蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育性遺傳機(jī)制及其利用研究進(jìn)展

柳李旺,李冰霜,董俊輝,張曉莉,王燕,徐良

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

蘿卜(RaphanussativusL.)是十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物,營養(yǎng)價(jià)值豐富,食療價(jià)值高,是人們喜愛的重要根菜類蔬菜作物。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)在植物界普遍存在,是由于線粒體功能障礙而阻止功能性花粉產(chǎn)生的一種母系遺傳現(xiàn)象,且通常與線粒體基因組的重排有關(guān)[1-2]。由于重排和非同源末端連接(NHEJ)活動導(dǎo)致形成新的開放閱讀框基因(orf,不育基因),這些基因通常與已知的線粒體基因形成嵌合結(jié)構(gòu),并編碼具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[3-4]。這種新的嵌合ORF的積累通常導(dǎo)致CMS,使花粉粒發(fā)育異常[1,5]。核編碼的育性恢復(fù)基因(Rf)所編碼的蛋白可以靶向線粒體并與CMS不育基因相互作用,通過基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等分子水平的不同機(jī)制來抑制CMS不育基因的表達(dá),以補(bǔ)償線粒體功能障礙來恢復(fù)育性[6-7]。CMS在植物界廣泛存在,目前已在水稻、玉米和高粱等200余種高等植物中觀察到CMS現(xiàn)象[3,8]。

蘿卜作為異花授粉植物,雜種優(yōu)勢顯著,CMS制種可以有效提高種子遺傳純度,有利于蘿卜一代雜交種子的商業(yè)化生產(chǎn)[9]。因此,CMS在作物遺傳育種與F1雜種優(yōu)勢利用中具有重要實(shí)踐價(jià)值,對CMS/Rf系統(tǒng)深入研究也有助于揭示細(xì)胞核-質(zhì)互作這一生命現(xiàn)象。

1 蘿卜雄性不育的類型與起源分布

目前12個(gè)蘿卜線粒體基因組(mtDNA)已經(jīng)測序,包括4個(gè)不育胞質(zhì):MS-gensuke(NCBI 登錄號:AB694744.1,258 426 bp)[10]、Dongbu(KC193578.1,239 186 bp)[11]、YB-A(MN056360,239 195 bp)[12]和Brassicanapus(Ogura,258 473 bp)[13];8個(gè)可育胞質(zhì):Uchiki-gensuke(AB694743.1,244 036 bp)[10]、Uchiki-gensuke OS40-type(AP012991.1,259 201 bp)[14]、Black radish(AP012990.1,239 208 bp)[14]、Aonaga(AP013077.1,239 717 bp)[14]、WK10039(KJ716484.1)[15]、YB-B(MN056359,239 725 bp)[12]、Chuanxinhong(JQ083668.1,239 723 bp)[16]、RS41(258 463 bp)[17]。蘿卜CMS不育胞質(zhì)線粒體結(jié)構(gòu)與正常胞質(zhì)不同。不育胞質(zhì)mtDNA發(fā)生重排,形成新的嵌合蛋白或干擾某些相關(guān)基因的正常表達(dá),影響花粉發(fā)育,從而導(dǎo)致敗育[8,18]。目前研究報(bào)道的蘿卜CMS不育胞質(zhì)主要有Ogura、Kos、NWB和DCGMS等類型。

1.1 Ogura CMS

Ogura CMS是由日本學(xué)者Ogura于1968年在日本鹿兒島野生蘿卜中首先發(fā)現(xiàn)的不育胞質(zhì)類型,因其敗育徹底、育性易恢復(fù),是至今分子機(jī)制研究中最充分和育種實(shí)際應(yīng)用最廣泛的胞質(zhì)類型,現(xiàn)已通過屬間雜交和體細(xì)胞融合等技術(shù)轉(zhuǎn)育到其他十字花科作物中。Ogura CMS主要表現(xiàn)為無可見花粉粒、花蕾瘦小、花藥未發(fā)育完全或皺縮[19]。轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)Ogura不育株中orf138和orf158共轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生1個(gè)1.4 kb的轉(zhuǎn)錄本,而可育株中只檢測到orf158轉(zhuǎn)錄本,表明orf138是引起不育的重要因子[20]。orf138編碼一個(gè)19×103蛋白,并在線粒體膜上積累[21]。一旦orf138mRNA翻譯被阻止,ORF138蛋白累積減少,可恢復(fù)Ogura CMS育性[22]。

orf138分布在40%以上的日本野生蘿卜中[23]。野生蘿卜和栽培種orf138的序列分析顯示,該基因編碼區(qū)存在6個(gè)SNP和1個(gè)InDel。利用7種核苷酸變異的組合模式,orf138被分為9種單倍型(A—I型)。根據(jù)不同orf138單倍型以及抑制orf138表達(dá)的核育性恢復(fù)基因(Rf基因)在野生和栽培蘿卜中的分布,發(fā)現(xiàn)orf138單倍型衍生自B型或C型,起源于日本野生蘿卜[24]。H型是中國臺灣省蘿卜品種所特有的。最近發(fā)現(xiàn)日本蘿卜品種表現(xiàn)出的雄性不育大多數(shù)為A型orf138,少數(shù)品種為H型orf138[25],說明H型orf138CMS已用于中國臺灣省和日本培育的F1品種[26],因此對生長在中國臺灣省和亞洲大陸的東亞野生蘿卜胞質(zhì)進(jìn)行鑒定是確定Ogura CMS類型起源的必要條件。從目前已發(fā)現(xiàn)的不育材料來看,能明確導(dǎo)致雄性不育的有A、B、D、F、H型,其他類型還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,B型orf138也在歐洲野生種自然種群中被發(fā)現(xiàn),但并沒有誘發(fā)雄性不育[27],表明至少有1個(gè)B型的Rf基因存在于歐洲自然種群中。

1.2 Kos CMS

Kos CMS是在日本蘿卜‘Kosena’品種中發(fā)現(xiàn)的新型胞質(zhì),不育花朵完全無花粉囊,不能散粉。通過鑒定‘Kosena’orf138序列,發(fā)現(xiàn)有39個(gè)核苷酸缺失,并將‘Kosena’開放閱讀框確定為orf125,編碼17×103的蛋白;與orf138相比,編碼區(qū)第95和99位核苷酸發(fā)生替換并存在39 bp缺失[28]。

1.3 NWB CMS

NWB CMS是在韓國蘿卜資源中發(fā)現(xiàn)的另一種新的胞質(zhì)不育類型[29]。與Ogura型不同,NWB型不育系能產(chǎn)生更多的淡黃色花藥和一些不能存活的花粉粒;敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期,表現(xiàn)為絨氈層輕度液泡化,藥室內(nèi)仍有未染色的花粉?？諝30]。使用orf138基因特異引物在NWB CMS中未能成功擴(kuò)增,表明NWB CMS并不是由orf138導(dǎo)致的。通過對32個(gè)線粒體基因RFLP分析發(fā)現(xiàn),利用atp6基因3′區(qū)和nad3基因5′區(qū)可產(chǎn)生2 kb特異DNA片段,并開發(fā)了用于檢測NWB CMS的特異分子標(biāo)記[29]。NWB CMS系與58個(gè)育種系(主要為東亞長蘿卜種質(zhì))雜交并沒有發(fā)現(xiàn)任何恢復(fù)系,而與歐洲小蘿卜的16個(gè)自交系雜交后,鑒定出3個(gè)恢復(fù)系[12]。通常在起源中心存在不育系及其恢復(fù)系,而保持系始終存在于遠(yuǎn)離起源中心的種群中[31],故推測NWB CMS系可能起源于歐洲野生蘿卜。對可育和不育蘿卜線粒體基因組測序,發(fā)現(xiàn)NWB CMS可能是由orf463a導(dǎo)致的[12]。盡管在羅馬尼亞野生種R.raphanistrum和德國野生種R.maritimus中都檢測到orf463a,但序列分析表明orf463a可能起源于R.raphanistrum[12]。

1.4 DCGMS CMS

DCGMS(Dongbu cytoplasmic and genic male sterility)是從烏茲別克斯坦收集的材料中發(fā)現(xiàn)的一種不同于上述3種類型的蘿卜不育胞質(zhì),花藥內(nèi)有少量聚集花粉粒[32]。熒光素二乙酸酯(FDA)染色和掃描電鏡顯示,DCGMS CMS蘿卜花粉粒變形嚴(yán)重,不能存活;細(xì)胞學(xué)觀察表明其敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期,藥室內(nèi)部有未被染色的花粉粒。對可育、Ogura和DCGMS胞質(zhì)3個(gè)完整線粒體基因組序列進(jìn)行比較,在DCGMS mtDNA中發(fā)現(xiàn)1個(gè)1 551 bp獨(dú)特區(qū)域,并在該區(qū)域鑒定出1個(gè)新嵌合基因orf463,由cox1基因128 bp部分序列和1 261 bp未知序列組成[11]。orf463分布在‘Niger’類群黑蘿卜品種和野生蘿卜中。盡管‘Niger’類群orf463的DNA序列與DCGMS相同,但野生蘿卜中orf463序列包含9個(gè)核苷酸替換,其中7個(gè)是非同義的。多重PCR分析表明,所有含orf463的蘿卜都具有DCGMS型和黑蘿卜型線粒體結(jié)構(gòu)[33]。調(diào)查orf463在野生種中的分布將有助于進(jìn)一步了解其起源。此外,DCGMS型主要存在于從東歐引進(jìn)的種質(zhì)中[34]。大多數(shù)韓國培育的品系被鑒定為DCGMS保持系,歐洲蘿卜種質(zhì)可能存在多個(gè)Rf基因[35]。NWB和DCGMS CMS似乎具有相同起源,盡管其不育基因orf463和orf463a序列幾乎相同,但它們線粒體基因組排列方式不同,表明這2種胞質(zhì)可能屬于同分異構(gòu)型[12]。

2 蘿卜CMS不育系細(xì)胞學(xué)特征

蘿卜CMS不育主要表現(xiàn)為花粉敗育。通過花藥發(fā)育過程細(xì)胞學(xué)特征觀察可確定花粉敗育的時(shí)期和方式,并闡明敗育與絨氈層之間的關(guān)系,為不育胞質(zhì)分類提供了依據(jù),也有助于揭示CMS機(jī)制。

2.1 不育系敗育時(shí)期

被子植物雄性不育系花粉敗育發(fā)生時(shí)期多種多樣,雙子葉植物花粉敗育多發(fā)生在四分體時(shí)期或小孢子早期發(fā)育階段,單子葉植物花粉敗育則大部分發(fā)生在達(dá)到或接近雙核期[36-39]。Ogura CMS花藥敗育多發(fā)生在四分體至單核花粉期[19,40-41]。屬于Ogura胞質(zhì)的雄性不育系40MA小孢子敗育始于四分體階段[42]。NWB CMS敗育發(fā)生在單核小孢子時(shí)期[30]。不同類型蘿卜保持材料轉(zhuǎn)育的NWB CMS不育系A(chǔ)2—A4花粉敗育均從單核小孢子時(shí)期開始,只是花粉粒降解程度有差異[43]。DCGMS CMS型花藥特征與NWB CMS相似,其敗育同樣發(fā)生在單核小孢子時(shí)期,藥室內(nèi)有未被染色的花粉粒[32]。此外,發(fā)現(xiàn)不育系475A受阻于孢原細(xì)胞分化期之前[44]?！疅艋\紅’不育系在造孢細(xì)胞時(shí)期就出現(xiàn)敗育跡象[45],而不育系A(chǔ)1在減數(shù)分裂期發(fā)生異常[46]。

2.2 不育系敗育方式

花粉敗育主要受絨氈層與雄蕊微管系統(tǒng)發(fā)育異常、胼胝質(zhì)溶解等影響[36]。蘿卜CMS不育系花粉敗育的主要原因是花藥絨氈層發(fā)育異常。絨氈層細(xì)胞是花粉外壁的前體,能夠?yàn)樾℃咦影l(fā)育提供營養(yǎng)。此外,絨氈層可以通過分泌胼胝質(zhì)酶使處于單核小孢子時(shí)期或四分體時(shí)期并被胼胝質(zhì)包裹的小孢子釋放出來[47]。胼胝質(zhì)酶分泌時(shí)間對花粉正常發(fā)育至關(guān)重要,胼胝質(zhì)壁溶解過早會導(dǎo)致發(fā)育中小孢子敗育,不能釋放花粉粒。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)絨氈層細(xì)胞液泡化并出現(xiàn)徑向伸長、細(xì)胞邊緣逐漸模糊、胞質(zhì)染色較淺、細(xì)胞界限消失等現(xiàn)象;隨后絨氈層細(xì)胞破裂形成細(xì)胞團(tuán)塊,侵入藥室擠壓小孢子,胞質(zhì)進(jìn)一步收縮并開始降解,最后藥室形成空腔或僅剩少量殘留物。由于絨氈層發(fā)育異常,物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到阻礙,花粉發(fā)育所必需的可溶性糖、酶、蛋白質(zhì)、核酸等缺乏,從而導(dǎo)致花粉敗育。蘿卜雄性不育株花器外觀形態(tài)上存在花粉敗育型和雄蕊萎縮型不育花,大部分屬于花粉敗育型[45]。不同雄性不育材料敗育方式不同[37-38,41-46,48-53](表1)。

表1 蘿卜雄性不育系敗育的細(xì)胞學(xué)特征Table 1 Cytological characterization of pollen abortion in different radish cytoplasmic male sterility(CMS)lines

3 蘿卜雄性不育性形成分子機(jī)制

3.1 不育基因的產(chǎn)生

線粒體DNA(mtDNA)序列通過頻繁插入、丟失與重排會引起線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)和組織形式發(fā)生改變,線粒體基因組中的短重復(fù)序列也參與mtDNA重排,產(chǎn)生新的嵌合基因[18,32,54]。蘿卜Ogura CMS植株線粒體基因組全序列分析表明,與正常可育蘿卜相比,該基因組發(fā)生了高度重排,其中1對大重復(fù)和多對短重復(fù)序列導(dǎo)致了基因組重組,并產(chǎn)生了4個(gè)Ogura型線粒體基因組特有區(qū)域,且這些獨(dú)特區(qū)域大部分由蕓薹屬線粒體基因組同源序列組成。由此可見,在蕓薹屬植物進(jìn)化過程中,這些獨(dú)特區(qū)域是通過整合和重組已有的線粒體序列而產(chǎn)生的,重組過程中產(chǎn)生了orf138等新基因[10]。orf138位于atp8的5′區(qū)域,與atp8一起表達(dá)為雙順反子轉(zhuǎn)錄物[20,55]。

與DCGMS胞質(zhì)相關(guān)的主要mtDNA結(jié)構(gòu)是atp6-nad3-rps12,由短重復(fù)序列介導(dǎo)的重組事件引起。參與atp6基因周圍mtDNA重排的短重復(fù)序列簇也作為重復(fù)序列存在于油菜、擬南芥的完整線粒體基因組中[56]。

與可育胞質(zhì)相比,短重復(fù)(<1 kb)介導(dǎo)的同源重組導(dǎo)致NWB線粒體基因組序列共線性片段位置和方向發(fā)生了顯著重排[12]。因此,由mtDNA重排所形成的嵌合基因是蘿卜CMS產(chǎn)生的主要原因,這些重排大多發(fā)生在ATP1(ATPase 1)、ATP6(ATPase 6)、COX1(cytochrome C oxidase subunit 1)和ATP8(ATPase 8)等區(qū)域[55,57-60]。

3.2 不育基因作用機(jī)制

胞質(zhì)雄性不育基因具有相似結(jié)構(gòu),能夠編碼特異蛋白,通?？拷€粒體功能基因并與其共轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響線粒體電子傳遞鏈的正常功能。mtDNA重排可以改變參與呼吸和ATP合成相關(guān)基因表達(dá),干擾線粒體中ATP合成及其生理過程[61]。植物胞質(zhì)雄性不育機(jī)制通常歸納為4種模型:能量缺乏模型、毒蛋白模型、異常程序性細(xì)胞死亡(PCD)模型和逆行調(diào)節(jié)模型[3]。由于胞質(zhì)雄性不育機(jī)制較為復(fù)雜,能量缺失以及PCD兩種模型存在交叉點(diǎn),例如水稻H-CMS和辣椒Peterson CMS的不育基因,導(dǎo)致ATP能量合成下降,活性氧升高[62-64]。

Ogura CMS由線粒體orf138基因控制,該基因由2個(gè)共轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框orf138和orfB(atp8)組成[20]。ORF138蛋白存在于線粒體內(nèi)膜中,易形成寡聚體,其表達(dá)能夠抑制大腸桿菌的生長,因此ORF138可能對花藥絨氈層中的線粒體活性產(chǎn)生一定程度的毒性[55,65]。Duroc[65]對ORF138進(jìn)行截短分析,發(fā)現(xiàn)ORFΔ1-43(親水部分,缺少前43個(gè)氨基酸)對大腸桿菌沒有毒性,而ORFΔ58-138(疏水部分,包含第一個(gè)57個(gè)氨基酸)抑制了大腸桿菌的生長,結(jié)果表明不育基因的毒性與親水和疏水域有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn),截去C端部分序列但保留跨膜螺旋的ORF1-93(缺少后45個(gè)氨基酸)能明顯抑制大腸桿菌生長,而不含跨膜螺旋的ORF45-138(缺少前93個(gè)氨基酸)不能抑制大腸桿菌生長,進(jìn)一步表明ORF138的毒性區(qū)域位于包含跨膜螺旋的N端[66]。辣椒Peterson CMS的不育基因orf456和orf507與cox2共轉(zhuǎn)錄,而orf507會損害CMS線粒體中的細(xì)胞色素c氧化酶活性,ATP酶活性降低,使小孢子發(fā)育ATP供應(yīng)不足,最終導(dǎo)致花粉敗育[64]。COX11是細(xì)胞色素c氧化酶的核編碼組裝因子,與呼吸鏈的能量代謝有關(guān),還能清除細(xì)胞內(nèi)活性氧。通過酵母雙雜交(Y2H)試驗(yàn)篩選了水稻W(wǎng)A CMS不育基因所編碼蛋白WA352相互作用蛋白,證實(shí)COX11與WA352互作。WA352蛋白在花粉母細(xì)胞期(MMC)絨氈層特異積累后與COX11互作,抑制了COX11清除活性氧的功能,使絨氈層活性氧爆發(fā),從而誘導(dǎo)線粒體驅(qū)動的過早絨氈層PCD,導(dǎo)致花粉敗育[67]。水稻HL-CMS的不育基因orfH79可以與線粒體復(fù)合物Ⅲ的亞基P61相互作用并降低其酶活性,導(dǎo)致線粒體中ATP下降從而引起敗育。這些不育基因編碼的跨膜細(xì)胞毒性蛋白可以與線粒體蛋白復(fù)合物相互作用,通過損害花藥組織中的氧呼吸和ATP產(chǎn)生從而導(dǎo)致線粒體功能障礙[68]。atp8編碼一個(gè)用于組裝F1F0-ATP酶的核心亞基[69]。在蘿卜中,orf138和orf125都與atp8共轉(zhuǎn)錄,因此可能具有類似機(jī)制,即orf138會與同源線粒體蛋白復(fù)合物(如atp8)相互作用,使線粒體復(fù)合物中酶活性降低,導(dǎo)致ATP降低,活性氧增加。這種缺陷導(dǎo)致線粒體中的能量產(chǎn)生功能障礙和氧化應(yīng)激,這可能作為導(dǎo)致花粉發(fā)育異常的逆行信號,從而導(dǎo)致敗育(圖1)[3,70]?！甋W18’是由油菜‘Westar’和Kosena CMS蘿卜之間的不對稱細(xì)胞融合產(chǎn)生的新品種。Kazama等[71]利用轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶(TALENs)和線粒體定位信號(mito-TALENs)敲除了Kosena型油菜品種‘SW18’的CMS相關(guān)基因orf125,結(jié)果恢復(fù)了CMS育性,這有力地證明了orf125是Kosena型油菜敗育的原因。采用RACE-PCR檢測DCGMS不育基因orf463的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄起始,發(fā)現(xiàn)沒有已知基因與orf463共轉(zhuǎn)錄,推測orf463擁有獨(dú)立啟動子,轉(zhuǎn)錄起始于起始密碼子上游 219 bp 處[11]。與其他大多數(shù)CMS相關(guān)基因一樣,orf463的預(yù)測編碼蛋白產(chǎn)物包含12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,該蛋白產(chǎn)物可能整合到線粒體膜中,進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育。近期發(fā)現(xiàn)orf463a編碼具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白,并與已知的線粒體基因coxI形成嵌合結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致蘿卜NWB胞質(zhì)雄性不育[12]。

圖1 蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)制(改編自文獻(xiàn)[3])Fig.1 Mechanism of cytoplasmic male sterility in radish(modified from reference[3])

4 蘿卜CMS育性恢復(fù)基因的分子鑒定

來自CMS不育系的育性恢復(fù)基因(Rf)通常是核基因,編碼線粒體定位蛋白,這些蛋白通過抑制CMS缺陷發(fā)揮逆行調(diào)節(jié)作用,使得育性恢復(fù)。目前已對幾種CMS/Rf系統(tǒng)進(jìn)行了深入研究。玉米Rf2基因是首個(gè)克隆的恢復(fù)基因,編碼乙醛脫氫酶[72-73],但Rf2基因?qū)τ衩證MS相關(guān)線粒體基因urf13的表達(dá)沒有明顯影響。矮牽牛中分離克隆的Rf基因是第一個(gè)影響CMS相關(guān)線粒體基因表達(dá)的單顯性基因[74],編碼蛋白含有14個(gè)五肽重復(fù)(pentatricopeptide repeat,PPR)序列結(jié)構(gòu)域,能大幅降低CMS相關(guān)蛋白豐度。

大多數(shù)CMS恢復(fù)基因可能通過阻遏線粒體CMS不育基因轉(zhuǎn)錄物表達(dá),或降低其蛋白豐度來發(fā)揮育性恢復(fù)功能[75]。迄今多數(shù)已確定的Rf基因編碼蛋白均含有PPR結(jié)構(gòu)域[76-77]。PPR基因是高等植物中最大的基因家族之一,多數(shù)PPR蛋白靶向質(zhì)體或線粒體[78]。PPR蛋白在細(xì)胞核中完成轉(zhuǎn)錄、翻譯,通過蛋白上的定位信號可以精確進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞器中,參與細(xì)胞器中RNA代謝活動[79]。PPR蛋白參與RNA代謝主要有2種方式,一種是PPR蛋白直接參與RNA代謝、翻譯和編輯[80-81],在轉(zhuǎn)錄水平上通過阻斷不育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本或在轉(zhuǎn)錄后通過RNA編輯[82]、mRNA剪接[83]、蛋白質(zhì)降解[84]來抑制不育基因的表達(dá);另一種是PPR蛋白雖無法直接參與特定RNA序列調(diào)控,但可通過一些輔助因子組成蛋白復(fù)合體來行使對RNA的功能,如甘藍(lán)型油菜pol CMS中MORF1蛋白與恢復(fù)基因Rfp編碼的PPR蛋白形成蛋白復(fù)合體來編輯不育基因orf224轉(zhuǎn)錄本[85]。

4.1 Ogura CMS育性恢復(fù)基因Rfo

蘿卜胞質(zhì)雄性不育屬于核質(zhì)互作類型,經(jīng)典性狀遺傳分析是基于配子活力相等,由于雌、雄配子活力基因型差異往往會影響某些性狀遺傳分析的準(zhǔn)確性。前期研究認(rèn)為蘿卜CMS育性恢復(fù)至少由2對獨(dú)立的顯性基因控制[86-88]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Ogura CMS育性由線粒體嵌合基因orf138和核育性恢復(fù)基因Rfo共同調(diào)控(表2)[20,89-92]。Rfo基因可恢復(fù)不育株育性,在歐洲蘿卜[93]、日本蘿卜[25,94]及中國蘿卜[87,90-91]品種中均發(fā)現(xiàn)Rfo基因。根據(jù)蘿卜與擬南芥基因組微同線性,對蘿卜Ogura CMS的Rfo基因進(jìn)行圖位克隆,通過遺傳標(biāo)記和物理作圖將Rfo定位于15 kb的DNA片段[95];Rfo基因包含3個(gè)串聯(lián)基因:PPR-A、PPR-B和PPR-C,其中只有PPR-B具有育性恢復(fù)活性,即為恢復(fù)基因。PPR-B編碼P型PPR蛋白ORF687,含有17個(gè)重復(fù)PPR基序[96]。在體內(nèi)ORF687直接或間接作用于orf138mRNA,調(diào)控ORF138 mRNA轉(zhuǎn)錄,阻止orf138翻譯,使ORF138蛋白累積減少而恢復(fù)育性[22],但其確切結(jié)合位點(diǎn)尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn),PPR-B蛋白特異結(jié)合不育基因orf138mRNA,充當(dāng)核糖體阻斷劑以特異性阻止orf138mRNA翻譯延伸,降低ORF138蛋白含量,從而達(dá)到育性恢復(fù)目的[97]。ORF687可直接結(jié)合orf138mRNA 中17核苷酸長的靶序列(GUAAAGUUAGUGUAAUA),來阻斷A型orf138mRNA的翻譯。由于A和H型在第61位SNP(A→C),降低了H型與ORF687結(jié)合親和力,使ORF687對H型orf138的抑制無效[25],因此,ORF687可使A型orf138恢復(fù)育性,而對H型不起作用。

表2 蘿卜中已鑒定的不育基因與恢復(fù)基因Table 2 The identified male sterile genes and fertility restoring genes in radish

此外,在中國蘿卜品種‘2006H’和‘9802H’中發(fā)現(xiàn)2個(gè)與Rfo同源的恢復(fù)基因Rfob和Rfoc,在恢保關(guān)系上與Rfo存在差別[90-91]。Rfob基因與Rfo相比存在2個(gè)SNP,2個(gè)基因的距離為1.6 cM,而Rfoc是由Rfob的5′區(qū)和PPR24的3′區(qū)之間重組形成的嵌合恢復(fù)基因。Rft基因是在日本野生蘿卜Tomioka群體中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新恢復(fù)基因,Rft基因與Rfo相比存在19個(gè)SNP[98]。Rft基因參與orf138RNA加工,使其編碼區(qū)的5′端部分缺失,在RNA水平上抑制了orf138基因的表達(dá)。除了上述Rfob、Rfoc和Rft位點(diǎn)以外,在Rfo位點(diǎn)上還存在很多等位變異,如rfo152/rfo81[34]、L7rfo/D81Rfo[99]、PPR-B-31[100]等。

4.2 Ogura CMS育性恢復(fù)基因Rf3

Rf3是在蘿卜中發(fā)現(xiàn)的與Rfo緊密連鎖的新恢復(fù)基因(表2)[37]。圖位克隆發(fā)現(xiàn)RsRf3定位于1個(gè)4 kb區(qū)域,編碼479個(gè)氨基酸的PPR蛋白,包括35個(gè)氨基酸PPR基序的11個(gè)拷貝。RsRf3與Rfo蛋白有85%相似性。編碼PPR蛋白的雜合等位基因(RsRf3-1/RsRf3-2)能夠恢復(fù)CMS育性。在此基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)了新的相關(guān)等位基因RsRf3-4[101]、RsRf3-5[102]。

4.3 Ogura CMS育性恢復(fù)基因Rfs

orf138根據(jù)編碼區(qū)序列差異被分為9種單倍型(A—I型)。日本CMS品種‘BK’與可育品種‘SK’均為H型orf138、RfoRfo基因型且不含Rft。將‘BK’בSK’(雜交)后代與‘MR’(H型orf138,rforfo)進(jìn)行雜交,發(fā)現(xiàn)后代出現(xiàn)了育性分離,同時(shí)在后代所有可育單株中均鑒定出完整orf138mRNA結(jié)合位點(diǎn);但‘BK’בSK’后代與‘MS-G’(A型orf138,rforfo)進(jìn)行雜交的后代均表現(xiàn)為不育,這表明除Rfo和Rft之外的另一種Rf基因(Rfs)能夠恢復(fù)花粉育性(表2)。與Rfo不同的是,Rfs可在編碼序列開始的第156～159個(gè)核苷酸附近結(jié)合H型orf138mRNA,但不能結(jié)合A型orf138mRNA。因此,需要對Rfs進(jìn)一步鑒定并確定其氨基酸序列,以便在分子水平上揭示Rfs與orf138類型相關(guān)性[25]。

4.4 Kosena CMS育性恢復(fù)基因Rfk1

從蘿卜中分離出Kosena CMS育性的恢復(fù)基因,命名為Rfk1(表2)[92]。利用F2群體對Rfk1位點(diǎn)進(jìn)行AFLP標(biāo)記作圖,其中2個(gè)AFLP-STS標(biāo)記與Rfk1距離分別為0.1 cM和0.2 cM,最終確定Rfk1是包含 43 kb 的DNA片段,該基因也編碼687個(gè)氨基酸。雖然控制Ogura CMS和Kosena CMS的不育基因不同,但都是ORF687蛋白在不改變mRNA水平情況下,直接或間接降低了CMS相關(guān)線粒體基因蛋白(ORF138、ORF125)水平使其育性恢復(fù)。因此,從遺傳學(xué)角度看,Kosena CMS-Rf體系與Ogura CMS-Rf體系是相同的[88]。應(yīng)用基因組原位雜交(GISH)和細(xì)菌人工染色體-熒光原位雜交(BAC-FISH)方法對Rfk1基因的蘿卜染色體區(qū)域進(jìn)行物理定位,最終將Rfk1基因定位于油菜A基因組中9號染色體上[103]。

4.5 DCGMS CMS育性恢復(fù)基因Rfd1

Kim等[35]在不育材料‘MS19’和可育材料‘R121’的雜交群體中,發(fā)現(xiàn)1個(gè)單個(gè)育性恢復(fù)位點(diǎn)Rfd1,能夠恢復(fù)DCGMS CMS育性(表2)。利用RAPD和AFLP技術(shù)對F2群體分離分析,在Rfd1等位基因連鎖側(cè)翼序列間分別鑒定出773和67 bp的InDels,并以此開發(fā)了PCR標(biāo)記。此外,遺傳關(guān)系分析表明Rfd1位點(diǎn)獨(dú)立于Rfo位點(diǎn)?；谔}卜與擬南芥基因組的共線性,開發(fā)了Rfd1基因的分子標(biāo)記,并構(gòu)建了該基因的高分辨率連鎖圖譜,將Rfd1位點(diǎn)定位在擬南芥3號染色體上220 kb區(qū)間內(nèi)[104]。利用BSA和RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了高密度SNP連鎖圖譜,將Rfd1精細(xì)定位于擬南芥3號染色體上83 kb的共線性區(qū)域,該區(qū)域含有25個(gè)基因,但均不包含PPR基序,表明Rfd1基因可能不編碼PPR[105]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)育性恢復(fù)基因不影響orf463mRNA加工,推測是在orf463翻譯過程中發(fā)揮作用[33]。

5 蘿卜雄性不育性的利用

蘿卜是典型的異花授粉作物,雄蕊和雌蕊較小,人工去雄費(fèi)時(shí)費(fèi)力。利用雄性不育系制種不僅能充分利用雜種優(yōu)勢,而且F1雜交種種子純度高、一致性好[106]。利用雄性不育系進(jìn)行優(yōu)良一代雜交種品種選育是蘿卜雜種優(yōu)勢高效利用的主要途徑。

5.1 CMS育性恢復(fù)基因標(biāo)記開發(fā)與利用

常規(guī)育種中選育恢復(fù)系的主要方法是通過雜交和測交來鑒定恢復(fù)基因,但這種方法年限長,工作量大。分子標(biāo)記輔助選擇育種可以在早期對恢復(fù)基因進(jìn)行鑒定,大大縮短育種周期,加速恢復(fù)材料的選育過程、提高育種效率。恢復(fù)基因的標(biāo)記開發(fā)能夠?yàn)榉N質(zhì)創(chuàng)制打下基礎(chǔ)?；謴?fù)基因Rfo在日本野生蘿卜中的分布頻率較低。我們根據(jù)Rs-Rf1和Rs-rf1等位基因間序列差異分析,發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶SspⅠ的識別位點(diǎn)數(shù)量不同,并開發(fā)了功能標(biāo)記以快速區(qū)分個(gè)體Rs-Rf基因型[107]。利用該功能標(biāo)記建立了分子標(biāo)記輔助培育蘿卜優(yōu)良CMS系的技術(shù)體系,促進(jìn)候選保持系的鑒定,加速了優(yōu)良CMS品系和F1雜交種的培育進(jìn)程。

基于KASP基因分型技術(shù)開發(fā)蘿卜Ogura CMS恢復(fù)基因Rfo的SNP標(biāo)記,能夠研究不同蘿卜種質(zhì)資源中恢復(fù)基因分布,并應(yīng)用于保持系材料篩選[108];目前利用該方法轉(zhuǎn)育了6套遺傳穩(wěn)定的蘿卜CMS系及其相應(yīng)保持系。在此基礎(chǔ)上,利用多個(gè)生態(tài)型蘿卜品種進(jìn)一步研究Rfo分布,為雄性不育系的轉(zhuǎn)育提供指導(dǎo)[109];通過KASP基因分型技術(shù)在苗期即可快速鑒定植株育性,縮短了育種周期。選擇隱性純合基因型的單株進(jìn)行雜交、多代回交,即可獲得不育率100%和遺傳穩(wěn)定的雄性不育系及保持系,以便用于優(yōu)勢雜交組合配制[110]。因此,恢復(fù)基因鑒定及標(biāo)記開發(fā)對雄性不育系高效選育具有重要的指導(dǎo)意義。

5.2 蘿卜雄性不育系轉(zhuǎn)育和利用

龔義勤等[111]通過引進(jìn)不育源或應(yīng)用鑒定發(fā)現(xiàn)的不育株,采用測交、父本株自交和連續(xù)回交的方法,進(jìn)行CMS不育系轉(zhuǎn)育和保持系篩選,進(jìn)而利用不育系配制了一代雜種。韓太利等[112]以韓國白蘿卜改良型雄性不育系為材料,轉(zhuǎn)育出耐抽薹型白蘿卜不育系VMS01-96-07、VMS03-1-36和早熟型白蘿卜不育系VMS01-98-16及相應(yīng)保持系;配制的雜交組合生長勢和抗病性提高,表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢。史小強(qiáng)等[113]以雄性不育系金花薹48A為不育源,選用8個(gè)不同遺傳背景的秋冬青蘿卜自交系為轉(zhuǎn)育父本,選育出不育率和不育度均為100%的優(yōu)良蘿卜雄性不育系06-42A及相應(yīng)保持系,同時(shí)所配組合表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢。胡天華等[114-115]分別以秋冬蘿卜雄性不育系浙3A和NS04A為不育源,選育出耐抽薹蘿卜不育系CL09A和心里美蘿卜不育系XM221-131A,這2個(gè)不育系經(jīng)濟(jì)性狀好,不育株率達(dá)100%,不育性穩(wěn)定,開花結(jié)實(shí)性狀優(yōu)良;利用其配制的組合具有生食口感風(fēng)味好、根形優(yōu)、商品性好等特點(diǎn),雜種優(yōu)勢較強(qiáng)。本課題組通過恢復(fù)基因標(biāo)記輔助轉(zhuǎn)育與常規(guī)轉(zhuǎn)育相結(jié)合,培育出一批遺傳穩(wěn)定、綜合性狀優(yōu)良的蘿卜CMS不育系,并廣泛應(yīng)用于特色蘿卜一代雜交品種的培育,例如‘南春白5號’‘南春白8號’‘南春白9號’‘南熱紅3號’等特色品種。

5.3 作為蘿卜近緣種的不育胞質(zhì)源

白菜、甘藍(lán)、油菜等蕓薹屬作物在很長一段時(shí)間內(nèi)沒有理想的不育源,通過屬間雜交、體細(xì)胞雜交、重復(fù)回交和原生質(zhì)體融合等手段,將蘿卜Ogura不育胞質(zhì)成功轉(zhuǎn)到蕓薹屬作物的核背景中,并廣泛應(yīng)用于蕓薹屬作物F1雜交種的培育[116-118]。轉(zhuǎn)育得到的蘿卜Ogura不育胞質(zhì)的蕓薹屬作物雄性不育系,往往存在苗期低溫黃化、雌蕊功能障礙、雄蕊瓣?duì)?、花藥開裂、蜜腺發(fā)育異常和結(jié)實(shí)不良等缺陷[119]。推測可能是由于蕓薹屬細(xì)胞核和蘿卜細(xì)胞質(zhì)基因組之間的不相容性引起的[120-121]。因此,開發(fā)低溫下不黃化、雌性活力正常、種子生產(chǎn)能力強(qiáng)的改良型Ogura CMS不育系,對于基于Ogura CMS的蕓薹屬作物F1雜種優(yōu)勢利用至關(guān)重要。至今已利用Ogura不育胞質(zhì)源選育出了‘中甘628’‘中甘56’‘京甘4號’‘西苑秋豐’‘蘇甘27’‘春秋亭美’等優(yōu)良甘藍(lán)品種[122]:‘秦白4號’‘晉綠3號’‘晉青2號’‘青豐1號’等白菜品種[123-125]以及Ogura CMS青花菜主栽品種‘18-耐寒優(yōu)秀’和‘18-炎秀’[126]。Ren等[127]利用遠(yuǎn)緣雜交及標(biāo)記追蹤技術(shù),首次創(chuàng)制了甘藍(lán)Ogura育性恢復(fù)材料16Q2-11;利用該恢復(fù)材料成功恢復(fù)了抗根腫病種質(zhì)資源的育性,獲得了聚合育性恢復(fù)基因Rfo和根腫病抗性基因CRb2的育種材料。以甘藍(lán)自交系為母本,恢復(fù)育性的抗根腫病材料F8-514和F8-839為父本,成功將不育胞質(zhì)替換為可育胞質(zhì),將根腫病抗性基因CRb2轉(zhuǎn)移到正常胞質(zhì)甘藍(lán)自交系中,獲得重要抗根腫病育種材料?！皟刹椒?育性恢復(fù)和胞質(zhì)替換)”的成功實(shí)踐,改變了甘藍(lán)Ogura不育資源無法利用的現(xiàn)狀,進(jìn)一步豐富了甘藍(lán)種質(zhì)資源的多樣性,對十字花科蔬菜作物的Ogura不育資源的創(chuàng)新和再利用提供了重要借鑒和參考。

6 問題與展望

CMS對于闡明核-質(zhì)互作機(jī)制具有顯著的理論價(jià)值,一直是植物科學(xué)研究的重要領(lǐng)域。蘿卜作為典型的異花授粉植物,雜種優(yōu)勢顯著,CMS利用早已成為蘿卜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。特別是蘿卜Ogura不育胞質(zhì)成功轉(zhuǎn)到油菜、甘藍(lán)、白菜等近緣蕓薹屬作物中,有力推動了蕓薹屬作物雜種優(yōu)勢利用,同時(shí)也顯著促進(jìn)了蘿卜CMS機(jī)制的解析。

蘿卜Ogura CMS研究始于1968年,研究表明,蘿卜CMS緣于mtDNA發(fā)生重組,從而產(chǎn)生新的嵌合基因,嵌合基因編碼的細(xì)胞毒性蛋白會引起敗育。但是,關(guān)于不育蛋白毒性的證據(jù)僅來自原核或真核培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)中不育基因的表達(dá)[128],仍缺乏不育蛋白毒性與植物花藥敗育相關(guān)的直接證據(jù),導(dǎo)致CMS的有毒蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與CMS發(fā)生之間的機(jī)制關(guān)系仍不清楚。對辣椒Peterson CMS、水稻W(wǎng)A CMS和HL CMS的不育基因與線粒體復(fù)合物研究后發(fā)現(xiàn)[64,67-68],不育蛋白可能會影響線粒體膜的完整性,導(dǎo)致質(zhì)子泄漏和ATP不足,從而引起敗育。因此,還需進(jìn)一步研究orf138與線粒體復(fù)合物(如atp8)之間的關(guān)系來解釋蘿卜敗育機(jī)制。另外,單一胞質(zhì)不育源應(yīng)用有可能導(dǎo)致某一病害大面積暴發(fā),故發(fā)現(xiàn)和利用更多新型不育源也是蘿卜CMS研究亟待解決的問題。

許多與CMS相關(guān)的不育基因和一些相應(yīng)的恢復(fù)基因已被鑒定,在解析線粒體基因組重排產(chǎn)生不育基因、花藥絨氈層凋亡、線粒體功能障礙、線粒體ATP合成酶活性及ATP含量降低等與CMS表型相關(guān)的機(jī)制方面已取得一定進(jìn)展。然而,對于大多數(shù)CMS系統(tǒng),不育蛋白的積累和誘導(dǎo)CMS的機(jī)制仍不清楚,不育蛋白和恢復(fù)基因蛋白的互作以及線粒體逆行信號尚未確定;而且一些相關(guān)育性恢復(fù)機(jī)制的闡明是在蘿卜不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)到近緣蕓薹屬作物中進(jìn)行的,在蘿卜中胞質(zhì)不育基因與Rf基因的互作還有待進(jìn)一步深入解析。

不同蘿卜CMS胞質(zhì)的恢復(fù)基因已被鑒定,目前研究最多的是Ogura CMS的Rfo。通過分析不育基因及恢復(fù)基因遺傳模式、結(jié)構(gòu)特征和作用機(jī)制,初步闡明了蘿卜Ogura CMS形成與育性恢復(fù)機(jī)制,即恢復(fù)基因所編碼的PPR-B蛋白特異結(jié)合不育基因orf138的mRNA,充當(dāng)核糖體阻斷劑,特異性地阻止翻譯延伸,降低ORF138蛋白含量,從而恢復(fù)育性;但恢復(fù)基因所編碼PPR-B蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)尚需鑒定。隨著用于程序化RNA識別的人工PPR設(shè)計(jì)的成功[129-130],現(xiàn)在可以考慮針對CMS相關(guān)orf的mRNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行Rf設(shè)計(jì),以研究Rf與orf基因之間的關(guān)系。在水稻中發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞質(zhì)的恢復(fù)基因所編碼的CPPR1蛋白通過下調(diào)OsGLK1(OsGOLDEN-LIKE1)轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)控絨氈層質(zhì)體發(fā)育,從而確立了一種新的水稻花粉發(fā)育調(diào)控機(jī)制,為研究敗育機(jī)制提供了新途徑[131]。CMS中的自發(fā)育性恢復(fù)已在玉米S-CMS、胡蘿卜、大豆和蕓薹屬作物中觀察到,并且在自然界中作為克服線粒體編碼的雄性不育替代方法[132-133]。CMS中自發(fā)育性恢復(fù)通常以線粒體基因組亞化學(xué)計(jì)量遷移(substoichiometric shifting,SSS)為特征,小重復(fù)不對稱DNA交換會影響線粒體基因組SSS[134]。這種重排受核基因影響,包括抑制異位線粒體重排的OSBI(organelle ssDNA binding protein)、RecA3(recombinase A3)和MSH1(MutS HOMOLOG1)。MSH1的破壞不僅會導(dǎo)致線粒體SSS,還會導(dǎo)致煙草、番茄和芥菜出現(xiàn)雄性不育[135-137]。研究發(fā)現(xiàn),MSH通過與芥菜不育基因orf220的SSS來介導(dǎo)育性恢復(fù),這一過程會受到授粉信號調(diào)節(jié)[137]。目前還有很多恢復(fù)基因尚未分離鑒定,影響了恢復(fù)基因相關(guān)育性恢復(fù)機(jī)制的解析以及相應(yīng)CMS不育系的高效應(yīng)用。

新技術(shù)進(jìn)步有助于解決當(dāng)前研究CMS/Rf系統(tǒng)所面臨的問題。隨著高通量測序技術(shù)快速發(fā)展,通過高通量測序確定CMS不育系完整線粒體基因組序列也為尋找新的CMS候選orf提供了一種有效方法。目前,不同蘿卜胞質(zhì)類型的線粒體基因組已經(jīng)測序,通過線粒體基因組對比,可以開發(fā)不同胞質(zhì)類型特異的線粒體DNA分子標(biāo)記。這些特異的標(biāo)記可以用于指導(dǎo)蘿卜胞質(zhì)分類及鑒定、區(qū)分新型胞質(zhì)類型、選育保持系以及恢復(fù)系、鑒定不育系純度、提高育種效率等?；蚓庉嫾夹g(shù)為驗(yàn)證CMS相關(guān)不育的功能和在基因組水平恢復(fù)CMS提供了新策略。最近報(bào)道一種用于植物線粒體基因編輯特別設(shè)計(jì)的質(zhì)粒,利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)線粒體基因編輯[138];也有學(xué)者通過mito-TALEN介導(dǎo)線粒體基因組編輯技術(shù)敲除了BT型CMS水稻orf79和Kosena型CMS油菜orf125,從而使其育性恢復(fù)[71]。利用基因編輯技術(shù)對CMS不育基因與恢復(fù)基因進(jìn)行堿基突變與生物學(xué)功能分析,將有助于全面闡明CMS發(fā)生的分子機(jī)制,從而為蘿卜CMS不育性的高效利用提供重要的理論支撐。