1-Side，p<0.05)進(jìn)行多重比較顯著性檢驗(yàn)，估算布洛芬對稀有鮈鯽早期生命階段的孵化率、死亡率、畸形率、異常率、全長、干質(zhì)量和濕質(zhì)量的慢性毒性值無，即可見效應(yīng)濃度(NOEC)和最低可見效應(yīng)濃度(LOEC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 結(jié)果分析 經(jīng)卡方檢驗(yàn)，各暴露組稀有鮈鯽胚胎的孵化率、死亡率、畸形率、異常率較空白對照組均存在顯著性差異(p>0.15)。隨IBU濃度的升高，稀有鮈鯽胚胎的孵化率持續(xù)降低，死亡率、畸形率和異常率均不斷增高。高濃度組(≥77.88 mg/L)在24 h后已出現(xiàn)凝結(jié)死亡、畸形等中毒反應(yīng)。最低濃度暴露組(55 mg/L)在48 h后出現(xiàn)畸形現(xiàn)象，60 h時出現(xiàn)凝結(jié)死亡現(xiàn)象，暴露過程中孵化率未受到影響，96 h時的孵化率為100%(見表1)。而濃度為65.45 mg/L時，稀有鮈鯽胚胎的孵化過程受到顯著影響，孵化率隨暴露濃度的升高逐漸降低；濃度為110.3 mg/L時，胚胎在96 h后均未孵化，數(shù)據(jù)擬合得出孵化率的96 h LC10為112.7 mg/L(見表2)。

表1 布洛芬對稀有鮈鯽胚胎孵化率、死亡率、畸形率和異常率的影響

表2 布洛芬對稀有鮈鯽胚胎的急性毒性效應(yīng)值

對于65.45 mg/L暴露組，24 h時出現(xiàn)尾部畸形狀態(tài)，48 h時出現(xiàn)凝結(jié)死亡、脊柱彎曲和卵黃囊腫等中毒現(xiàn)象；77.88和92.68 mg/L暴露組于24 h時即出現(xiàn)凝結(jié)死亡現(xiàn)象；110.3 mg/L濃度下，96 h時所有受試胚胎全部死亡，并均伴隨畸形。說明在此暴露濃度范圍內(nèi)，稀有鮈鯽胚胎的毒性效應(yīng)與暴露濃度成正相關(guān)。數(shù)據(jù)擬合得出LC50和畸形率的EC50均為77.73 mg/L；在92.68 mg/L 暴露組中，96 h后所有受試胚胎均出現(xiàn)異常，采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合得出異常率的EC50為66.7 mg/L。表3列出了IBU 12 和24 h的實(shí)測濃度(更換暴露液前的舊溶液)，回收率均在90%～100%之間，在名義濃度的±20%范圍內(nèi)，說明IBU具有良好的穩(wěn)定性，可用配置的暴露液濃度作為最終濃度來計(jì)算毒性效應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)中空白對照和溶劑對照組的胚胎總存活率、孵化率均為100%，符合胚胎急性毒性實(shí)驗(yàn)要求。

表3 各實(shí)驗(yàn)組中布洛芬的實(shí)測濃度

IBU對稀有鮈鯽胚胎的急性毒性作用主要表現(xiàn)在出膜時間延遲、孵化率降低、胚胎凝結(jié)死亡、尾巴未分離、缺乏體節(jié)形成、心臟凝結(jié)無心跳、心包水腫、卵黃囊腫、脊柱和尾巴彎曲、發(fā)育遲緩、出膜后體形小以及胸鰭、尾鰭和口部等組織發(fā)育異常等(見圖1)。其中心包水腫最為普遍，且在急性實(shí)驗(yàn)期間，各暴露組所有胚胎在96 h后均產(chǎn)生了不同程度的異常現(xiàn)象。急性實(shí)驗(yàn)過程中觀察到胚胎存在心跳抽動的未計(jì)入死亡數(shù)。IBU對胚胎死亡的96 h半數(shù)致死濃度在10～100 mg/L范圍內(nèi)(見表2)，參照水生生物急性毒性分級為B級，屬于低毒類化學(xué)品。

(心包水腫 Pericardial edema；胚胎凝結(jié) Embryo coagulation；凝結(jié)死亡 Condensation death；脊柱縱彎 Spine vertical bend；脊柱橫彎 Spine bending；口部組織發(fā)育異常 Dysplasia of oral tissue；脊柱彎曲 Spinal curvature；發(fā)育遲緩 Developmental retardation；心臟凝結(jié) Cardiac coagulation；卵黃囊腫 Yolk cyst；尾巴彎曲。)

2.2 慢性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 結(jié)果分析 布洛芬對稀有鮈鯽慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4、5。慢性實(shí)驗(yàn)中IBU各暴露組對稀有鮈鯽胚胎的孵化率無明顯影響，孵化率均為100%，當(dāng)濃度大于32.77 mg/L時，出膜時間出現(xiàn)延遲。

表4 布洛芬對稀有鮈鯽孵化率、死亡率、畸形率、異常率、全長和干、濕質(zhì)量的影響

表5 布洛芬對稀有鮈鯽的慢性毒性效應(yīng)值

5 mg/L暴露組死亡數(shù)量較對照組無顯著差異(p>0.05)。當(dāng)IBU濃度達(dá)到8 mg/L時，毒性作用顯著增強(qiáng)，稀有鮈鯽的死亡數(shù)和異常數(shù)較其他暴露組明顯增加。暴露第7天觀察到異常稀有鮈鯽仔魚心包處凝結(jié)發(fā)紅，且伴隨游動不協(xié)調(diào)現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)游動不協(xié)調(diào)或不游動及不進(jìn)食等異?，F(xiàn)象的仔魚，在1～2 d后均死亡。運(yùn)用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合得出死亡率的NOEC為5 mg/L，LOEC為8 mg/L。

從異常率來看，IBU濃度達(dá)到8 mg/L時，稀有鮈鯽異常數(shù)目相比空白對照和5 mg/L濃度組存在明顯差異，異常率的NOEC和LOEC分別為5和8 mg/L。對稀有鮈鯽的全長和干、濕質(zhì)量數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示IBU濃度在0到52.43 mg/L范圍內(nèi)無顯著性差異，表明此濃度范圍內(nèi)IBU對稀有鮈鯽的全長和干、濕質(zhì)量無明顯毒性作用，其毒性效應(yīng)值NOEC均為52.43 mg/L，LOEC均大于52.43 mg/L。分別在7 和14 d對各濃度組取樣，測定24 h的IBU實(shí)際濃度(更換暴露液前的舊溶液)，結(jié)果顯示回收率均在110%～120%之間，保持在名義濃度的-20%～20%之內(nèi)，因此可用配置的暴露液濃度作為最終濃度來計(jì)算毒性效應(yīng)值。

IBU對稀有鮈鯽早期生命階段的毒性作用主要表現(xiàn)在胚胎的凝結(jié)死亡、心包水腫、卵黃囊腫等和仔魚的存活、發(fā)育遲緩、組織發(fā)育異常、脊彎、尾彎以及行為異常等(見圖1)[30]。其中行為異常發(fā)生率最高，主要表現(xiàn)有不游動或游動不敏捷、不協(xié)調(diào)，魚體側(cè)翻、沉在缸底，呼吸困難，不進(jìn)食或身體發(fā)白等。慢性實(shí)驗(yàn)中鮈鯽的死亡現(xiàn)象均發(fā)生在孵化出膜之后。

2.3 稀有鮈鯽各發(fā)育時期及形態(tài)特征

表6列出了稀有鮈鯽各發(fā)育時期及形態(tài)特征，包含卵裂期、囊胚期、原腸期、分裂期、成形期和孵化期，與斑馬魚相似[31-32]。稀有鮈鯽胚胎透明，受精卵具有黏性、能沉底、吸水膨脹，因此易觀察，而未受精的卵呈乳白色。受精卵孵化溫度一般在20～30 ℃范圍內(nèi)，隨溫度升高而縮短，表6為各個發(fā)育時期均為孵化溫度((26±1)℃)的時間和形態(tài)特征。圖2展示了稀有鮈鯽正常發(fā)育各個時期的顯微鏡觀察照片。

表6 稀有鮈鯽各發(fā)育時期及形態(tài)特征

圖2 稀有鮈鯽胚胎正常發(fā)育各時期圖

3 討論

3.1 急性毒性效應(yīng)

急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IBU對稀有鮈鯽胚胎死亡率的LC50為77.73 mg/L，與畸形率(77.73 mg/L)、異常率(66.70 mg/L)的毒性效應(yīng)值相差不大。在高濃度作用下胚胎從產(chǎn)生畸形、心包水腫和卵黃囊腫等毒性效應(yīng)到發(fā)生死亡凝結(jié)的時間間隔較小，死亡濃度范圍較窄，說明在高濃度作用下稀有鮈鯽胚胎中毒作用快且明顯。同樣將大型蚤(Daphniamagna)暴露在高濃度IBU(200 mg/L)中，結(jié)果顯示死亡均發(fā)生在暴露24 h后[33]，濃度大于10 mg/L時大型蚤繁殖率降低，低于40 mg/L時不引起死亡，但高于80 mg/L時無存活。研究表明，IBU在低濃度下會對斑馬魚胚胎及仔魚產(chǎn)生心臟毒性，對心臟結(jié)構(gòu)和發(fā)育產(chǎn)生影響[36]，EC50為2.496 mg/L。

暴露于IBU的斑馬魚胚胎同樣產(chǎn)生了孵化率降低、發(fā)育遲緩、組織器官畸形、色素減退、心包水腫、胚胎死亡率升高及氧化損傷等毒性效應(yīng)[22, 24]。IBU作為一種丙酸衍生物[37]，又稱非選擇性抑制劑[22]，能對環(huán)氧化酶(COX)產(chǎn)生抑制作用；而COX是胚胎發(fā)育過程中一種重要的酶[38]。IBU通過抑制COX-1和COX-2系統(tǒng)來抑制前列腺素(PG)的合成[39-40]前列腺素(PG)在生殖、維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定以及組織器官形成中發(fā)揮重要作用[41]。IBU通過對COX-1的抑制，破壞心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致胚胎心率異常、形成心包水腫，從而壓迫心臟，造成心臟損傷等[42]，最終導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩、組織器官畸形等毒性效應(yīng)[36]。這也是心包水腫在本研究中普遍產(chǎn)生的原因。

細(xì)胞色素P450酶(CYP)是與藥物代謝相關(guān)的酶，IBU的致畸作用可能是由于其和多種CYP作用，發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化[43-44]，使代謝產(chǎn)物具有更高的毒性[45]。本實(shí)驗(yàn)中隨IBU濃度的升高，稀有鮈鯽胚胎的孵化率持續(xù)降低，這與Sánchez-Aceves等[24]和Xia等[46]的研究結(jié)果一致，可能是由于IBU的作用導(dǎo)致蛋白酶活性受到抑制、改變了絨毛膜的滲透性，使內(nèi)部耗氧量增加致使自發(fā)運(yùn)動減少，最終對發(fā)育過程產(chǎn)生影響，如尾巴不能正常脫落而導(dǎo)致胚胎死亡及孵化延遲等[47-49]。稀有鮈鯽的多種中毒現(xiàn)象表明，IBU會對稀有鮈鯽胚胎的孵化及組織器官、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響，對其生存構(gòu)成威脅。

3.2 慢性毒性效應(yīng)

慢性實(shí)驗(yàn)中，低濃度組對稀有鮈鯽胚胎的孵化率、仔魚的全長和干、濕質(zhì)量均未產(chǎn)生明顯毒性作用。當(dāng)IBU濃度達(dá)到8 mg/L時，仔魚形態(tài)異常的數(shù)量相較空白對照顯著性差異，暴露期間仔魚出現(xiàn)不游動、不進(jìn)食和身體翻轉(zhuǎn)等現(xiàn)象，1～2 d內(nèi)均死亡。表明長期的IBU暴露會對稀有鮈鯽的心臟、腦和骨骼等組織發(fā)育及代謝等生理活動產(chǎn)生影響，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究表明，較高濃度的IBU(1 000 μg/L)可通過改變生物標(biāo)記物來降低菲律賓蛤仔的免疫力，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[50]；暴露于較高濃度IBU的斑馬魚仔魚同樣出現(xiàn)了不游動或游動顯著減少的現(xiàn)象，且相較雙氯芬酸而言，IBU的毒性作用更為緩慢且持久[46]。

IBU直接作用于COX-1和COX-2系統(tǒng)，抑制環(huán)氧化酶，導(dǎo)致胚胎自發(fā)運(yùn)動減少、孵化延遲和骨骼發(fā)育缺陷等，可能是稀有鮈鯽產(chǎn)生畸形和不游動的原因，且IBU是通過作用于人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來達(dá)到止痛的目的[51]，因此能夠證明其具有潛在神經(jīng)毒性[46]。對斑馬魚的基因測試也證實(shí)了這一點(diǎn)，基因表達(dá)的減少導(dǎo)致腦損傷，進(jìn)而表現(xiàn)為行為異常等毒性效應(yīng)[46]。魚類暴露于IBU中導(dǎo)致其氧化還原系統(tǒng)發(fā)生變化，蛋白等被代謝為有毒物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生胚胎毒性，導(dǎo)致仔魚嚴(yán)重畸形等[52]。

多項(xiàng)研究表明IBU可在魚類肝臟和鰓等組織中富集[17, 20]，并且由于其特殊的藥物特性和作用機(jī)制，使其對水生生物的毒性效應(yīng)緩慢且持久，長期的低濃度暴露引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]；這也表明IBU在組織器官中的蓄積作用可能是導(dǎo)致稀有鮈鯽產(chǎn)生宏觀慢性毒性效應(yīng)的原因。IBU對蝸牛(Planorbiscarinatus)的21 d毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，存活率的LOEC和NOEC分別為45.36和5.36 mg/L，孵化率的LOEC和NOEC分別為5.36和2.43 mg/L[53]，與本實(shí)驗(yàn)毒性效應(yīng)值相近；而IBU對斑馬魚DNA的慢性毒性效應(yīng)值為66.4 ng/L[54]，慢性毒性效應(yīng)值相差較大。因此，IBU對水生生物的宏觀和基因組學(xué)毒性效應(yīng)之間的差異和聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽胚胎及仔魚均展現(xiàn)了良好的生物學(xué)特性，其毒理學(xué)特征與斑馬魚具有很大程度的相似性，展現(xiàn)了良好的適用性，可作為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的模式生物。且中國尚未開展布洛芬水質(zhì)基準(zhǔn)的研究與制定，本實(shí)驗(yàn)得出的IBU急、慢性毒性效應(yīng)值可為今后IBU的基準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

3.3 展望

由于布洛芬具有化學(xué)穩(wěn)定性，其在水環(huán)境中不易被降解，長時間的暴露對生物各個組織器官具有潛在危害，需進(jìn)一步開展布洛芬對稀有鮈鯽早期生命階段的組織器官和基因組學(xué)等方面毒性效應(yīng)的研究，并與宏觀毒性效應(yīng)進(jìn)行對比分析。另外，水環(huán)境中通常有多種污染物共同存在，混合物對水生生物的毒性作用與機(jī)制還有待研究。本研究中IBU的暴露濃度高于水環(huán)境中的檢測濃度，對此，今后將進(jìn)一步研究環(huán)境相關(guān)濃度下IBU對稀有鮈鯽胚胎的潛在毒性效應(yīng)。

4 結(jié)論

(1)一定濃度的布洛芬暴露下，稀有鮈鯽胚胎及仔魚均呈現(xiàn)不同程度的毒性效應(yīng)，包括孵化率降低、凝結(jié)死亡、心包水腫、卵黃囊腫、脊柱和尾巴彎曲、發(fā)育遲緩、組織發(fā)育異常和行為異常等。其中：心包水腫在急性毒性實(shí)驗(yàn)中最普遍；行為異常在慢性實(shí)驗(yàn)中發(fā)生率最高。

(2)急性實(shí)驗(yàn)中，稀有鮈鯽的毒性效應(yīng)貫穿胚胎發(fā)育全過程；慢性實(shí)驗(yàn)中，低濃度對胚胎發(fā)育、孵化率和畸形率無效應(yīng)，但對孵化后的仔魚具有毒性效應(yīng)，多表現(xiàn)為行為異常。

(3)稀有鮈鯽胚胎透明、易觀察、對污染物暴露敏感，可作為生態(tài)毒理學(xué)研究的潛在模式生物。

(4)水生生物對IBU存在生物蓄積作用，通過長期的暴露會對水生生物的生存和繁殖產(chǎn)生危害，應(yīng)加強(qiáng)IBU慢性毒性效應(yīng)的研究；另外，污水處理廠的進(jìn)出水、河口及河流交匯處的IBU濃度高，具有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)予以廣泛的關(guān)注。