李佳,陶小榮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理學(xué)系/教育部農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/作物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

真菌、病毒、細(xì)菌等病原生物采取多種策略侵染植物影響植物生長發(fā)育,植物則逐漸進(jìn)化出一套復(fù)雜的免疫系統(tǒng)來抵御病原生物的侵染。NLR(nucleotide binding leucine-rich repeat)蛋白是植物免疫系統(tǒng)中的一個(gè)免疫受體大家族,能夠準(zhǔn)確識別病原生物分泌到細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白,激活由效應(yīng)蛋白觸發(fā)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity,ETI)。植物ETI的激活通常伴隨著過敏性反應(yīng)(hypersensitive response,HR),通過誘導(dǎo)侵染位點(diǎn)的細(xì)胞死亡來限制病原生物增殖,同時(shí)引起植物激素水楊酸(salicylic acid,SA)的積累,進(jìn)一步誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)[1-2]。

植物進(jìn)化產(chǎn)生了數(shù)量龐大的NLR免疫受體用于監(jiān)測病原生物的侵染,但是NLR蛋白的數(shù)量在不同植物中存在較大差異?；谏镄畔W(xué)分析,發(fā)現(xiàn)蘋果、水稻、擬南芥中分別含有737、 438、151個(gè) NLR蛋白,陸地植物苔蘚中含有49個(gè),藻類植物中只在少數(shù)類群中出現(xiàn),大部分則沒有NLR[5,8]。1994年,科學(xué)家第1次克隆到植物NLR免疫受體基因,分別是煙草(Nicotianatabacum)的N基因和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的RPS2基因[9-11]。20多年來,科學(xué)家們付出了巨大的努力,迄今已經(jīng)成功克隆了200個(gè)左右的NLR抗病基因,并且被廣泛地應(yīng)用于作物抗病育種[12]。近年來,隨著蛋白質(zhì)晶體學(xué)和低溫冷凍電鏡技術(shù)的高速發(fā)展,植物NLR蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究取得了一系列重要進(jìn)展[13-14],尤其是2019年第1個(gè)植物完整NLR 受體——ZAR1激活前后結(jié)構(gòu)的解析,首次發(fā)現(xiàn)了植物“抗病小體”的存在,為NLR免疫受體激活植物免疫的作用機(jī)制研究提供了全新的思路[15-19]。

1 植物NLR不同結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究

1.1 N端結(jié)構(gòu)域

2011年,Bernoux等[20]解析第1個(gè)植物NLR蛋白L6的TIR結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)。表1列舉了目前為止已報(bào)道三維結(jié)構(gòu)的所有TIR結(jié)構(gòu)域,包括擬南芥RPS4 TIR、RRSI TIR、SNC1 TIR、RPP1 TIR,圓葉葡萄RPV1 TIR、RUN1 TIR以及本氏煙草ROQ1 TIR[21-27]。除了RPP1和ROQ1的TIR是在免疫受體完整蛋白激活狀態(tài)下的構(gòu)象外,其余免疫受體的TIR均是單獨(dú)表達(dá)TIR結(jié)構(gòu)域獲取的晶體結(jié)構(gòu)。如圖1-A所示,所有的TIR都呈現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)特征,即5 個(gè)α螺旋三維環(huán)繞4～5個(gè)平行β折疊片構(gòu)象。TIR結(jié)構(gòu)域具有自我聚集形成二聚體或者多聚體的能力,RPS4和RRS1的TIR結(jié)構(gòu)域還能夠形成異源二聚體,破壞TIR結(jié)構(gòu)域的寡聚會中斷全長免疫受體蛋白激活后的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[20-21,23-24]。此外,TIR結(jié)構(gòu)域還具有NAD+切割活性,這一活性對于免疫受體蛋白激活后誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是必需的。研究發(fā)現(xiàn),TIR結(jié)構(gòu)域自我寡聚缺陷的突變體喪失了NAD酶活性以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力,但是TIR結(jié)構(gòu)域NAD酶活性中心突變體卻不影響其自身寡聚[25,28]。TIR的自我寡聚化會促進(jìn)TIR的NAD酶活性,進(jìn)一步促進(jìn)下游免疫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]。RPS4的TIR結(jié)構(gòu)域能夠直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,而 RRS1的TIR單獨(dú)不能直接引發(fā)細(xì)胞死亡,反而抑制RPS4 TIR結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。RRS1 TIR結(jié)構(gòu)域在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡方面的功能差異可能與其三維結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性有關(guān),RRS1 TIR在4號螺旋區(qū)域(橙色區(qū)域)的短螺旋僅有1個(gè)(其他TIR有3個(gè)),且該螺旋方向與其他TIR的4號螺旋區(qū)域幾乎垂直。在RPP1抗病小體結(jié)構(gòu)中,4號螺旋區(qū)域在NAD酶活性中心的形成中發(fā)揮重要作用,因此,RRS1 TIR自身雖然能夠形成同源二聚體,可能無法形成有效的NAD酶活性中心,所以不能直接引發(fā)細(xì)胞死亡。

表1 文章涉及的植物免疫受體結(jié)構(gòu)Table 1 Structures of plant immune receptors covered in this review

與TIR結(jié)構(gòu)域類似,植物NLR蛋白N端CC結(jié)構(gòu)域也具有較為保守的三維結(jié)構(gòu)特征,除大麥MLA10 CC是由2個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)組成的二體以外,Rx、Sr33以及失活態(tài)/中間態(tài)ZAR1的CC結(jié)構(gòu)域均為具4螺旋束卷曲結(jié)構(gòu)的單體形式[15-16,29-31](圖1-B)。Casey等[30]利用體積排阻色譜耦合多角度光散射技術(shù)發(fā)現(xiàn)MLA10 CC在溶液中表現(xiàn)出單體的性質(zhì),并認(rèn)為MLA10 CC特殊的二體形式可能是由于其特殊的結(jié)晶條件(高鹽和低pH值)導(dǎo)致的。NRG1.1是在TNL下游發(fā)揮作用的輔助NLR,其N端CC結(jié)構(gòu)域與RPW8類似,因此其CC結(jié)構(gòu)域也被歸為CCR。如圖1-B所示,NRG1.1 CC也呈現(xiàn)出與其他類型CC相似的三維結(jié)構(gòu)特征。最新的研究表明,NRG1.1 CC的三維構(gòu)象與真菌膜穿孔HeLo/HELL結(jié)構(gòu)域和哺乳動(dòng)物混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed-linage kinase domain-like,MLKL)N端的4螺旋束結(jié)構(gòu)域類似,且具有相對保守的功能位點(diǎn)[41-42]。與擬南芥失活態(tài)ZAR1的CC結(jié)構(gòu)域相比,激活態(tài)ZAR1 CC結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生了明顯變化,其N末端第1個(gè)螺旋α1單獨(dú)暴露出來[15-16](圖1-B)。單獨(dú)的CC結(jié)構(gòu)域也具有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力,但是目前的研究表明,CC結(jié)構(gòu)域能否表現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的特性似乎跟CC片段的截取長度有關(guān),通過Pfam分析預(yù)測Sr33的CC結(jié)構(gòu)域?yàn)?～134位氨基酸,但功能試驗(yàn)卻顯示1～142位氨基酸是Sr33 CC誘導(dǎo)細(xì)胞死亡表型所必需的[43-44]。圖1-B中解析的Sr33 CC結(jié)構(gòu)域覆蓋了6～120位氨基酸,結(jié)合CC的功能研究和ZAR1 CC激活態(tài)的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象,推測目前解析的Sr33、Rx以及NRG1.1 CC的三維結(jié)構(gòu)可能都處于失活狀態(tài)時(shí)的構(gòu)象。

圖1 植物NLR免疫受體TIR(A)和CC(B)結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)特征Fig.1 Structural features of TIR(A)and CC(B)domain of plant NLR immune receptor

1.2 NB-ARC結(jié)構(gòu)域

NB-ARC結(jié)構(gòu)域?qū)儆谛盘杺鲗?dǎo)腺苷三磷酸ATP酶(signal transduction ATPases with numerous domains,STAND)超家族成員,具有結(jié)合和水解核苷酸的功能,通常被認(rèn)為具有“分子開關(guān)”的作用[45]。NLR免疫受體的激活與否往往伴隨著NB-ARC結(jié)構(gòu)域結(jié)合ADP或者ATP狀態(tài)的切換[46-50]。目前,關(guān)于NB-ARC結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)的報(bào)道并不多,單獨(dú)表達(dá)NB-ARC結(jié)構(gòu)域并獲得結(jié)構(gòu)信息的只有NRC1的NB-ARC結(jié)構(gòu)域[40],在最近報(bào)道的多個(gè)植物抗病小體中揭示了更多關(guān)于NB-ARC結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)信息[15-16,26-27]。NRC1是一個(gè)在番茄抗病蛋白Cf-4下游發(fā)揮作用的輔助CNL,NRC1 NB-ARC與失活態(tài)ZAR1 NB-ARC的三維結(jié)構(gòu)特征相似,ADP結(jié)合在由NB、ARC1和ARC2共同形成的空腔位置(圖2),推測NRC1 NB-ARC結(jié)構(gòu)域可能處于失活態(tài)的構(gòu)象。與失活態(tài)ZAR1 NB-ARC相比,中間態(tài)ZAR1 NB-ARC的空間構(gòu)象發(fā)生了明顯變化,NB結(jié)構(gòu)域向外旋轉(zhuǎn)約60°,這種開放的空間構(gòu)象可能有利于ADP的釋放以及ATP的進(jìn)入(圖2)。在激活態(tài)ZAR1 NB-ARC中,ARC2結(jié)構(gòu)域較失活態(tài)和中間態(tài)時(shí)有較大的旋轉(zhuǎn)幅度,此時(shí)處于結(jié)合ATP的狀態(tài)。激活態(tài)RPP1和ROQ1 NB-ARC的三維結(jié)構(gòu)特征均與激活態(tài)ZAR1相似,唯一不同的是RPP1激活態(tài)時(shí)的NB-ARC結(jié)合的是ADP,而不是ATP。

圖2 植物NLR免疫受體NB-ARC結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)特征Fig.2 Structural features of NB-ARC domain of plant NLR immune receptor

1.3 非典型結(jié)構(gòu)域

除了具有非常保守的典型結(jié)構(gòu)域,有些NLR免疫受體蛋白上還包含額外的非典型結(jié)構(gòu)域。這些非典型結(jié)構(gòu)域整合在受體蛋白N末端、C末端或者嵌入到典型結(jié)構(gòu)域之間的位置,在植物免疫過程發(fā)揮重要作用[51]。多項(xiàng)研究表明,非典型結(jié)構(gòu)域主要功能之一是參與免疫受體對病原生物效應(yīng)蛋白的識別過程[52-53]。目前有三維結(jié)構(gòu)信息報(bào)道的非典型結(jié)構(gòu)域有重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域[32-35,38-39,54](heavy metal-associated domain,HMA)、WRKY結(jié)構(gòu)域(WRKY protein domain)[36-37],以及茄科抗病基因特有SD(Solanaceaedomain)結(jié)構(gòu)域[55],其中以HMA結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究最為深入。HMA結(jié)構(gòu)域又被稱作RATX1結(jié)構(gòu)域(related to yeast copper transporter ATX1,RATX1),水稻NLR免疫受體RGA5、Pik系列等位基因中均含有HMA結(jié)構(gòu)域。RGA5中的HMA融合在其C末端[56],Pik中的HMA則嵌合在其CC和NB-ARC典型結(jié)構(gòu)域之間[32]。目前認(rèn)為HMA結(jié)構(gòu)域作為一個(gè)整合型誘餌蛋白發(fā)揮監(jiān)測識別稻瘟病菌效應(yīng)蛋白的作用,可能是由于水稻中存在一個(gè)含有HMA結(jié)構(gòu)域的隱性抗病基因Pi21,Pi21功能缺陷的水稻更有利于稻瘟病菌的侵染[5,12]。RGA5能夠識別稻瘟病菌效應(yīng)蛋白AVR-Pia和AVR1-CO39,激活RGA4介導(dǎo)的免疫反應(yīng);Pik能夠識別稻瘟病菌效應(yīng)蛋白AVR-PikA、AVR-PikD以及AVR-PikE,目前還沒有Pik類免疫受體能夠識別AVR-PikC[35]。

Pik多個(gè)HMA結(jié)構(gòu)域及其與稻瘟病菌效應(yīng)蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)展示了各自的結(jié)構(gòu)特征以及互作界面,所有HMA結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)表征為由4股反平行β片和2股α螺旋組成的α/β三明治,AVR-Pik、AVR-Pia以及AVR1-CO39等效應(yīng)蛋白都包含一個(gè)由6股β片構(gòu)成的三明治保守結(jié)構(gòu),破壞HMA和效應(yīng)蛋白的互作均會干擾全長免疫受體蛋白對病原生物正常的識別過程,阻斷免疫反應(yīng)的激活。HMA跟不同效應(yīng)蛋白的互作界面存在差異,如AVR1-CO39和AVR-PikD與HMA互作的界面處于HMA上2個(gè)完全相反的側(cè)面[38]。最近的研究發(fā)現(xiàn),Pikp在一定程度上也能識別“錯(cuò)配的”AVR-Pia(AVR-Pia原本被RGA5識別),并在本氏煙草上誘導(dǎo)微弱的細(xì)胞壞死反應(yīng)。對比Pikp HMA/AVR-PikD和Pikp HMA/AVR-Pia復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)AVR-PikD和AVR-Pia也結(jié)合在HMA不同的空間位置[35]。這些關(guān)于HMA結(jié)構(gòu)域及其與效應(yīng)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,揭示了結(jié)構(gòu)相似的HMA結(jié)構(gòu)域如何特異性識別序列差異明顯但結(jié)構(gòu)相似的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外,多項(xiàng)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)表明,在缺乏病原生物效應(yīng)蛋白的情況下,HMA結(jié)構(gòu)域以二體形式存在[32,38]。有些效應(yīng)蛋白如AVR1-CO39存在時(shí),HMA無法形成二體[38]。分析結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),AVR1-CO39與HMA的互作界面和HMA二體形成界面存在明顯重疊,這一競爭關(guān)系可能是干擾HMA二體形成的原因。但是這一現(xiàn)象的生物學(xué)意義尚不清楚,仍需進(jìn)一步研究。

2 植物“抗病小體”的發(fā)現(xiàn)

2.1 ZAR1抗病小體

NLR免疫受體完整蛋白的三維結(jié)構(gòu)解析一直是免疫學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)課題。2013年,清華大學(xué)柴繼杰教授研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了第一個(gè)近乎全長的小鼠NLR免疫受體蛋白——NLRC4自抑制狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu),揭示了NLRC4蛋白通過各個(gè)結(jié)構(gòu)域分子間相互作用維持自抑制狀態(tài)的分子機(jī)制[57]。隨后,柴繼杰教授課題組和隋森芳院士課題組進(jìn)一步合作解析了NAIP-NLRC4復(fù)合物炎癥小體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu),揭示了NLR免疫受體NAIP識別病原生物效應(yīng)蛋白后如何激活處于自抑制狀態(tài)的NLRC4,以及NLRC4進(jìn)一步發(fā)生自身多聚化形成包含1個(gè)NAIP和10個(gè)NLRC4盤狀結(jié)構(gòu)的過程[58]。植物NLR免疫受體激活是否也形成類似動(dòng)物NLR炎癥小體的結(jié)構(gòu)?2019年,清華大學(xué)柴繼杰教授課題組、王宏偉教授課題組聯(lián)合中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所周儉民研究員課題組,率先解析了第一個(gè)植物完整NLR免疫受體ZAR1激活前、后的結(jié)構(gòu),填補(bǔ)了植物NLR免疫受體全長蛋白結(jié)構(gòu)的空白[15-16,59-60]。

如圖3所示,ZAR1與受體樣胞質(zhì)激酶(receptor-like cytoplasmic kinase,RLCK)家族成員RKS1形成復(fù)合物,并結(jié)合ADP,以單體的形式處于失活態(tài);當(dāng)病原細(xì)菌效應(yīng)蛋白對PBL2激酶進(jìn)行尿苷酸修飾形成PBL2UMP后,PBL2UMP上的UMP基團(tuán)會與ZAR1-RKS1復(fù)合體中的RKS1發(fā)生相互作用,并導(dǎo)致ZAR1 的NB結(jié)構(gòu)域向外發(fā)生約60°的旋轉(zhuǎn)。ZAR1-RKS1-PBL2UMP中間態(tài)有利于ADP的釋放以及后續(xù)dATP/ATP的結(jié)合;當(dāng)ZAR1-RKS1-PBL2UMP復(fù)合物中加入dATP/ATP后,ZAR1-RKS1-PBL2UMP復(fù)合物發(fā)生顯著的構(gòu)象變化,由中間態(tài)轉(zhuǎn)換為激活態(tài):CC結(jié)構(gòu)域第1個(gè)螺旋α1單獨(dú)暴露出來,NB、ARC1、ARC2以及LRR結(jié)構(gòu)域都向有利于發(fā)生寡聚化的構(gòu)象發(fā)生變化。完全激活的ZAR1通過各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用,最終形成輪狀結(jié)構(gòu)的ZAR1五聚體,并結(jié)合dATP/ATP。RKS1和PBL2UMP并不直接參與ZAR1五聚體的形成。激活態(tài)ZAR1五聚輪狀結(jié)構(gòu)雖然與NLRC4炎癥小體有較大差異,但是仍具有激活后形成寡聚化復(fù)合體的共同特征,被命名為“抗病小體(resistosome)”。5個(gè)ZAR1單體CC結(jié)構(gòu)域的第1個(gè)螺旋α1組成了一個(gè)突出的漏斗狀結(jié)構(gòu)。生化與功能試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,這一結(jié)構(gòu)與抗病小體是否定位于質(zhì)膜以及是否誘導(dǎo)細(xì)胞死亡密切相關(guān),暗示ZAR1抗病小體可能在質(zhì)膜上穿孔并形成離子通道。2021年,周儉民研究員及其合作者發(fā)現(xiàn)ZAR1抗病小體在體外試驗(yàn)中能夠直接插入脂膜,發(fā)揮Ca2+離子通道作用,并通過單分子成像技術(shù)證實(shí)ZAR1在質(zhì)膜上組裝成五聚體復(fù)合物[61]。Jacob等[41]也發(fā)現(xiàn)另一類位于TNL免疫受體下游的植物免疫受體——輔助NLR蛋白NRG1和ADR1,可以作為一個(gè)鈣離子通透性的陽離子通道發(fā)揮作用。

圖3 植物ZAR1抗病小體的形成Fig.3 The formation of ZAR1 resistosome

2.2 RPP1 和ROQ1抗病小體

作為植物NLR免疫受體蛋白的另一大類型,TNL免疫受體N端TIR結(jié)構(gòu)域具有NAD+水解酶活性(NADase),TNL全長蛋白激活后是否也形成類似CNL的抗病小體成為亟待回答的問題。2020年12月,Science雜志同期發(fā)表了2篇報(bào)道植物TNL識別病原生物效應(yīng)蛋白后形成抗病小體的研究論文:柴繼杰教授團(tuán)隊(duì)成功解析了RPP1結(jié)合卵菌效應(yīng)蛋白ATR1后形成四聚體激活狀態(tài)的三維冷凍電鏡結(jié)構(gòu)(圖4-A),并與德國馬克斯-普朗克植物育種研究所的2位合作者一起利用生物化學(xué)和遺傳學(xué)手段,揭示了RPP1抗病小體具有NAD酶全酶活性及其進(jìn)一步激活下游免疫信號的分子機(jī)制[26];美國加州大學(xué)伯克利分校Brian J. Staskawicz教授和Eva Nogales教授團(tuán)隊(duì)則解析了另外一種TNL類免疫受體ROQ1識別黃單胞細(xì)菌效應(yīng)蛋白XopQ后形成四聚化抗病小體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[27](圖4-B)。RPP1和ROQ1 LRR結(jié)構(gòu)域的C端都包含一個(gè)新的額外結(jié)構(gòu)域,這一結(jié)構(gòu)與專門結(jié)合抗原的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)類似,故被命名為C-JID結(jié)構(gòu)域(C-terminal jell roll and Ig-like domain)。序列分析發(fā)現(xiàn),幾乎所有TNL免疫受體蛋白C末端都含有C-JID結(jié)構(gòu)域,暗示其可能是一個(gè)具有廣譜功能的保守結(jié)構(gòu)域。C-JID與LRR結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)了對病原生物效應(yīng)蛋白的直接互作過程(圖4)。與ZAR1抗病小體由CC結(jié)構(gòu)域形成一層突出的漏斗狀結(jié)構(gòu)(圖3)不同,2個(gè)TNL抗病小體形成了3層環(huán)狀結(jié)構(gòu),分別是由TIR結(jié)構(gòu)域組成的頂部環(huán)形結(jié)構(gòu),由 NB-ARC結(jié)構(gòu)域組成的中間環(huán)形結(jié)構(gòu),以及由LRR-C-JID及病原生物效應(yīng)蛋白組成的底部環(huán)形結(jié)構(gòu)。

圖4 植物RPP1(A)和ROQ1(B)抗病小體的結(jié)構(gòu)特征Fig.4 Structural characteristics of RPP1(A)and ROQ1(B)resistosome

在RPP1抗病小體中(圖4-A),2個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域通過頭尾互作形成二聚體,2個(gè)TIR二聚體進(jìn)一步通過C2對稱形成四聚體。2個(gè)ATP分子結(jié)合在2個(gè)TIR二聚體的頭尾互作界面,該結(jié)合位置與TIR NAD酶水解底物NADP+的結(jié)合位點(diǎn)重疊。TIR二聚體的形成穩(wěn)定了兩者頭尾互作界面處其中一個(gè)TIR的BB環(huán)構(gòu)象,該環(huán)上的一些關(guān)鍵氨基酸對于維持RPP1 的NAD酶活性非常重要。此外,單獨(dú)的RPP1蛋白幾乎沒有NAD酶活性,只有RPP1和ATR1形成的四聚抗病小體才表現(xiàn)出依賴于金屬離子的NAD酶活性[26]。這些發(fā)現(xiàn)表明,RPP1識別ATR1激活后形成了四聚化的抗病小體,其中2個(gè)頭對尾的二聚體TIR形成了完整的NAD酶活性中心,促使RPP1抗病小體作為一個(gè)NAD酶全酶催化NAD+水解。ROQ1具有與RPP1抗病小體類似的結(jié)構(gòu)特征(圖4-B),較為明顯的區(qū)別在于兩者NB-ARC結(jié)構(gòu)域結(jié)合ADP/ATP的狀態(tài):ROQ1激活態(tài)結(jié)合著ATP,而RPP1激活態(tài)結(jié)合著ADP。分析蛋白序列與結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),ROQ1和ZAR1都具有結(jié)合ATP分子的保守“TTR”基序,而RPP1上該基序突變?yōu)椤癟TE”,導(dǎo)致其喪失結(jié)合ATP的活性。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為NLR激活態(tài)時(shí)結(jié)合ATP分子,尚不清楚這一特殊現(xiàn)象的生物學(xué)意義。

3 基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的植物NLR免疫受體設(shè)計(jì)與改造

相對于病原生物的龐大數(shù)目,植物中NLR蛋白的數(shù)量非常有限[12]。近年來,科學(xué)家們開始嘗試對NLR免疫受體進(jìn)行人工設(shè)計(jì)以擴(kuò)大或改良其識別病原物特異性,并取得了顯著成效。主要策略是通過在免疫受體上隨機(jī)引入氨基酸突變位點(diǎn),進(jìn)而直接對免疫受體進(jìn)行分子設(shè)計(jì)以增強(qiáng)或者擴(kuò)寬其識別病原生物的特異性。運(yùn)用這一策略已獲得較多成功的示例,如在馬鈴薯免疫受體Rx的LRR功能域進(jìn)行突變不僅可以增強(qiáng)其識別病原物特異性,同時(shí)在其NB功能域進(jìn)行突變可以增強(qiáng)其激活敏感性[62-63];番茄免疫受體蛋白Sw-5b經(jīng)過人工隨機(jī)突變篩選,獲得了對番茄斑萎病毒野生型及其田間抗性突破變異株系的抗病性[64]。由于隨機(jī)突變產(chǎn)生的突變體數(shù)量龐大,前期篩選以及功能鑒定任務(wù)較為繁重。植物NLR免疫受體識別病原生物效應(yīng)蛋白分子的新理論機(jī)制,為優(yōu)質(zhì)抗病資源的分子設(shè)計(jì)和改造提供了新的思路和方向。目前一種新的有益嘗試是對植物體內(nèi)的誘餌蛋白進(jìn)行人工改造,使NLR能夠識別其他病原生物的效應(yīng)蛋白,丁香假單胞菌效應(yīng)蛋白AvrPphB具有蛋白酶活性,能夠切割擬南芥中被免疫受體RPS5監(jiān)測的誘餌蛋白PBS1,RPS5一旦感知到PBS1被切割,就會啟動(dòng)植物的先天免疫系統(tǒng)來抵抗病原物侵染。研究人員將PBS1蛋白的切割位點(diǎn)替換成能夠被蕪菁花葉病毒NIa蛋白酶切割的識別位點(diǎn),成功賦予了RPS5對植物病毒的新抗性[65]。

植物NLR免疫受體與病原生物效應(yīng)蛋白復(fù)合物高分辨率三維結(jié)構(gòu)的解析為科研人員開展NLR的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)和改造提供了可能。水稻Pikm能夠識別稻瘟病菌效應(yīng)蛋白AVR-PikA、AVR-PikD和AVR-PikE,但是Pikp只能識別AVR-PikD,而不能識別AVR-PikA和AVR-PikE。英國結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Mark J. Banfield教授的研究小組解析了多個(gè)Pik HMA結(jié)構(gòu)域與AVR-Pik的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),包括Pikp HMA&AVR-PikD、Pikp HMA&AVR-PikE、Pikm HMA&AVR-PikA、Pikm HMA&AVR-PikD、Pikm HMA&AVR-PikE[32-35]。系統(tǒng)比較分析這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)中HMA和效應(yīng)蛋白互作界面的關(guān)鍵氨基酸殘基,研究人員將Pikp HMA第261位天門冬酰胺(N)和第262位賴氨酸(K)分別突變成賴氨酸(K)和谷氨酸(E),產(chǎn)生了PikpNK-KE突變體。PikpNK-KE不僅保留了對AVR-PikD的識別能力,同時(shí)也能識別AVR-PikA和AVR-PikE并觸發(fā)細(xì)胞死亡反應(yīng)[34]。采用類似的設(shè)計(jì)思路,研究人員通過對關(guān)鍵氨基酸的精準(zhǔn)突變,相繼獲得了多個(gè)水稻RGA5HMA突變體,不僅能夠識別AVR-Pia和AVR1-CO39,也能夠識別AVR-PikD、AVR-Pib等新的稻瘟病菌效應(yīng)蛋白[39,54]。由此說明,基于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對直接整合到免疫受體上的誘餌蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人工分子設(shè)計(jì)可能具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 展望

近年來,“植物NLR免疫受體及其介導(dǎo)的抗病機(jī)制”已成為農(nóng)業(yè)科學(xué)和植物學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。植物抗病小體的發(fā)現(xiàn)是植物免疫研究領(lǐng)域25年來里程碑式的進(jìn)展,引領(lǐng)了領(lǐng)域的發(fā)展方向。全長NLR蛋白的結(jié)構(gòu)解析雖然已取得突破,但是其他NLR蛋白的完整結(jié)構(gòu)解析仍然存在挑戰(zhàn)。柴繼杰教授課題組花費(fèi)了將近10年的時(shí)間才從數(shù)量眾多的植物NLR蛋白中篩選到了理想的研究對象——ZAR1,全長NLR蛋白的大量表達(dá)和純化并非易事。直接利用植物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)具生物學(xué)功能的NLR全長蛋白及其與病原生物效應(yīng)蛋白復(fù)合物可能是一種可行的策略。

目前,植物NLR蛋白經(jīng)典保守結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)特征基本明確,但是非典型結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)解析數(shù)量仍然有限。相對于經(jīng)典結(jié)構(gòu)域而言,結(jié)構(gòu)生物學(xué)家未來可能會更多關(guān)注非典型結(jié)構(gòu)域及其與病原生物效應(yīng)蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析,兩者互作界面的直觀展示可以為免疫受體的精準(zhǔn)改造和人工設(shè)計(jì)提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。除了目前已知的識別功能,非典型結(jié)構(gòu)域是否還具有其他功能?三維結(jié)構(gòu)的解析可為進(jìn)一步揭示非典型結(jié)構(gòu)域的新功能與新特性提供有價(jià)值的線索。

此外,當(dāng)前關(guān)于植物NLR抗病小體的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究仍然存在的不少問題值得進(jìn)一步研究。部分NLR用于直接監(jiān)測病原生物效應(yīng)蛋白,被稱為sNLR(sensor NLR),需要下游輔助hNLR(helper NLR)才能激活ETI。這類通過sNLR-hNLR工作模式的NLR是否會形成類似NAIP-NLRC4炎癥小體的sNLR-hNLR復(fù)合物抗病小體?對于TNL來說,下游還依賴于EDS1/PAD4和EDS1/SAG101發(fā)揮作用,sNLR-EDS1-hNLR三者是否形成復(fù)合物?RGA5/RGA4這類成對發(fā)揮功能的NLR激活時(shí)是否形成抗病小體?結(jié)構(gòu)生物學(xué)將是未來回答這些問題最重要的手段之一。