騫秀芳，孫會仙，王 晨，陳 瑩

目前，心腦血管疾病已成為我國居民死亡的主要原因之一，尤其是缺血性心臟病，呈逐年上升趨勢。早期快速開通阻塞的冠狀血管，給予再灌注治療是改善心肌缺血的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；伴隨再通的冠脈血流，心肌會再次受損，稱之心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。銀杏黃酮(ginkgetin, GK)為藥用植物銀杏(Ginkgo biloba L.)葉片的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理效應(yīng)，同時(shí)具備較好的安全性。近年來國內(nèi)外學(xué)者實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GK有助于改善MIRI受損的心肌組織，但其具體環(huán)節(jié)仍不明確。本研究從心肌細(xì)胞凋亡角度入手，通過構(gòu)建MIRI大鼠模型，探討GK對MIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 選取SD大鼠48只，雌雄各半，體重(200±20)g，由北京科宇實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供[許可證號：SCXK(京)2018-0010]。飼于動物房屏蔽環(huán)境，溫度20～23 ℃，相對濕度60%～70%，明暗光照分別為12 h。所有動物相關(guān)操作規(guī)程均經(jīng)武警北京總隊(duì)醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)認(rèn)可。

1.2 藥品與試劑 GK(黃酮含量≥24%)購自徐州峻源銀杏制品有限公司，實(shí)驗(yàn)前以1%二甲基亞砜(DMSO)配成濃度2%、1%的溶液。氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、碘化丙啶(PI)，采用美國Amresco公司產(chǎn)品。半胱氨酸蛋白酶蛋白(caspase)-3、caspase-8活性檢測試劑盒(熒光法)，美國Clontech公司產(chǎn)品。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。凋亡因子Fas、Fas-L及內(nèi)參β-actin等引物均由上海生工生物工程股份公司設(shè)計(jì)并合成。

1.3 儀器設(shè)備 ECG-2360型十二導(dǎo)聯(lián)心電圖機(jī)，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司產(chǎn)品；DHX-500型動物人工呼吸機(jī)，北京金洋萬達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；PT2500E型高速勻漿儀，瑞士Kinematica公司產(chǎn)品；CKX41型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，北京環(huán)中睿馳科技公司產(chǎn)品；FACS101型流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品；SpectraMax iD3型熒光酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司產(chǎn)品；Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國Agilent 公司產(chǎn)品。

1.4 分組與預(yù)處理 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(等體積1% DMSO)、模型組(等體積1% DMSO)、GK高劑量組(200 mg/kg)、GK低劑量組(100 mg/kg)，每組12只。造模術(shù)前7 d開始腹腔給藥，1次/d，造模術(shù)前30 min再給藥1次。

1.5 MIRI模型的建立 采用冠脈左前降支結(jié)扎術(shù)造模。大鼠麻醉后仰位固定于手術(shù)臺上，連接動物呼吸機(jī)并監(jiān)測心電圖；于胸骨左旁第3、4肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟，左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，肺動脈圓錐旁出針，進(jìn)針深度1 mm，將6-0縫線與充氣球囊一同結(jié)扎左冠脈前降支，關(guān)胸；球囊充氣后，心電圖ST段呈明顯弓背抬高作為缺血成功的標(biāo)志，持續(xù)45 min；抽空球囊，再灌注6 h，心電圖抬高的ST段下降50%以上作為再灌注成功的標(biāo)志。假手術(shù)大鼠開胸后只冠脈穿線但不結(jié)扎，其余操作同上。

1.6 NBT染色法測定心肌梗死面積 再灌注結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只大鼠，處死后剪取心臟，洗凈，去除心房及右室，置于-20 ℃冷凍30 min，沿長軸切成厚度2 mm的5片，浸于0.1% NBT溶液中，37 ℃下孵育30 min， 10%甲醛溶液固定24 h，正常心肌呈藍(lán)色，缺血未梗死心肌呈淺紅色，梗死心肌呈灰白色。顯微鏡下成像，導(dǎo)入圖像分析系統(tǒng)，測算梗死區(qū)面積(infarct area, IA)、危險(xiǎn)區(qū)面積(area at risk, AAR)和心室總面積(left ventricle area, LVA)，計(jì)算IA/AAR、IA/LVA以評估心肌梗死情況。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 每組取剩余6只大鼠，處死后剪取心臟，洗凈，于冠脈結(jié)扎線下方取部分心肌組織，剪碎后加PBS緩沖液充分研磨，收集細(xì)胞懸液，1000 r/min低溫離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液洗滌數(shù)次并重懸，獲得較純的心肌細(xì)胞，于光鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整心肌細(xì)胞濃度約為1×10個(gè)/ml；將心肌細(xì)胞重懸于70%預(yù)冷的乙醇中低溫固定過夜，檢測前1000 r/min低溫離心，用PBS緩沖液洗去乙醇，細(xì)胞沉淀用PI低溫避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 熒光法測定心肌細(xì)胞caspase活性 取上述濃度1×10個(gè)/ml的心肌細(xì)胞，重懸于預(yù)冷的裂解緩沖液中，冰浴5 min，10 000 r/min低溫離心5 min，收集上清(胞漿抽提物)，植于96孔板，按試劑盒說明書加入反應(yīng)試劑和熒光底物，陰性對照孔中加入caspase抑制劑，37 ℃下避光孵育1 h，上熒光酶標(biāo)儀(激發(fā)光波長400 nm，發(fā)射光波長505 nm)檢測，以熒光強(qiáng)度(fluorescence units, FU)表示caspase-3、caspase-8活性。

1.9 RT-qPCR法測定心肌組織Fas、Fas-L基因表達(dá) 每組于冠脈結(jié)扎線下方取部分心肌組織，凍存于-80 ℃液氮中；檢測前精密稱重，研磨成粉，經(jīng)Trizol試劑法提取總RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而行RT-qPCR擴(kuò)增(引物片段長度149～163 bp)，獲取樣本基因Ct值后，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行均一化處理，采用公式2計(jì)算樣本基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 對心肌梗死面積的影響 假手術(shù)組大鼠的梗死區(qū)面積為0。與模型組比較，GK高、低劑量組可使IA/AAR和IA/LVA顯著縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表1)。

2.2 對心肌細(xì)胞凋亡率的影響 假手術(shù)組心肌細(xì)胞凋亡率為(0.92±0.80)%，模型組細(xì)胞凋亡率顯著增高為(43.13±7.05)%。與模型組比較，GK高、低劑量組可使細(xì)胞凋亡率明顯降低為(30.12±7.28)%、(31.06±6.39)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01，圖1)。

2.3 對心肌細(xì)胞caspase活性的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞caspase-3和caspase-8活性均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.01)。GK高、低劑量組可使caspase-3和caspase-8活性明顯降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表2)。

2.4 對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組心肌Fas和Fas-L基因表達(dá)均顯著增高，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.01)。GK高、低劑量組可使Fas和Fas-L基因表達(dá)明顯降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(< 0.05，表3)。

3 討 論

缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)是MIRI公認(rèn)有效的治療手段，但具有可控性和依從性較差等缺陷；有學(xué)者認(rèn)為，某些藥物對MIRI的保護(hù)作用與缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)的機(jī)制類似，通過激活機(jī)體自身保護(hù)機(jī)制或促使釋放內(nèi)源性活性物質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受，且藥物干預(yù)具備時(shí)間可控和操作可控的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用GK預(yù)處理方式探討其心肌保護(hù)作用，結(jié)果表明GK高、低劑量(200、100 mg/kg)均能明顯縮小MIRI動物的心肌梗死面積IA/AAR和IA/LVA，提示GK可能是MIRI防治領(lǐng)域的候選藥物之一。

MIRI所涉及的病理生理機(jī)制極為復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙、鈣超載等。近年來“細(xì)胞凋亡學(xué)說”受到重視，有學(xué)者認(rèn)為，心肌細(xì)胞凋亡異常也是MIRI過程中一種重要的病理機(jī)制。生理?xiàng)l件下，細(xì)胞凋亡有助于維持細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間的平衡；MIRI發(fā)生時(shí)，冠脈再灌注不僅給缺血心肌組織提供賴以生存的氧氣和葡萄糖，同時(shí)也為細(xì)胞凋亡提供了能量，此時(shí)凋亡可誘導(dǎo)過度的細(xì)胞死亡，導(dǎo)致不可逆的心肌損害，降低心功能。如何有效減輕再灌注后的細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損的心肌，是MIRI的一個(gè)治療方向。據(jù)報(bào)道，臨床為心肌梗死患者行再灌注治療時(shí)，再灌注時(shí)間越晚，心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯；動物實(shí)驗(yàn)研究亦表明，MIRI大鼠心肌組織凋亡細(xì)胞顯著增多，缺血再通區(qū)域以凋亡細(xì)胞為主；大鼠冠脈缺血6 h后的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，凋亡關(guān)鍵蛋白caspase-3、caspase-8活性在缺血3 h開始升高，6 h達(dá)高峰。本研究發(fā)現(xiàn)，冠脈結(jié)扎45 min再灌注6 h后，MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡率與假手術(shù)大鼠比較顯著增高，證實(shí)細(xì)胞凋亡是MIRI過程的重要參與者；GK高、低劑量組明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，提示GK預(yù)處理通過抑制凋亡反應(yīng)，可減輕MIRI過程中心肌損傷，改善心功能。

由細(xì)胞表面死亡受體Fas介導(dǎo)、半胱氨酸蛋白酶caspase-8直接參與的死亡受體信號途徑是重要的外源性凋亡通路。當(dāng)受到缺血、再灌注等外因誘導(dǎo)時(shí)，存在于心肌細(xì)胞表面的Fas與其死亡配體Fas-L結(jié)合，繼而與胞內(nèi)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)結(jié)合，募集caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，并將細(xì)胞外的促凋亡信號傳入胞內(nèi)，啟動caspases級聯(lián)反應(yīng)，最終激活凋亡執(zhí)行因子caspase-3而引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。既往研究亦已證實(shí)Fas、Fas-L、caspase-8及caspase-3在MIRI進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織Fas、Fas-L基因表達(dá)及caspase-3、caspase-8活性較假手術(shù)組明顯上調(diào)，提示冠脈缺血45 min再灌注6 h后，死亡受體信號途徑被激活并參與了MIRI的病理進(jìn)程；GK高、低劑量組可明顯抑制Fas、Fas-L基因表達(dá)及caspase-3、caspase-8活性，說明GK預(yù)處理通過抑制死亡受體信號途徑的活化，減輕MIRI過程中的心肌細(xì)胞凋亡反應(yīng)。

總之，GK預(yù)處理對MIRI的心肌保護(hù)作用與影響Fas介導(dǎo)的死亡受體信號途徑、抑制心肌細(xì)胞凋亡反應(yīng)等有關(guān)。鑒于凋亡通路的復(fù)雜性和多樣性，其具體作用環(huán)節(jié)尚有待于進(jìn)一步研究。