蛋白激酶C-θ在免疫中的研究進展①

孫明珠 趙龍昊 徐揚（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，七鰓鰻研究中心，大連 116081）

1 PKC-θ簡介

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族是一類依賴磷脂和鈣離子的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。通常，PKC分子中含有4個相對保守區(qū)（C1、C2、C3、C4）和5個可變區(qū)（V1、V2、V3、V4、V5）。根據(jù)PKC分子結(jié)構(gòu)和所需輔助因子的不同可分為：經(jīng)典的PKC（conventional PKC，cPKC），新型PKC（novel PKC，nPKC）和非典型的PKC（atypical PKC，aPKC）［1-2］。有關(guān)PKC家族分子成員及其分類，見表1。

表1 PKC家族分子成員的分類Tab.1 Classification of molecular members of PKC family

PKC-θ是一種不依賴于鈣離子激活的nPKC亞型，最初是在白血病紅細胞中被分離鑒定的［3］。PKC-θ基因定位于人類10號染色體短臂，主要在T細胞、骨骼肌細胞和造血系統(tǒng)中表達。其中，骨骼肌和淋巴器官中表達最高，胸腺和淋巴結(jié)中次之，脾臟中較少，骨髓中不表達［4］。PKC-θ蛋白的C1結(jié)構(gòu)域有2個鋅指狀Cys富集區(qū)，可以與二酰甘油（diacylglycerol，DAG）結(jié)合，C2結(jié)構(gòu)域主要調(diào)節(jié)PKC-θ與膜之間的相互作用，自身假底物序列（pseudosubstrate sequence，PS）通過抑制催化酶結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)其激酶活性，C3結(jié)構(gòu)域為與ATP結(jié)合提供能量，C4結(jié)構(gòu)域具有激酶活性［5］。在PKC-θ中，只有C1b結(jié)構(gòu)域能夠有效結(jié)合佛波酯，有研究解釋了PKC-θ的C1a結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合力較弱的原因，通過共聚焦實驗觀察發(fā)現(xiàn)，PKC-θ中C1a和C1b結(jié)構(gòu)域之間有12個不同的氨基酸殘基對配體的結(jié)合力存在著一定差異，C1a結(jié)構(gòu)域中P168殘基和C1b結(jié)構(gòu)域中K240殘基起關(guān)鍵作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，PKC-θ獨特的V3結(jié)構(gòu)域內(nèi)富含脯氨酸的基序，對于定位并固定其免疫突觸是必不可少的［7］。PKC-θ的活性是通過自身變構(gòu)實現(xiàn)的，不同的磷酸化位點對于調(diào)節(jié)構(gòu)象進而改變激酶活性的作用不同。例如，Y90是淋巴細胞蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte protein tyrosine kinase，LCK）的結(jié)合部位；T219是參與其下游信號通路必需的自磷酸化位點；T538是受磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）調(diào)節(jié)的磷酸肌醇依賴激酶-1（phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）的磷酸化位點，參與調(diào)節(jié)PKC-θ的催化功能；S676/S695是自磷酸化位點，參與調(diào)節(jié)PKC-θ的激酶活性［1］。PKC-θ的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

圖1 PKC-θ的結(jié)構(gòu)示意圖［1］Fig.1 Structure diagram of PKC-θ［1］

2 PKC-θ在TCR信號通路中的作用

TCR是T細胞表面的受體，可識別抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）表面的主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC），兩者形成復(fù)合物后引起下游通路的一系列信號傳遞。結(jié)合磷酸酪氨酸的PKC-θ是TCR誘導(dǎo)的T細胞活化、增殖和輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）分化所必需的，PKC-θ在調(diào)節(jié)TCR近端信號的正反饋調(diào)節(jié)回路中起著重要作用［8］。

2.1PKC-θ對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）在TCR中的激活，對T細胞的活化至關(guān)重要。SUN等［9］發(fā)現(xiàn)，敲除PKC-θ基因小鼠的T細胞在NF-κB活化中表現(xiàn)出功能上的嚴(yán)重缺陷，證實了PKC-θ在NF-κB活化中的選擇性作用。KANG等［10］對比分析人源野生型PKC-θ和失活PKC-θ的質(zhì)譜結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，PKC-θ誘導(dǎo)了PDK-1在Ser-64處的磷酸化，進而促進T細胞活化和TCR誘導(dǎo)的NF-κB激活。

研究發(fā)現(xiàn)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-9）以caspase-3依賴性方式誘導(dǎo)PKC-θ活化和NF-κB活化。此外，在T細胞活化過程中，caspase-8位于caspase-9的上游。因此，TCR會引發(fā)一個涉及caspase-8、caspase-9和caspase-3的caspase級 聯(lián) 反應(yīng)，從而啟動PKC-θ依賴性途徑導(dǎo)致NF-κB活化和PKC-θ依 賴性Bcl10（B-cell lymphoma/leukemia 10）磷酸化，進而改變NF-κB活性［11］。SIEGMUND等［12］通過酵母雙雜交篩選和免疫共沉淀實驗證實，冠蛋白1A（coronin 1A，coro1A）作為一種新型的PKC-θ相互作用蛋白，其N端WD40結(jié)構(gòu)域和PKC-θ的類C2結(jié)構(gòu)域相互作用，以此調(diào)節(jié)對PKC-θ的募集，并激活TCR下游的NF-κB。

激活蛋白1（activating protein-1，AP-1）是存在于細胞內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄激活因子，是由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體。研究發(fā)現(xiàn)，PKC-θ是T細胞中激活A(yù)P-1信號通路的重要分子。BAIER等［13］發(fā)現(xiàn)，有活性的PKC-θ能激活T細胞中AP-1活性，而在缺乏PKC-θ的原代T細胞中，AP-1表達與活性均受到抑制［8］。LI等［14］的研究表明，PKC-θ通過與Ste20相關(guān)的脯氨酸/丙氨酸激酶（Ste20-related proline/alaninerich kinase，SPAK）通路調(diào)節(jié)AP-1的激活，SPAK是PKC-θ的一種特異性底物，PKC-θ在體外通過磷酸化S311這個主要位點與SPAK直接相互作用。當(dāng)過表達突變型SPAK或敲除SPAK時，PKC-θ介導(dǎo)的AP-1激活減少。

活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）受Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，Cn）依賴的信號通路調(diào)節(jié)，對T細胞的活化、增殖和分化至關(guān)重要［15-16］。研究表明，PKC-θ通過刺激Ca2+內(nèi)流增強NFAT激活［17-19］。燃煤的砷可以引起人群的T細胞免疫抑制，研究表明，PKC-θ介導(dǎo)的Ca2+/NFAT信號通路可能參與了燃煤砷中毒人群的T細胞免疫抑制［20］。有關(guān)PKC-θ對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用如圖2所示。

圖2 PKC-θ對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［21］Fig.2 Regulation of transcription factors by PKC-θ［21］

2.2PKC-θ對Th細胞分化方向的調(diào)控作用輔助型T細胞（T helper cell，Th）漂移是一種免疫抑制現(xiàn)象，在TCR介導(dǎo)下，活化的CD4+T細胞分化為輔助型T細胞1（T helper 1 cell，Th1）和Th2兩個不同的亞群。MAO等［21］發(fā)現(xiàn)，嗎啡可以通過PI3K/AKT途徑抑制Th1淋巴細胞的分化并降低Th1/Th2，韓超等［22］進一步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嗎啡濃度在50 ng/ml時，誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th2漂移的分化效能最高，在此過程中，PKC-θ磷酸化水平增高，證實了PKC-θ在嗎啡誘導(dǎo)Th2細胞漂移信號通路中所起的關(guān)鍵作用。

3 PKC-θ在淋巴細胞中的作用

3.1PKC-θ在T細胞中的作用PKC-θ是介導(dǎo)T細胞在體內(nèi)和體外活化所需的關(guān)鍵分子，可參與調(diào)節(jié)T細胞免疫反應(yīng)過程中的多個階段。T細胞的活化是由TCR和共刺激分子啟動的眾多信號通路控制［23］。免疫突觸（immunological synapse，IS）是T細胞與APC表面黏附分子在受體-配體作用下形成的特殊接觸面。在PKC家族中，PKC-θ只有通過T細胞活化時被招募才聚集到免疫突觸上，作用后傳遞T細胞活化的信號［24］。在T細胞和APC相互作用期間，利用數(shù)字三維成像分析確定了IS 3個不同的子區(qū)域：中央超分子活化簇（central supramolecular activation cluster，cSMAC）、外周SMAC（peripheral supramolecular activation cluster，pSMAC）、遠端SMAC（distal supramolecular activation cluster，dSMAC）。WANG等［25］發(fā)現(xiàn)來自TCR/CD28刺激的最初信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)DAG在質(zhì)膜上積累，DAG通過與C1結(jié)構(gòu)域結(jié)合將PKC-θ募集至IS。但DAG-C1結(jié)構(gòu)域相互作用本身似乎不足以將PKC-θ選擇性轉(zhuǎn)運至cSMAC，選擇性PKC-θ募集到cSMAC還需要其他協(xié)同效應(yīng)參與［1］。

另有研究表明，SUMO化修飾（smallubiquitinlike modifier）影響PKC-θ凝聚到免疫突觸的cSMAC上，推測SUMO化修飾對成熟免疫突觸的形成起到關(guān)鍵作用［26］。對原代小鼠和人類T細胞的分析表明，PKC-θ的磺?；瘜τ赥細胞的激活至關(guān)重要。脫磺?；饔貌挥绊慞KC-θ的催化活性，但是抑制了CD28與PKC-θ和纖維蛋白A的締合，并損害了成熟的免疫突觸的組裝以及PKC-θ和CD28的中央共積累。因此，PKC-θ的SUMO化對于形成成熟的IS和T細胞活化至關(guān)重要［27］。

激活誘導(dǎo)的T細胞死亡（activation-induced Tcell death，AICD）是限制激活抗原特異性T細胞擴增和確保清除特異性病原體后免疫反應(yīng)終止的重要過程，包括TCR誘導(dǎo)Fas配體（fas ligand，F(xiàn)asl）的表達及其與相應(yīng)受體Fas的結(jié)合，最終導(dǎo)致T細胞凋亡［27］。研究表明，PKC-θ在T細胞凋亡中起著雙重調(diào)節(jié)作用：一方面通過誘導(dǎo)Fasl表達來促進細胞凋亡，另一方面通過提供一個BAD/p90Rsk依賴的生存信號來起到對細胞的保護作用［28］。

3.2PKC-θ在B細胞中的作用盡管T細胞受體誘導(dǎo)的NF-κB活化關(guān)鍵取決于PKC-θ，但尚未闡明nPKC在B細胞刺激中的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，在原代小鼠脾臟B細胞中PKC-θ的表達很弱。KRAPPMANN等［29］的測定數(shù)據(jù)表明，PKC-θ在原代B細胞NF-κB信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。對原代B細胞和T細胞中PKC同工酶表達的分析表明，PKC-θ水平在T細胞中最高。盡管如此，在原代B細胞中也確實觀察到了PKC-θ表達較弱。

BCR參與啟動細胞內(nèi)鈣的動員，對于激活包括NF-κB和NFAT在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。ANTONY等［30］的研究表明，BCR采用獨特的依賴性分子機制來調(diào)節(jié)NF-κB與NFAT的激活。

YAN等［31］研究發(fā)現(xiàn)，PKC-θ-/-T細胞介導(dǎo)的和B細胞輔助的同種異體移植排斥依賴于CD28分子。B細胞輔助PKC-θ-/-T細胞通過Ⅱ類MHC分子引發(fā)急性同種異體移植排斥反應(yīng)，PKC-θ在T細胞和B細胞中的雙重控制可為防止同種異體移植排斥提供新的治療方向。

4 PKC-θ與免疫相關(guān)疾病的關(guān)系

從免疫疾病的角度來看，PKC-θ表達的微調(diào)及其在免疫突觸中的定位與免疫缺陷病和自身免疫病等關(guān)系密切，PKC-θ已成為人們研究疾病治療的潛在靶點，其活性強弱與疾病發(fā)生發(fā)展程度也逐漸明晰。

4.1PKC-θ與免疫缺陷病的關(guān)系膿毒癥，即由感染可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征，進一步發(fā)展會導(dǎo)致膿毒性休克以及多器官功能不全綜合征。莊 明 峰 等［32］發(fā) 現(xiàn)，可 通 過 調(diào) 控 血 小 板PKC-θ/Muncl8a信號途徑進一步降低血小板α顆粒的釋放，減輕膿毒癥的損傷。Muncl8a是PKC-θ關(guān)鍵的下游信號分子，活化后的PKC-θ可磷酸化Muncl8a的S313來增強其活性，以促進血小板顆粒的釋放［33-34］。

慢性肌肉發(fā)炎，是杜氏肌營養(yǎng)不良癥的關(guān)鍵特征。研究表明，營養(yǎng)不良壞死前的早期階段是基于T細胞干預(yù)的相關(guān)時限；PKC-θ作為效應(yīng)T細胞活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是抑制營養(yǎng)不良性肌肉中T細胞活性的潛在靶標(biāo)；缺乏PKC-θ時，浸潤性T細胞的頻率和數(shù)量下降，肌肉中先天免疫細胞浸潤的數(shù)量和質(zhì)量也隨之變化［35］。在疾病過程的早期用PKC-θ抑制劑可明顯減少炎癥細胞浸潤的大小，并減少肌肉的損傷。

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1%～4%［36］。研究表明，PKC-θ可作為胃腸間質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)之一［37］。PKC-θ過表達與腫瘤高度惡性、復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移頻率高、患者生存率低等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，通過研究PKC-θ介導(dǎo)基因過表達，可為胃癌治療提供理論依據(jù)［38］。

化療誘導(dǎo)淋巴樣細胞凋亡的早期，血影蛋白發(fā)生聚集，而在聚集體的形成中則涉及到PKC-θ或其他凋亡相關(guān)蛋白。MICHALCZYK等［39］通過測試在腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)的凋亡過程中PKC-θ和Fas相關(guān)的死亡域蛋白（FADD）對細胞中血影蛋白聚集的影響，發(fā)現(xiàn)了PKC-θ負調(diào)控TRAIL誘導(dǎo)和FADD介導(dǎo)的細胞凋亡蛋白聚集過程。

PHETSOUPHANH等［40］發(fā)現(xiàn)了PKC-θ在CD4+T細胞和HIV感染中的作用：到達細胞核并再次返回。因此，PKC-θ可能幫助增強HIV-1復(fù)制，而HIV-1誘導(dǎo)了受感染CD4+T細胞中PKC-θ的更高活化，從而形成了一個正向反饋環(huán)。使用抑制劑rottlerin抑制PKC-θ的活性，發(fā)現(xiàn)HIV-1的復(fù)制在CD4+T細胞中減少。因此，對PKC-θ的活性進行特異性抑制，可能會有助于控制HIV-1的復(fù)制［41］。

4.2PKC-θ與自身免疫病的關(guān)系自身免疫性肝炎是由于免疫細胞錯誤地攻擊自己的肝細胞從而導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷。在小鼠中，伴刀豆球蛋白A處理可誘發(fā)急性肝炎，導(dǎo)致CD1d陽性自然殺傷（CD1d-positive natural killer，NK）T細胞迅速激活。這些被激活的NKT細胞會產(chǎn)生大量的細胞因子，如IFN-γ、IL-6和TNF-α，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝損傷。此類細胞因子在PKC-θ-/-小鼠中顯著降低。PKC-θ-/-小鼠外周NKT細胞在胸腺發(fā)育早期存在發(fā)育缺陷，其頻率和數(shù)量明顯減少。由于PKC-θ是激活NKT細胞誘發(fā)肝炎所必需的基本分子，因此PKC-θ是預(yù)防自身免疫性肝炎的潛在藥物靶點［42］。

在炎癥性自身免疫性疾病中，PKC-θ消融對T細胞功能的體內(nèi)影響尚未得到徹底檢查。TAN等［43］使用PKC-θ缺陷小鼠來研究PKC-θ在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（一種由T細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病模型）發(fā)展中的潛在參與。免疫的PKC-θ-/-小鼠的脾T淋巴細胞的離體刺激顯示，盡管IL-2水平相當(dāng)，但Th1細胞因子IFN-γ以及T細胞效應(yīng)細胞因子IL-17的產(chǎn)量顯著降低。此外，在疾病過程中，與野生型小鼠相比，PKC-θ-/-小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的IL-17表達顯著降低。以上結(jié)果強調(diào)了PKC-θ在調(diào)節(jié)自身免疫性疾病的發(fā)展中所必需的多種T細胞功能的重要性。

在干燥綜合征中，健康對照組小鼠的腺泡上皮細胞含有兩種傳統(tǒng)的PKC亞型α和β，腺泡和導(dǎo)管上皮細胞也含有非典型的PKC同工型λ，找不到PKC亞型γ、δ、ε和θ。炎癥小鼠含有相同的常規(guī)和非典型PKC亞型。結(jié)果表明，常規(guī)和非典型的PKC同工型都參與唾液上皮細胞生物學(xué)變化，并且表達中存在與小鼠品系相關(guān)和疾病狀態(tài)相關(guān)的變化，且在干燥癥群體中未發(fā)現(xiàn)干燥綜合征中缺乏的α和β亞型［44］。

T細胞受體（TCR）依賴性調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）活性控制效應(yīng)T細胞（Teff）的功能，并被炎癥細胞因子TNF-α抑制。完全的Teff激活需要PKC-θ募集到IS。此外，PKC-θ阻斷增強了Treg功能，表明PKC-θ抑制了Treg介導(dǎo)的抑制作用。抑制PKC-θ可保護Treg免受TNF-α的滅活，恢復(fù)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者缺陷Treg的活性，并增強小鼠免受炎癥結(jié)腸炎的保護［45］。

在TCR信號傳導(dǎo)過程中，TCR信號通過誘導(dǎo)GLK與上游適配器的直接相互作用激活了GLK。GLK缺陷的小鼠免疫反應(yīng)受損，對實驗性自身免疫性腦脊髓炎有抵抗力。與此相一致的是，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的T細胞中GLK表達明顯增強，PKC-θ活化GLK在T細胞中的過表達發(fā)生頻率與疾病的嚴(yán)重程度直接相關(guān)［46］。

5 PKC-θ與免疫抑制劑

PKC-θ控制T細 胞 的基本過 程 整合了TCR和CD28信號，激活NF-κB、AP-1和NFAT等轉(zhuǎn)錄因子，這對T細胞的激活和分化至關(guān)重要。PKC-θ在體內(nèi)調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因此選擇性PKC-θ抑制劑被認為在治療自身免疫和預(yù)防同種異體移植排斥方面具有潛在的臨床應(yīng)用［47］。

免疫抑制劑是一類具有抑制機體免疫功能的生物制劑，可應(yīng)用于控制器官移植排斥反應(yīng)和治療自身免疫性疾病方面。目前PKC-θ抑制劑主要來源于人工合成和天然產(chǎn)物。人工合成的PKC-θ抑制劑有很多種，如AS2521780（5-腈基嘧啶類化合物）、2，4-二氨基-5-氟嘧啶衍生物、二氫喹唑啉類化合物、三環(huán)吡唑并吡啶類化合物等［48-51］。最新發(fā)現(xiàn)的2，6-二氨基-3-氨基甲酰基-5-氰基吡嗪衍生物2表現(xiàn)出中等的PKC-θ抑制活性。優(yōu)化確定的2，4-二氨基-5-氰基嘧啶衍生物16c表現(xiàn)出有效的PKC-θ抑制活性，并且對其他PKC同工酶表現(xiàn)出良好的選擇性。在體內(nèi)大鼠異位心臟移植模型中，其衍生物16c延長了移植物的存活［52］。此類抑制劑大多具有較好的選擇性，抑制PKC-θ激酶活性比其他PKC亞型高出幾十倍到幾百倍，在安全性、溶解性、滲透性、穩(wěn)定性、有效性上占據(jù)不同優(yōu)勢，在提高移植心臟存活率、結(jié)腸炎治療、抵抗移植物抗宿主反應(yīng)等方面體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。天然產(chǎn)物來源的PKC-θ抑制劑也有很多種，如4-羥基-3-甲氧基肉桂醛、單紫杉烯、C21甾體化合物等［53-55］。此類抑制劑主要抑制PKC磷酸化以及下游NFAT、NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路的激活，對T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有較好的抑制作用。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，PKC-θ可在TCR等信號通路中發(fā)揮作用，與免疫疾病關(guān)系密切。因此，研制與PKC-θ相關(guān)的免疫抑制劑來控制器官移植排斥反應(yīng)和治療自身免疫病，已成為當(dāng)前治療免疫疾病的主要控制方法和有效手段。PKC-θ在TCR通路及淋巴細胞中的作用機制仍有很多疑問，尚需深入研究PKC-θ的調(diào)控機制，探明PKC-θ在不同免疫疾病中的作用。這對于研究免疫疾病的防治，具有重要和深遠的意義。參考文獻：

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