樂詩文， 程冰薇， 周漪漣， 趙 琴*

(武漢科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070)

多環(huán)芳烴(PAHs)是有機(jī)物質(zhì)不完全燃燒或熱解形成的污染物[1]，在環(huán)境中廣泛存在。多項(xiàng)研究證明PAHs進(jìn)入人體后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有致癌、致畸、致突變的風(fēng)險(xiǎn)[3,4]。PAHs的暴露途徑多種多樣，包括吸入、皮膚接觸和食入等[5]，因此直接評(píng)估人群的外暴露水平存在困難。研究顯示，1-羥基芘(1-OHP)是PAHs的一種綜合生物標(biāo)志物[7]，美國(guó)政府工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家協(xié)會(huì)(ACGIH)也將1-OHP作為PAHs生物監(jiān)測(cè)的綜合指標(biāo)。因此，建立尿樣中1-OHP快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠的檢測(cè)方法，對(duì)評(píng)估人體PAHs的綜合暴露水平具有重要意義。

1-OHP在尿液中通常以葡萄糖醛酸酯和芳基硫酸酯的結(jié)合態(tài)形式存在，因此，在檢測(cè)前通常需要水解尿樣，將1-OHP的結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)。此外，尿液樣品基質(zhì)復(fù)雜，且1-OHP在尿液中的濃度較低，為了去除尿液樣品基質(zhì)的干擾和提高檢測(cè)方法的靈敏度，有必要對(duì)尿液進(jìn)行樣品前處理。目前報(bào)道的應(yīng)用于尿樣中1-OHP的前處理方法有液-液萃取(LLE)[7,8]、分散液液微萃取(DLLME)[9,10]、固相萃取(SPE)[11,12]、固相微萃取(SPME)[13,14]、磁固相萃取(MSPE)[15,16]等。其中，SPE作為一種成熟的樣品前處理技術(shù)，具有有機(jī)溶劑消耗量低、目標(biāo)分析物回收率高、基質(zhì)去除效果好、無需相分離、操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)。普通一次性醫(yī)用口罩的過濾層從內(nèi)到外分別為紡粘層、熔噴層、紡粘層，其中間的熔噴層為由聚丙烯超細(xì)纖維(約1～10 μm)構(gòu)成的熔噴布，其具有較大的比表面積和較好的滲透性，整體平整柔軟，可填充于SPE小柱中。聚丙烯作為高分子烴基聚合物，具有較好的疏水親油特性?；谝陨咸攸c(diǎn)，熔噴布可作為一種理想的SPE材料應(yīng)用于生物樣品中疏水性物質(zhì)的分離與富集。

本研究將熔噴布作為SPE吸附材料應(yīng)用于尿樣中1-OHP的分離與富集。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了一系列影響萃取效果的參數(shù)，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)，建立了一種檢測(cè)尿樣中1-OHP的新方法，為評(píng)估人體PAHs的綜合暴露水平提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和色譜條件

Waters ACQUITYH超高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司)，配FLD熒光檢測(cè)器。液相色譜柱為美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的ACQUITY UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1% HAc(70/30,V/V)，等度洗脫；柱溫40 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。FLD激發(fā)波長(zhǎng)(λex)為346 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(λem)為386 nm。

1.2 試劑與材料

HAc、(NH4)2HPO4、H3PO4、NaCl、K2SO4、NaAc·3H2O、尿素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑(上海)有限公司，均為分析純。甲醇、β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶購(gòu)自德國(guó)默克公司。1-羥基芘(98%)、肌酐(99%)購(gòu)自上海麥克林生化科技(上海)有限公司。SPE小柱(3 mL)及配套篩板購(gòu)買自Biocomma(深圳)公司。

本研究中所使用到的普通醫(yī)用外科口罩，分別購(gòu)自青島海諾生物工程有限公司、廣西南寧北侖河醫(yī)療衛(wèi)生材料有限公司、江西南昌科華醫(yī)療器械有限公司、枝江奧美醫(yī)療用品有限公司、黃岡穩(wěn)健醫(yī)療用品股份有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列與模擬尿液

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱量10 mg 1-OHP固體于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得到1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃下保存。根據(jù)需要采用純水適當(dāng)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，直接將其加入模擬尿液或?qū)嶋H尿樣中得到所需濃度的樣品溶液。

1.3.2 模擬尿液的配制[17]取12.50 g NaCl、25.00 g尿素、4.05 g(NH4)2HPO4、1.20 g肌酐、1.74 g K2SO4溶解在500 mL純水中，用H3PO4調(diào)節(jié)pH值為6.0，用純水定容至1 L。

1.4 尿樣的處理

收集志愿者的晨尿，于-20 ℃冷凍保存，使用前于4 ℃解凍。取20 mL尿樣，用10 mL 0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液(pH=5.0)稀釋后，加入50 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，37 ℃水解15 h。將水解后的尿液離心(4 000 r/min，5 min)后，取上清液用純水定容至100 mL，加入8 g NaCl，用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0，備用。

1.5 SPE步驟

口罩拆除里外兩層無紡布和掛繩，保留濾芯，即可得到實(shí)驗(yàn)所需的熔噴布材料。將熔噴布裁剪成適當(dāng)大小(20 mm×30 mm)后裝入3 mL空SPE小柱中，蓋上篩板并按壓緊實(shí)，便可得到SPE柱。SPE小柱首先通過12 mL上樣液，控制流速為5 mL/min。待上樣液流出后，用3 mL純水清洗SPE小柱，真空泵抽干殘留清洗液。使用1 mL甲醇作為解吸液清洗，收集解吸液，取10 μL進(jìn)行HPLC-FLD檢測(cè)。SPE在Supelco12孔固相萃取裝置(北京康林科技有限責(zé)任公司中國(guó))上完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品牌口罩中熔噴布的重現(xiàn)性

本研究隨機(jī)采購(gòu)5個(gè)品牌的醫(yī)用口罩，按照“1.5”對(duì)加標(biāo)模擬尿樣(50 μg/L)進(jìn)行前處理。結(jié)果如表1所示，目標(biāo)分析物的回收率在89.1%～96.3%之間，不同品牌的熔噴布SPE小柱對(duì)1-OHP回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.8%，說明熔噴布SPE小柱的萃取性能，幾乎不受生產(chǎn)工藝水平以及外部環(huán)境條件的影響。

表1 采用不同品牌的熔噴布作為SPE吸附劑對(duì)1-OHP的回收率

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

2.2.1 熔噴布裁剪大小為了便于熔噴布緊實(shí)地裝入固相萃取小柱，需在裝柱之前對(duì)熔噴布進(jìn)行適當(dāng)?shù)牟眉簟１狙芯恐袑⒄麎K熔噴布(150 mm×120 mm)裁剪，分別等分為3份(50 mm×120 mm)、6份(50 mm×60 mm)、9份(50 mm×40 mm)、12份(50 mm×30 mm)、30份(20 mm×30 mm)，裝入固相萃取小柱中，考察其裁剪大小對(duì)1-OHP回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，裁剪后熔噴布的大小對(duì)回收率的影響幾乎可以忽略(圖1)。原因在于熔噴布本身材質(zhì)柔軟，易于填充進(jìn)固相萃取小柱中，因此，只要將熔噴布在固相萃取小柱中填充緊實(shí)即可獲得良好的萃取效果。

圖1 熔噴布裁剪大小對(duì)回收率的影響Fig.1 The influence of meltblown nonwoven fabric cutting size on the recovery

2.2.2 熔噴布質(zhì)量熔噴布作為吸附劑，其用量是影響1-OHP回收率的重要因素。圖2(a)顯示，隨著熔噴布質(zhì)量的增加，1-OHP的回收率逐漸增加，在質(zhì)量達(dá)到0.5 g時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)熔噴布質(zhì)量大于0.5 g時(shí)1-OHP的回收率明顯降低。理論上增加熔噴布的用量可以提高1-OHP的回收率，但當(dāng)解吸液體積一定時(shí)，隨著熔噴布用量的增加，被解吸的1-OHP相對(duì)減少，1-OHP解吸不完全，導(dǎo)致回收率下降。與此同時(shí)，由于萃取材料熔噴布的質(zhì)量增加，固相萃取小柱的阻力隨之增大，上樣液的流出速率會(huì)明顯降低。綜合分析，熔噴布用量選擇0.5 g。

2.2.3 上樣液體積上樣液體積會(huì)影響富集倍數(shù)，同時(shí)也會(huì)影響1-OHP的萃取回收率。實(shí)驗(yàn)中考察了上樣液體積在3～15 mL范圍內(nèi)1-OHP回收率的變化。結(jié)果顯示，上樣液體積小于12 mL時(shí)，隨著上樣液體積的增加，1-OHP的回收率也隨之升高，當(dāng)上樣液體積超過12 mL時(shí)，1-OHP的回收率呈下降趨勢(shì)，見圖2(b)。最終選擇12 mL作為最佳的上樣液體積。

2.2.4 上樣液pH和鹽濃度1-OHP呈弱酸性，樣品溶液的pH對(duì)其存在狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生較大的影響，從而影響1-OHP的回收率。在實(shí)驗(yàn)中用氨水和H3PO4調(diào)節(jié)上樣液的pH為5～10，考察在不同的pH值下1-OHP的回收率。由圖2(c)可知，在pH為5～6時(shí)，回收率基本保持不變；pH在6～9范圍內(nèi)，回收率顯著上升；pH>9時(shí)，回收率急劇下降。這是因?yàn)槿蹏姴汲嗜鯄A性，而1-OHP的萃取富集主要通過與熔噴布之間的疏水作用實(shí)現(xiàn)，在酸性條件下熔噴布會(huì)吸附氫離子，導(dǎo)致其與1-OHP的疏水作用減弱。但當(dāng)樣品溶液為弱堿性環(huán)境時(shí)，熔噴布疏水性較強(qiáng)，且1-OHP主要呈分子狀態(tài)，兩者之間的相互作用較強(qiáng)，萃取效果較好。最終選擇pH為9.0，以獲得1-OHP最佳的萃取效果。

在樣品溶液中加鹽一方面會(huì)產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，降低目標(biāo)物在樣品溶液中的溶解度，有利于其與吸附劑的結(jié)合，從而提高回收率；另一方面加入鹽可以影響目標(biāo)分析物與萃取材料之間的相互作用從而影響萃取效率。本研究在樣品溶液中加入不同質(zhì)量的NaCl(0～12%)，考察鹽濃度對(duì)1-OHP萃取效率的影響，結(jié)果見圖2(d)。隨著鹽濃度的增加，1-OHP的回收率出現(xiàn)了先增大后減小的現(xiàn)象。當(dāng)鹽含量在0～8%時(shí)，1-OHP 的回收率逐漸提高。這是由于隨著上樣液鹽濃度的增加，1-OHP在溶液中的溶解度降低，更容易吸附保留在萃取材料熔噴布上，此時(shí)鹽濃度的升高有利于目標(biāo)分析物的萃?。划?dāng)鹽濃度超過8%時(shí)，過量的NaCl會(huì)阻礙熔噴布與1-OHP的相互作用，導(dǎo)致1-OHP在熔噴布上的保留減弱，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)分析物的回收率降低。綜合分析，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中樣品溶液的鹽濃度選擇8%。

2.2.5 解吸液的種類和體積對(duì)1-OHP的解吸是SPE的關(guān)鍵步驟，也是影響其回收率的重要因素。在本研究中分別使用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和異丙醇作為解吸液來洗脫熔噴布上吸附的1-OHP，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2(e)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，甲醇、乙醇、丙酮都可獲得較高的解吸效率，其中甲醇和丙酮的解吸效果最好。但是當(dāng)丙酮作為解吸液時(shí)，由于溶劑效應(yīng)，其直接進(jìn)入色譜分析得到的色譜峰峰底寬度較大，導(dǎo)致方法靈敏度下降，因此選擇甲醇作為1-OHP的解吸液。本實(shí)驗(yàn)還同時(shí)還考察了甲醇的用量對(duì)解吸效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(f)所示。隨著甲醇體積從0.4 mL增加至0.6 mL，1-OHP的峰面積增大，當(dāng)甲醇體積大于0.6 mL時(shí)峰面積先緩慢減小再急劇下降。1-OHP的回收率在0.4 mL到1 mL的范圍內(nèi)保持上升趨勢(shì)并在1 mL時(shí)達(dá)到最大值?？紤]到1-OHP的峰面積在0.6 mL到1 mL時(shí)相差不大，為了保證本實(shí)驗(yàn)擁有較高的回收率，最終選擇解吸溶劑的使用量為1 mL。

圖2 不同的萃取條件對(duì)回收率的影響:(a)熔噴布的量，(b)上樣液體積，(c)pH，(d)鹽濃度，(e)解吸液種類，和(f)解吸液體積。Fig.2 The influence of key parameters on the extraction efficiency:(a) amount of meltblown nonwoven fabrics,(b) sample volume,(c) pH,(d) salinity,(e) type of eluting solvent,and(f) volume of eluting solvent.

優(yōu)化后的固相萃取條件如下：熔噴布用量0.5 g；12 mL的樣品溶液作為上樣液；1 mL的甲醇作為解吸液；調(diào)節(jié)上樣液的pH為9，鹽濃度為8%。圖3曲線a為1-OHP標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為100 μg/L)的色譜圖，圖3曲線b是用該方法測(cè)定模擬尿液中1-OHP(濃度為100 μg/L)的色譜圖。從圖中可明顯看出，經(jīng)過萃取后，1-OHP的峰面積有了大幅的增加，富集倍數(shù)為12。這表明熔噴布作為吸附劑可以有效地從尿液基質(zhì)中分離并富集1-OHP，同時(shí)也顯示熔噴布作為SPE材料在樣品前處理中有較好的應(yīng)用潛力。

圖3 1-OHP標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg/L)(a)和加標(biāo)濃度為100 μg/L模擬尿液樣品中1-OHP的色譜圖(b)Fig.3 Chromatogram of 1-OHP standard(100 μg/L)(a) and the simulated urine sample spiked at 100 μg/L of 1-OHP (b)

此外，本研究通過重復(fù)使用同一熔噴布SPE小柱以考察其重復(fù)使用性能。將使用過的熔噴布SPE小柱，依次用2 mL甲醇和3 mL純水進(jìn)行清洗后，按照“1.5”所述方法將其循環(huán)使用5次后，1-OHP回收率仍然可以達(dá)到90%以上，顯示出熔噴布SPE小柱良好的重復(fù)利用性能。

2.3 方法學(xué)考察

在上述優(yōu)化的條件下，進(jìn)行了線性、檢出限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度以及加標(biāo)回收率的實(shí)驗(yàn)。考慮到模擬尿樣更加易于制備，且組分更穩(wěn)定，因此選擇加標(biāo)模擬尿樣作為構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的基質(zhì)。通過在模擬尿液中添加不同濃度的1-OHP(每個(gè)濃度平行三組實(shí)驗(yàn))，以得到的峰面積的平均值對(duì)樣品濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明：1-OHP在0.01～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為:Y=477.24X+94.499(R2>0.9999)。LOD和LOQ值為對(duì)應(yīng)于目標(biāo)物信噪比(S/N)為3和10的濃度。LOD值為0.003 μg/L，LOQ值為0.01 μg/L。

方法的精密度(重現(xiàn)性)由日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來衡量。在本研究中，在未酶解的實(shí)際尿樣中分別添加低(1 μg/L)、中(5 μg/L)、高(10 μg/L)3個(gè)濃度的1-OHP。以1 d內(nèi)單獨(dú)配制6組平行樣進(jìn)行萃取，計(jì)算出日內(nèi)RSD；以連續(xù)3 d，每天配制3組平行樣品并進(jìn)行萃取，得到3個(gè)平均值，計(jì)算3個(gè)平均值之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差得到日間RSD。結(jié)果表明(表2)日內(nèi)和日間RSDs分別小于5.2%和4.2%，說明該方法重現(xiàn)性良好。

方法的準(zhǔn)確度由相對(duì)回收率來衡量。在本研究中，我們?cè)谖疵附獾膶?shí)際尿樣中分別添加低(1 μg/L)、中(5 μg/L)、高(10 μg/L)3個(gè)濃度的目標(biāo)分析物。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度除以加標(biāo)濃度乘以100%，得到相對(duì)回收率。結(jié)果顯示(表2)3個(gè)濃度的相對(duì)回收率在91.7%～98.6%之間，說明本研究所建立的方法準(zhǔn)確性良好。

表2 模擬尿液樣品中3種不同濃度水平1-OHP測(cè)定的精密度(日內(nèi)和日間)和回收率

2.4 與現(xiàn)有方法比較

將本研究中所建立的方法與文獻(xiàn)已報(bào)道的尿樣中1-OHP的檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表3。本研究中所提出的基于熔噴布固相萃取結(jié)合HPLC-FLD檢測(cè)的方法簡(jiǎn)便、快速；此方法操作簡(jiǎn)便，無需氮吹、渦旋等耗時(shí)操作，大大提高了操作的簡(jiǎn)便性，減少了整個(gè)預(yù)處理時(shí)間，整個(gè)SPE過程可在10 min內(nèi)完成。萃取過程中僅僅消耗1mL的甲醇，避免了大量有機(jī)溶劑的使用，比傳統(tǒng)的LLE方法更環(huán)保。與此同時(shí)，本研究中所使用到的萃取材料為口罩中的熔噴布，價(jià)格低廉且材料性質(zhì)穩(wěn)定，優(yōu)于一些合成過程復(fù)雜、穩(wěn)定性較差的萃取材料，相較于傳統(tǒng)的SPE方法更經(jīng)濟(jì)。此外，與其他檢測(cè)方法相比，本方法的檢出限和定量限更低，回收率和精密度與其他方法相當(dāng)。綜上所述，本方法相較于現(xiàn)有研究中的其他方法，更為綠色經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便快捷。

表3 不同方法樣品前處理過程的比較。

2.5 實(shí)際樣品分析

將采集到的尿樣進(jìn)行分析，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行確證(加標(biāo)濃度為0.2 μg/L)，每個(gè)樣本平行測(cè)定三次，計(jì)算檢出濃度和回收率，具體數(shù)據(jù)匯總于表4。在分析檢測(cè)的20份尿液樣品中，有18份檢測(cè)到一定含量的1-OHP，濃度范圍為0.02～0.61 μg/L。實(shí)際尿液樣品及加標(biāo)尿液樣品的色譜圖如圖4所示。已有研究[18]對(duì)某地區(qū)330份人尿樣進(jìn)行檢測(cè)，得到的1-OHP的質(zhì)量濃度范圍為0.025～4.6 μg/L，本方法所測(cè)得的尿樣中1-OHP的濃度與此結(jié)果相符。實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率在88.5%～112.4%之間，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。以上結(jié)果也證實(shí)了本研究所建立的方法具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 實(shí)際尿液樣品(a)和實(shí)際尿液中加標(biāo)濃度為0.2 μg/L的色譜圖(b)Fig.4 Chromatogram of urine sample(a) and the urine sample spiked at 0.2 μg/L of 1-OHP(b)

表4 尿樣中1-OHP的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究將口罩中的熔噴布作為固相萃取吸附劑，結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)器，建立了一種快速測(cè)定尿液中1-OHP的新方法。該方法操作簡(jiǎn)單，無需使用大量的有機(jī)試劑，符合綠色環(huán)保的科學(xué)理念，整個(gè)預(yù)處理過程在10 min內(nèi)即可完成。實(shí)驗(yàn)所用的萃取材料熔噴布價(jià)格低廉、易獲取且性質(zhì)穩(wěn)定，將其應(yīng)用于尿液中1-OHP的分離與富集，效果良好。此外，該方法準(zhǔn)確度和精密度較好、實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高，可以滿足尿液樣品中1-OHP檢測(cè)的需要。