邵勁松， 宣 芳， 薛雯蔚， 林志慧， 陳昌云*

(1.南京曉莊學院環(huán)境科學學院，江蘇南京 211171；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，江蘇南京 210036)

近年，新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)全球大流行，而新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)持續(xù)變異，傳播鏈一再延長，影響日益復雜，全球疫情不容樂觀。國內(nèi)外各個研究機構(gòu)一直都在開展變異毒株的藥物研究工作。最新研究成果[1 - 4]顯示，“三藥三方”的代表藥物連花清瘟對α、β和δ毒株均有抑制效果，顯示了穩(wěn)定的體外抗病毒作用。連花清瘟顆粒是一種中藥復方制劑，藥方中含有炒苦杏仁、連翹、炙麻黃、薄荷腦、魚腥草、金銀花、廣藿香、大黃、紅景天和甘草等多種中草藥[5]，具有清瘟解毒、泄熱宣肺的效果。其中，炒苦杏仁的主要成分苦杏仁苷，金銀花中的綠原酸以及連翹中連翹苷對本品發(fā)揮療效起到重要作用[6 - 8]。該藥的藥理性質(zhì)研究表明[9,10]，連花清瘟顆粒對大多數(shù)病毒均有對抗作用，通常用于流行性感冒病毒、柯薩奇病毒、呼吸道合胞病毒(HRSV)、單純皰疹病毒等多種病毒，適用于發(fā)熱或者高熱不退，頭痛、咳黃痰、身體疼痛、鼻塞，以及流黃鼻涕、咽干、咽痛等癥狀，對于新型冠狀病毒肺炎普通型患者的發(fā)熱、咳嗽、乏力等癥狀能起到很好的治療效果。因此，在變異毒株沖擊我國的新形勢下，利用好兼具中醫(yī)特色和藥理依據(jù)的中成藥開展群防群治，具有重要的現(xiàn)實意義。

中藥成分極其復雜，難以保證其質(zhì)量一致性。2020版《中國藥典》規(guī)定連花清瘟顆粒中連翹苷含量可作為質(zhì)量控制標準之一，但就其成分的多樣性而言，僅測定其中一種成分含量很難客觀真實地反映其內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)劣。中藥指紋圖譜是目前中藥產(chǎn)品質(zhì)量控制的有效手段。目前，文獻報道的關于連花清瘟指紋圖譜的方法主要為高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)。李正杰等[11]采用超高效液相色譜(UPLC)法建立連花清瘟膠囊超聲逆流提取液的指紋圖譜，共標定27個共有峰，指認其中4個共有峰，11批連花清瘟膠囊超聲逆流提取液指紋圖譜的相似度均為0.991～1.000。蘇愛國等[12]采用HPLC法建立連花清瘟膠囊多成分含量測定及其指紋圖譜分析，對其中的5個指標成分進行定量測定，確定了14個共有峰，利用相似度軟件對10批樣品的指紋圖譜進行分析，各批樣品相似度均大于0.931。郭璐瑤等[6]同時對連花清瘟顆粒中連翹苷、連翹酯苷A、綠原酸、新綠原酸等多種有效成分的含量進行測定，并研究了其指紋圖譜，確定了14個共有峰。目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術在連花清瘟顆粒指紋圖譜的建立方面鮮有報道?；诖?，本研究通過超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(UPLC-Q-TOF-MS)建立連花清瘟顆粒的HPLC指紋圖譜，確認其化學成分，并根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》對其進行相似度評價和化學模式識別方法分析，以期為其質(zhì)量控制與評價提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型液相色譜儀(美國，安捷倫科技有限公司)；LC-3A型超高效液相色譜儀；AUY120電子天平(日本，Shimadzu公司)；Triple TOF 4600飛行時間高分辨質(zhì)譜儀(美國，SCIEX公司)；KQ-200KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。

連翹苷、大黃酸、大黃素、大黃酚、綠原酸對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。無水乙醇(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，美國TEDIA試劑公司)；磷酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；娃哈哈純凈水(市售)。

連花清瘟顆粒(批號：B2005056/B2001056/2006041/2006023/2007006/2004010/2002007/1910007/2001061/2006006，北京以嶺藥業(yè)有限公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1 高效液相色譜條件Swell Chromplus TM-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.1%磷酸為流動相A，乙腈為流動相B；梯度洗脫程序：0～10 min，10%B；10～20 min，10%～22%B；20～30 min，22%～30%B；30～45min，30%～68%B；45～60 min，68%～75%B；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.2 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)；以0.1%甲酸溶液為流動相A、0.1%甲酸乙腈為流動相B；梯度洗脫程序：0～1 min，2%B；1～8 min，2%～45%B；8～10 min，45%～98%B；10～12 min，98%B；12～16 min，98%～2%B；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃，去簇電壓(DP)為60 V，霧化氣體為氮氣，為344.75 kPa，輔助氣為344.75 kPa，氣簾氣為172.37 kPa。一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為50～1 000 Da，碰撞能量(CE)為10 eV；二級質(zhì)譜掃描范圍為40～1 000 Da，碰撞能量(CE)為35 eV。

1.3 試液配制

1.3.1 對照品溶液精密稱取綠原酸、大黃酸各2 mg，連翹苷、大黃素、大黃酚各1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇使其溶解，稀釋并定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得。

1.3.2 供試品溶液取供試品適量，研細至粉末狀，精密稱取2 g，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇-水溶液補足減失重量并定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

分別考察50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、50%乙醇和水作為提取溶劑對色譜系統(tǒng)出峰情況的影響。結(jié)果表明，采用50%甲醇作提取溶劑時，提取率良好，測得色譜峰數(shù)最穩(wěn)定、峰形最佳。故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動相結(jié)合2020年版《中國藥典》中連花清瘟顆粒的含量測定方法[5]，分別考察0.1%磷酸-乙腈、0.3%磷酸-乙腈、0.5%冰醋酸-乙腈作為流動相對色譜出峰情況的影響。結(jié)果表明，流動相為0.1%磷酸-乙腈時系統(tǒng)響應靈敏，各峰分離度良好。選擇0.1%磷酸-乙腈作為流動相。

2.2.2 檢測波長采取二極管陣列檢測器的全波長掃描方式，重點考察了207、221、230、278、327 nm波長下的譜圖。結(jié)果表明，207、221、230 nm波長范圍內(nèi)均出現(xiàn)基線抬高的現(xiàn)象；327 nm波長超過部分有效成分的最大吸收波長，色譜峰數(shù)偏少；而278 nm處的色譜峰數(shù)，分離度及峰面積效果更好。故選用278 nm作為檢測波長。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度取適量1號供試品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.2.1”色譜條件進行分析，連續(xù)進樣6次，記錄其中一有效成分連翹苷的保留時間、峰面積，計算其RSD。結(jié)果表明，其共有峰相對保留時間RSD為0.049%、峰面積RSD為2.06%，證明該方法精密度良好。

2.3.2 重復性取適量1號供試品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液6份，依“1.2.1”色譜條件進行分析，記錄其中一有效成分連翹苷的保留時間、峰面積，計算其RSD。結(jié)果表明，其共有峰相對保留時問RSD為0.14%、峰面積RSD為2.16%，證明該方法重復性良好。

2.3.3 溶液穩(wěn)定性取“2.3.1”中供試品溶液，依“1.2.1”色譜條件，于0、1、5、8、12 h分別進樣分析。結(jié)果顯示，常溫下供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，其各時間點的保留時間與初始測得值的比值在0.98～1.02之間，各個時間點測得的一主成分峰面積與初始峰面積的RSD均小于3.0%。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 指紋圖譜建立取10批蓮花清瘟顆粒樣品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.2.1”色譜條件進行分析，記錄各色譜圖。使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(版本：2012.130723),將色譜分析數(shù)據(jù)引入該系統(tǒng)內(nèi)，根據(jù)計算方法生成對照圖譜。選用S1作為參考圖譜，多點校正后標定與其他圖譜的共有峰；將各對照品的保留時間與各中醫(yī)藥材指紋圖譜進行比對分析，確認其中共有峰。結(jié)果顯示，10批樣品中共有特征峰16個。根據(jù)對照品溶液比對結(jié)果可以鑒別出5個化學成分，分別是綠原酸、連翹苷、大黃酸、大黃素、大黃酚。指紋圖譜見圖1。

2.4.2 相似度評價根據(jù)10批連花清瘟顆粒的指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》(版本：2012.130723)進行相似度計算。10批連花清瘟顆粒的相似度達到0.967之上，結(jié)果見表1。

表1 10批連花清瘟顆粒樣品的相似度計算

(續(xù)表1)

2.5 化學成分鑒定

采用HPLC法對對照品進行分析，色譜圖見圖2，從連花清瘟顆粒中鑒定出綠原酸、連翹苷、大黃酸、大黃素、大黃酚這5種化學成分。通過UPLC-Q-TOF-MS法對指紋圖譜色譜峰進行確認，利用MasterView軟件得到相對分子質(zhì)量和化學式，共鑒定出9種化學成分，分別是新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、苦杏仁苷、異綠原酸A、大黃酸、大黃素、大黃酚、連翹酯苷A，如圖3所示，數(shù)據(jù)表見表2。

圖2 對照品溶液的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference solutionRemark：Peak 1.chlorogenic acid,peak 2.forsythin,peak 3.rhein,peak 4.emodin,peak 5.chrysophanol.

表2 主要共有峰UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)分析

圖3 10批連花清瘟顆粒樣品UPLC-Q-TOF-MS/MS正離子流圖Fig.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS positive total ion chromatogram of ten batches of Lianhua Qingwen granule samplesPeak 1.neochlorogenic acid,peak 2.chlorogenic acid,peak 3.cryptochlorogenic acid,peak 4.amygdalin,peak 5.isochlorogenic acid A,peak 6.rhein,peak 7.emodin,Peak 8.chrysophanol,peak 9.forsythiaside A.

2.6 化學計量學考察

2.6.1 聚類分析使用SPSS 26.0軟件進行聚類分析，將10批連花清瘟顆粒樣品中的共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導入該軟件，通過相關數(shù)據(jù)的組間聯(lián)接法和平方歐式距離的處理進行分析。根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果可以判斷出，10批連花清瘟顆粒樣品被分為三部分：第一部分由S1、S2、S3、S5聚集而成；S6、S7、S8、S9、S10聚為第二部分；第三部分則為S4。結(jié)果見圖4，就聚類分析結(jié)果可知，不同的產(chǎn)品批次之間也會存在一些差異。

圖4 聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis graph

2.6.2 主成分分析使用多元變量統(tǒng)計軟件SIMCA14.1進行主成分分析，將10批連花清瘟顆粒樣品的共有峰峰面積導入該軟件。通過相關數(shù)據(jù)的降維手段，可以將10批樣品結(jié)果分為4個主成分，數(shù)據(jù)中前兩個貢獻最大，累計貢獻率可達83.4%，充分體現(xiàn)了連花清瘟顆粒的主要信息和基本特征。以其坐標軸為依據(jù)構(gòu)建了組成樣品的主要化學成分的二維平面，將樣品中的多元化學變量經(jīng)由降維的方式直接投影到該二維平面上，從而可以觀察到樣品的整理分布狀態(tài)情況及各種化學變量對于樣品整理分布的貢獻程度大小。觀察圖可知，該結(jié)果和聚類分析的結(jié)果基本一致，如圖5所示。10批連花清瘟顆粒樣品被分為3類：第一類集中分布在第四象限，分別是S1，S2，S3，S5；第二類散布在第一象限，第二象限和第三象限，分別是S6，S7，S8，S9，S10；第三類S4落在第一象限，數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明，產(chǎn)品不同批次間存在差異。

圖5 PCA散點得分圖Fig.5 Score plot of PCA

表3 主成分分析數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

本研究通過超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)建立了連花清瘟顆粒的指紋圖譜，共指認出9個化學成分，分別是新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、苦杏仁苷、異綠原酸A、大黃酸、大黃素、大黃酚、連翹酯苷A，一定程度上對關于連花清瘟顆粒現(xiàn)有報道的指紋圖譜進行補充，并對所得指紋圖譜進行相似度評價和化學模式識別方法分析，證明該指紋圖譜可使用性，為連花清瘟質(zhì)量控制與評價提供參考。通過方法學考察，證明該方法滿足成分復雜的中藥制劑質(zhì)量控制和新藥開發(fā)的需求。