基于擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)非定向篩查食品中的植物成分

郭穎慧，鄭世超，任易婕，程祥龍，霍勝楠*

1(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南，250101)2(山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南，250101)

植物與人類有特別密切的關(guān)系，尤其是具有重要經(jīng)濟(jì)、文化、科學(xué)價(jià)值的植物，如優(yōu)質(zhì)作物食品、地方特色植物食品、藥食同源食品等，常有很高的食用價(jià)值。然而，由于檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的局限性，人們常難以嚴(yán)格區(qū)分地方特色植物食品、高價(jià)值植物性食品，甚至出現(xiàn)在不知情的情況下誤食致敏性植物成分而對(duì)身體造成不同程度的損害，從而面臨著植物摻雜、摻假的高通量檢測(cè)評(píng)估、監(jiān)管執(zhí)法帶來嚴(yán)重的問題。

隨著人類基因組測(cè)序工作的完成和人類基因組草圖的公布，生物信息學(xué)的研究走向了一個(gè)高潮[1-2]。2003年，加拿大分類學(xué)家HEBERT首次提出DNA條形碼概念，是生物體一段公認(rèn)的能夠代表該物種的標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段[3-4]?；贒NA 條形碼技術(shù)，根據(jù)樣品類型選擇基因條形碼引物，擴(kuò)增基因條碼序列并進(jìn)行測(cè)序分析，通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定目標(biāo)物種，成為物種鑒定的有效方法[5-7]。例如，HAMBCK等[8]采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)波羅的海海岸周邊的蜘蛛攝食進(jìn)行了篩查，白文明等[9]基于DNA條形碼技術(shù)鑒別有毒鵝膏菌屬物種。目前，國(guó)際上比較權(quán)威的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)為GenBank[10]、EMBL[11]以及DDBJ[12]。葉綠體基因組中的RbcL[13-15]基因是植物源性分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的分子指標(biāo)之一。高等植物RbcL基因在結(jié)構(gòu)上和原核生物基因相似，由5′非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3′非編區(qū)3部分組成。5′非編碼區(qū)具有可以和葉綠體16S rRNA 3′端附近互補(bǔ)的S-D序到，3′非編碼區(qū)具反向重復(fù)序列，能形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)[16]。目前，RbcL基因在很多植物鑒定及其多樣性的研究中獲得了較好的結(jié)果。姚丹丹等[17]利用RbcL基因序列分析馬尾藻屬遺傳進(jìn)化關(guān)系，F(xiàn)AWLEY等[18]通過RbcL基因序列分析，揭示了藻類的廣泛多樣性，陳玉花等[19]建立了蜀葵花HPLC指紋圖譜及RbcL序列DNA條形碼分子鑒定方法，林曉霞等[20]基于RbcL序列對(duì)石斛屬植物親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。

為進(jìn)一步解決食品中基于擴(kuò)增子測(cè)序的植物摻假非定向篩查問題，本研究基于植物RbcL基因通用引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)和測(cè)序技術(shù)，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，開發(fā)了食品中基于擴(kuò)增子測(cè)序的27種植物摻假非定向篩查方法。

1 材料與方法

1.1 植物RbcL基因通用引物序列

由于二代測(cè)序平臺(tái)測(cè)序長(zhǎng)度的限制，以及考慮大部分食品為深加工產(chǎn)品，導(dǎo)致基因組發(fā)生一定程度的降解，小片段條形碼更加適用。因此本研究采用430 bp 左右的RbcL[21]片段作為條形碼，引物序列如下：

5′端引物：5′-AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3′

3′端引物：5′-TCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3′

1.2 試劑配制

1.2.1 PBS緩沖液

800 mL水中加入8.0 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，2.98 g磷酸氫二鈉和0.22 g磷酸二氫鈉，充分溶解后用鹽酸調(diào)pH至7.4，加水定容至1 000 mL，在103.4 kPa，121 ℃條件下，滅菌15 min后使用。

1.2.2 裂解緩沖液Ⅰ

500 mL水中加人117.0 g氯化鈉、20 g十六烷基三甲基溴化銨，充分溶解后，加入200 mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，100 mL乙二胺四乙酸二鈉溶液，加水定容至1 000 mL，在103.4 kPa，121 ℃條件下，滅菌15 min后使用。

1.2.3 裂解緩沖液Ⅱ

800 mL水中加入50 g十二烷基肌氨酸鈉，充分溶解后，加水定容至1 000 mL，在103.4 kPa、121 ℃條件下，滅菌15 min后使用。

1.2.4 3 mol/L乙酸鉀溶液(pH 5.2)

60 mL水中加入29.4 g乙酸鉀，充分溶解，用冰乙酸調(diào)pH至5.2，加水定容至100 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo公司；ProFlex PCR儀，美國(guó)ABI公司；5424R小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；DYCP-31A電泳儀，北京六一儀器廠；EC3Darkroom凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Spring Scientific公司。

1.4 樣品制備及基因組DNA提取

1.4.1 獨(dú)立樣品的制備及DNA提取

稱取0.5 g待測(cè)樣品，充分研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中。加入1.0 mL裂解緩沖液I和0.4 mL裂解緩沖液Ⅱ，充分混勻，65 ℃溫浴40 min，20 ℃、12 000×g離心15 min，吸取上清液到另一新的離心管中。加入等體積平衡酚-氯仿溶液，輕輕混勻，20 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清液到另一新的離心管中。加入等體積氯仿，輕緩混勻，20 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清液到另一新的離心管中。加入0.6倍體積異丙醇、0.1倍體積的乙酸鉀溶液，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置2 h以上，20 000×g離心10 min，棄上清液。加入0.5 mL 1.0 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，顛倒混合。12 000×g離心10 min，棄上清液。干燥DNA沉淀。加100 μL水或TE緩沖液溶解DNA。DNA的濃度和質(zhì)量采用紫外分光光度法測(cè)定。

1.4.2 混合樣品的制備及DNA提取

將1.4.1提取的DNA選擇4～6個(gè)物種，將其按照等比例濃度進(jìn)行混合形成混合樣本A1～A4，具體成分見表1。

表1 混合植物源性樣本成分

1.5 PCR擴(kuò)增與電泳

反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中10×PCR緩沖液5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 μmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶(2.5U)0.2 μL，DNA模板(10～100 ng/μL)2 μL，用滅菌去離子水補(bǔ)足至總體積25 μL?？墒褂孟嗤Ч纳唐坊疍NA聚合酶預(yù)混液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)參數(shù)：95 ℃(5 min)→95 ℃(30 s)→56 ℃(30 s)→72 ℃(30 s)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4℃保存。

電泳采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。

1.6 測(cè)序及分析

單一物種樣品檢測(cè)時(shí)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger法DNA測(cè)序?；旌衔锓N樣品檢測(cè)時(shí)，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序分析。本研究測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序平臺(tái)完成。

采用Cutadapt(v1.18)、PRINSEQ(0.20.4)、Usearch(11.0.667)軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理；采用Usearch(11.0.667)、gplots(3.0.1.1)、RDPclassifier(2.12)、ETE3(3.1.1)軟件對(duì)所有序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物通用性、特異性驗(yàn)證

以市售紅小豆、大豆、綠豆、馬鈴薯、桃核、芝麻等27種蔬果作物的基因組DNA和10種動(dòng)物基因組DNA為模板，利用RbcL通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，驗(yàn)證引物的通用適用性與植物特異性。

M-Marker(DL 2000)；1～27-以紅小豆、大豆、綠豆、紅薯、馬鈴薯、木薯、薏米、小麥、玉米、小米、水稻、杏、腰果、榛子、芝麻、巴旦木、核桃、桃、香蕉、梨、小番茄、南瓜、胡蘿卜、蘋果、花生、開心果、蕓豆基因組為模板的電泳結(jié)果；28～37-以豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、馬、驢、貓、狗基因組為模板的電泳結(jié)果；38-陰性對(duì)照

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以27種植物基因組DNA為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可獲得430 bp左右大小的條帶，而以10種動(dòng)物基因組DNA為模板，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均未擴(kuò)增出目標(biāo)片段。通用引物對(duì)該27種植物成分檢測(cè)特異性、通用性較好。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Sanger法DNA測(cè)序后，將得到的堿基序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)(圖2)，由圖2可見，經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)涉及的引物擴(kuò)增，27種不同物種的基因序列存在不同，可以利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)序列比對(duì)，綜合考慮Score值、Coverage值、Evalue值，相似度與Genbank序列號(hào)見表2，相似度均>99%。通常要求同種植物序列的相似度≥99%[22]。因此，植物通用引物RbcL可以有效地將實(shí)驗(yàn)所涉及的27種不同物種的植物區(qū)分開來。

圖2 27種植物測(cè)序堿基序列比對(duì)

表2 PCR產(chǎn)物測(cè)序NCBI比對(duì)結(jié)果

2.2 檢測(cè)方法靈敏度驗(yàn)證

10倍系列梯度稀釋目標(biāo)植物源性成分基因組DNA，PCR反應(yīng)體系內(nèi)分別加入100、10、1、0.1 ng/μL 基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖3為玉米基因組DNA 10倍系列梯度稀釋PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)圖。

1-100 ng/μL基因組DNA；2-10 ng/μL基因組DNA；3-1 ng/μL基因組DNA；4-0.1 ng/μL基因組DNA；M-Marker(DL 500)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著模板DNA濃度的遞減，PCR擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)梯度變?nèi)踮厔?shì)。當(dāng)基因組模板DNA質(zhì)量濃度為0.1 ng/μL時(shí)，擴(kuò)增條帶良好?；厥针娪緱l帶進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果見表3。當(dāng)基因組模板DNA質(zhì)量濃度為0.1 ng/μL時(shí)，回收失敗，因此該方法的檢測(cè)靈敏度為1 ng/μL。

表3 玉米基因組梯度稀釋PCR產(chǎn)物測(cè)序NCBI比對(duì)結(jié)果

2.3 混合植物源性成分樣本分析

2.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

4個(gè)樣本提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序，對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)量和測(cè)序質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)，A1、A2、A32、A4樣本的數(shù)據(jù)產(chǎn)出的有效序列條數(shù)分別為69 693、68 267、73 099、97 713(表4)。

表4 測(cè)序數(shù)據(jù)信息

2.3.2 OTU聚類分析及物種注釋

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系，屬，種、分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。通過聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多OTU。通常對(duì)97%相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析[23]。對(duì)4個(gè)樣本進(jìn)行OTU聚類分析，共產(chǎn)生13個(gè)OTU，4個(gè)樣本OTU中序列數(shù)統(tǒng)計(jì)以及OTU對(duì)應(yīng)的物種注釋信息見表5，表中僅展示了豐度前5的OTU。

表5 樣本OTU中序列數(shù)統(tǒng)計(jì)及物種注釋

為得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，利用RDPclassifier進(jìn)行物種分類注釋。根據(jù)每個(gè)樣本的分類學(xué)比對(duì)結(jié)果，選出優(yōu)勢(shì)物種的分類，從整個(gè)分類系統(tǒng)上了解測(cè)序的樣本中優(yōu)勢(shì)物種和豐度差異。使用python的ete3 package繪制每個(gè)樣本分類系統(tǒng)組成樹狀圖。4個(gè)樣本在不同分類水平下(域，門，綱，目，科，屬，種)的物種種類數(shù)目統(tǒng)計(jì)如圖4所示，種水平下物種類別與樣本信息基本一致。

a-A1分類系統(tǒng)組成樹；b-A2分類系統(tǒng)組成樹；c-A3分類系統(tǒng)組成樹；d-A4分類系統(tǒng)組成樹

3 結(jié)論

高通量測(cè)序使核酸測(cè)序成本大幅度下降，從而推動(dòng)了生命科學(xué)各學(xué)科的發(fā)展[23]。檢測(cè)植物摻假問題的方法中，分子生物學(xué)方法是較為重要的手段，包括酶聯(lián)免疫技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[24]等。酶聯(lián)免疫技術(shù)具有檢測(cè)速度快、費(fèi)用低廉、儀器簡(jiǎn)單易攜等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但只是檢測(cè)的輔助手段，特異性和靈敏性有待提高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)、減少了產(chǎn)物的污染，同時(shí)也存在無法高通量篩查樣本的問題，面對(duì)未知成分樣本，檢測(cè)過程復(fù)雜。本研究基于擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè)手段，發(fā)展針對(duì)食品中常見27種植物源性成分的高通量篩查技術(shù)，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)和大量實(shí)際樣品驗(yàn)證，利用一代測(cè)序分析技術(shù)、二代測(cè)序分析技術(shù)對(duì)單一物種食品、混合物種食品中常見植物源性進(jìn)行高通量、非定向篩查，從而解決植物源性食品摻假快速檢測(cè)的問題。然而，本實(shí)驗(yàn)之外的其他物種的RbcL基因序列在該引物的擴(kuò)增區(qū)域有無完全相同的現(xiàn)象，是否會(huì)導(dǎo)致難以區(qū)分某兩種或幾種物種還有待驗(yàn)證，同時(shí)為了規(guī)范植物食品樣本信息，有效抓取海量數(shù)據(jù)，需要不斷完善參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)量和完整性，為宏基因組技術(shù)在植物源性成分食品的摻假非定向篩查研究中廣泛應(yīng)用提供更加堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。